miR-129-5p通過BDNF調(diào)控多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖及分泌的機(jī)制

劉小敏，張肄鵬，王素云，宋錦旗

(深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,深圳 518110)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是最常見的血液腫瘤之一,由漿細(xì)胞的異常增殖引起[1]。發(fā)病機(jī)制涉及染色體易位,細(xì)胞因子失調(diào),骨髓微環(huán)境變化等[2],惡化的MM往往伴隨著炎性因子(如IL-6、TNF-α、IL-1β等)及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)分泌的增加[3]。盡管近年來對(duì)MM的診斷和治療水平已大大提高,但MM患者的預(yù)后仍然不理想[4]。因此,我們急需發(fā)現(xiàn)并確定一些新的、確切的、可用于靶向治療的指標(biāo)來預(yù)測(cè)MM的預(yù)后。

miRNA通過抑制靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄或降解mRNA參與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展而發(fā)揮作用[5]。根據(jù)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),miR-129-5p是一種與癌癥相關(guān)的miRNA,在許多其他類型的癌癥中低表達(dá),例如直腸腺癌[6]、胃癌[7]、乳腺癌[8]、大腸癌[9]、肝癌[10]以及前列腺癌[11]。miR-129的低表達(dá)與腫瘤的分期和進(jìn)展密切相關(guān)[12]。并且miR-129的抑制作用也可能促進(jìn)腫瘤形成,例如,已有研究證明miR-129的減少可能會(huì)促進(jìn)人肺癌細(xì)胞的增殖[13]。但是目前關(guān)于miR-129-5p在MM中的研究并不多見,因此,我們?cè)诒疚闹兄饕蚼iR-129可能在MM發(fā)生中的影響進(jìn)行探討。

前人研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)MM患者中分離出的惡性漿細(xì)胞能高度表達(dá)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF),而BDNF被認(rèn)為是一種MM源性因子,能促進(jìn)骨髓瘤患者的骨溶解性破壞,并且能促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活[14,15]。BDNF除了具有神經(jīng)生成作用外,還是血管生成的介質(zhì),可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活,誘導(dǎo)缺血組織中的新血管生成[16-18]。最近,有研究發(fā)現(xiàn)BDNF作為一種潛在的血管生成刺激因子,促進(jìn)了MM腫瘤的進(jìn)展,在此過程中可選擇性激活特異性受體以及其下游信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),并促進(jìn)VEGF的釋放[19]。然而,尚未有研究發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中BDNF可能受miR-129-5p調(diào)控。本項(xiàng)研究不僅報(bào)道了miR-129-5p在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)、臨床意義和體外功能,還證明BDNF是MM細(xì)胞中miR-129-5p的下游靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年6月至2019年6月在我院血液腫瘤科確診并進(jìn)行治療的多發(fā)性骨髓瘤(MM)患者骨髓組織56例,其中男性31例,女性25例。納入和排除標(biāo)準(zhǔn):①納入對(duì)象骨髓組織均經(jīng)我院確診為MM骨髓組織,臨床診斷均按照世界衛(wèi)生組織MM標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷;②排除感染性疾病及其他血液系統(tǒng)疾病史;③排除合并其他原發(fā)惡性腫瘤;④排除有骨髓穿刺禁忌者以及孕婦。另收集同時(shí)期于我院進(jìn)行骨髓穿刺并最后明確骨髓功能無異常的健康者骨髓組織56例作為正常對(duì)照。本研究獲我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),且患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器

RPMI8226細(xì)胞系(ATCC),CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Electron公司,美國(guó)),lipofectamine 2000試劑盒(Invitrogen,美國(guó)),轉(zhuǎn)染序列(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司),MTT溶液(ApexBio,美國(guó)),酶標(biāo)檢測(cè)儀(BIO-TEK,美國(guó)),結(jié)晶紫染色劑(江蘇碧云天公司),流式細(xì)胞儀(BD公司,美國(guó)),ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所),Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen,美國(guó)),PCR引物(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京紐樸生物技術(shù)有限公司),ABI StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(北京安麥格貿(mào)易有限公司),Uni-miR qPCR primer(TaKaRa,日本),BCA試劑盒(武漢博士德公司),聚丙烯酰胺凝膠(武漢博士德公司),一抗BDNF、VEGF、GAPDH(Abcam,英國(guó)),辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(Jackson Immuno Research,美國(guó)),熒光素酶檢測(cè)試劑盒(BioVision,美國(guó)),Glomax20/20 luminometer熒光檢測(cè)儀(Promega,美國(guó))。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

RPMI8226細(xì)胞系培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,并置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)80%左右時(shí),用lipofectamine 2000試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染:用250 μl不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋mimic-NC(miR-129-5p模擬物陰性對(duì)照)和miR-129-5p mimic(miR-129-5p模擬物),輕輕混勻后室溫孵育5 min;另取250 μl不含血清DMEM培養(yǎng)基稀釋5 μl lipofectamin 2000,輕輕混勻并室溫孵育5 min;將以上兩者混勻,室溫孵育20 min加入至細(xì)胞培養(yǎng)孔中。培養(yǎng)6 h后棄去孔內(nèi)含轉(zhuǎn)染液的培養(yǎng)基,更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將RPMI8226細(xì)胞分為空白組(無任何處理)、mimic-NC組和miR-129-5p mimic組。

1.4 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組RPMI8226細(xì)胞以1×105/ml的密度按每孔1 ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,孵育24,48,72 h時(shí),更換200 μl 10% FBS的DMEM,加入20 μl四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)溶液(5 mg/ml),37 ℃繼續(xù)孵育4 h,棄去上清液,每孔加入150 μl的DMSO,搖床低速振蕩10 min,用酶標(biāo)檢測(cè)儀于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度OD值,記錄結(jié)果。

1.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組RPMI8226細(xì)胞以每皿500個(gè)的密度分別接種6孔板中,細(xì)胞輕輕混勻后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d,當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)終止培養(yǎng),棄去上清液,用PBS浸洗2次后加入5 ml的4%多聚甲醛固定15 min,去固定液,加適量結(jié)晶紫染液染色10 min,自來水洗去染色液,自然干燥后拍照。顯微鏡下計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡

收集各組RPMI8226細(xì)胞,PBS沖洗細(xì)胞后用預(yù)冷的75%乙醇重懸細(xì)胞,在-20 ℃下固定過夜,離心棄去上清液,PBS沖洗細(xì)胞,取450 μl PBS重懸的細(xì)胞,加入100 μl的Rnase A于37 ℃水浴30 min,再加入400 μl的碘化丙錠(PI)染色混勻,4 ℃避光染色30 min后用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞周期分布并分析。

收集各組RPMI8226細(xì)胞,PBS溶液洗滌后分別加入預(yù)冷的100 μl 1×binding buffer重懸細(xì)胞,并依次加入5 μl膜聯(lián)蛋白與5 μl PI,混勻后室溫避光15 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):以膜聯(lián)蛋白Ⅴ為橫軸,PI為縱軸;左上象限為機(jī)械性損傷細(xì)胞;右上象限為晚期凋亡細(xì)胞或者壞死細(xì)胞;左下象限為陰性正常細(xì)胞;右下象限為早期凋亡細(xì)胞。

1.7 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)相關(guān)因子

取各組對(duì)數(shù)期RPMI8226細(xì)胞以1×106/ml接種于6孔板,分別提取上清液以雙抗夾心法試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β及VEGF的水平。

1.8 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-129-5p及BDNF表達(dá)

采用Trizol試劑盒法對(duì)組織與RPMI8226細(xì)胞總RNA進(jìn)行提取,并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀行PCR實(shí)驗(yàn),miR-129-5p以U6作為內(nèi)參,BDNF以GAPDH作為內(nèi)參,引物序列見表1。反應(yīng)體系為20 μl,包括10 μl 2×SYBR Mix,10×cDNA模板1 μl,上下游引物各1 μl,H2O 8 μl,每個(gè)樣品為3個(gè)重復(fù),PCR擴(kuò)增條件為:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán),72 ℃再延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。手動(dòng)將閾值選定在各對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線平行上升的最低點(diǎn),獲得各反應(yīng)管的Ct值(threshold cycle),數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法[20]進(jìn)行基因相對(duì)定量表達(dá)分析。

表1 Q-PCR引物序列

1.9 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)BDNF及VEGF表達(dá)

提取組織與RPMI8226細(xì)胞總蛋白,按BCA試劑盒說明書測(cè)定蛋白濃度,將提取的蛋白加入上樣緩沖液后在95 ℃煮10 min,每孔上樣30 μg,10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,電泳電壓 80 V轉(zhuǎn)100 V,濕轉(zhuǎn),轉(zhuǎn)膜電壓100 mV時(shí)間約60 min,PVDF轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,后加入一抗BDNF(1 ∶1 000)、VEGF(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶2 000)4 ℃孵育過夜,經(jīng)過清洗后置于辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)室溫孵育1 h,使用Odyssey雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)獲得圖片,運(yùn)用Quantity One圖像分析軟件測(cè)得條帶灰度值,將各目的條帶與內(nèi)參條帶比值后,比較各組間差異。

1.10 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-129-5p和BDNF的靶向關(guān)系

采用生物信息學(xué)網(wǎng)站件http://www.microrna.org/microrna/home.do預(yù)測(cè)miR-129-5p和BDNF的靶向關(guān)系及miR-129-5p與BDNF 3′UTR的結(jié)合位點(diǎn)。合成含miR-129-5p結(jié)合位點(diǎn)BDNF 3′UTR啟動(dòng)子區(qū)序列,構(gòu)建BDNF 3′UTR野生型(WT)質(zhì)粒(BDNF-WT)與BDNF 3′UTR突變型質(zhì)粒(BDNF-MUT)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期正常培養(yǎng)的RPMI8226細(xì)胞,經(jīng)消化、接種、培養(yǎng)后將BDNF-WT或BDNF-MUT與mimic-NC或miR-129-5p mimic共轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞,使用熒光素酶檢測(cè)試劑盒與Glomax20/20 luminometer熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光素酶活性并計(jì)算每個(gè)樣本的相對(duì)活性值,分析數(shù)據(jù)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0(SPSS,Inc,Chicago,IL,USA)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,服從正態(tài)分布的計(jì)量資料兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組之間的比較采用One-Way ANOVA單因素方差分析,ANOVA分析后的兩兩比較采用圖基多重比較檢驗(yàn)(Tukey’s multiple comparisons test)。通過卡方檢驗(yàn)確定miR-129-5p的表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤臨床病理特征的關(guān)系。Pearson分析miR-129-5p與BDNF的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多發(fā)性骨髓瘤中miR-129-5p與BDNF的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)

采用RT-qPCR及Western blot法檢測(cè)miR-129-5p及BDNF在MM患者及健康者骨髓組織中的表達(dá)情況,結(jié)果表明:MM患者骨髓組織中miR-129-5p表達(dá)水平低于健康者,而BDNF的mRNA與蛋白水平都高于健康者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01,見圖1)。

通過Pearson檢驗(yàn)分析MM患者骨髓組織miR-129-5p與BDNF的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)miR-129-5p與BDNF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.601,P<0.001,見圖1)。

與健康者比較,**P<0.01圖1 多發(fā)性骨髓瘤中miR-129-5p與BDNF的表達(dá)水平及相關(guān)性分析Figure 1 Correlation analysis of miR-129-5p and BDNF expression level in MM

2.2 過表達(dá)miR-129-5p能夠顯著抑制RPMI8226細(xì)胞增殖

采用RT-qPCR法檢測(cè)過表達(dá)miR-129-5p后RPMI8226細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,發(fā)現(xiàn)與mimic-NC組相比,miR-129-5p mimic組miR-129-5p表達(dá)水平顯著上升(P<0.01,見圖2),說明過表達(dá)miR-129-5p的RPMI8226細(xì)胞系建立成功。

MTT法和平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-129-5p后RPMI8226細(xì)胞增殖水平與克隆形成能力都下降(均P<0.01,見圖2),說明過表達(dá)miR-129-5p能抑制RPMI8226細(xì)胞增殖。

2.3 過表達(dá)miR-129-5p阻滯RPMI8226細(xì)胞周期進(jìn)程并促進(jìn)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組RPMI8226細(xì)胞的周期進(jìn)程與凋亡率,結(jié)果表明:與mimic NC相比,過表達(dá)miR-129-5p導(dǎo)致RPMI8226細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例上升,S期與G2/M期細(xì)胞比例下降(均P<0.05),凋亡率上升(P<0.01,見圖3),說明過表達(dá)miR-129-5p能阻滯RPMI8226細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

與mimic-NC組比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 過表達(dá)miR-129-5p抑制RPMI8226細(xì)胞增殖Figure 2 The miR-129-5p overexpression suppresses RPMI8226 cell proliferation

與mimic-NC組比較,*P<0.05,**P<0.01圖3 過表達(dá)miR-129-5p阻滯RPMI8226細(xì)胞周期進(jìn)程并促進(jìn)細(xì)胞凋亡Figure 3 The miR-129-5p overexpression blocks cell cycle and promotes cell apoptosis

2.4 過表達(dá)miR-129-5p抑制RPMI8226細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α、IL-1β

ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組RPMI8226細(xì)胞上清液IL-6、TNF-α、IL-1β含量,研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):相對(duì)于mimic-NC,過表達(dá)miR-129-5p導(dǎo)致RPMI8226細(xì)胞中IL-6、TNF-α、IL-1β含量下降(均P<0.05,見表2),說明過表達(dá)miR-129-5p能抑制RPMI8226細(xì)胞分泌炎性因子。

表2 過表達(dá)miR-129-5p抑制RPMI8226細(xì)胞分泌

2.5 過表達(dá)miR-129-5p抑制RPMI8226細(xì)胞分泌VEGF

ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組RPMI8226細(xì)胞上清液VEGF含量,Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)與mimic-NC組相比,miR-129-5p mimic組上清液VEGF含量及細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)水平都下降(均P<0.05,見圖4),說明過表達(dá)miR-129-5p能抑制RPMI8226細(xì)胞表達(dá)VEGF。

與mimic-NC組比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 過表達(dá)miR-129-5p抑制RPMI8226細(xì)胞分泌VEGFFigure 4 The miR-129-5p overexpression inhibits the level of VEGF in RPMI8226 cells

2.6 miR-129-5p靶向負(fù)調(diào)控BDNF

采用RT-qPCR及Western blot法檢測(cè)過表達(dá)miR-129-5p后RPMI8226細(xì)胞中BDNF表達(dá)情況,結(jié)果表明:過表達(dá)miR-129-5p能下調(diào)BDNF的mRNA與蛋白水平(均P<0.01,見圖5)。初步證明miR-129-5p能負(fù)調(diào)控BDNF。

生物學(xué)網(wǎng)站顯示miR-129-5p與BDNF存在結(jié)合位點(diǎn)(見圖5)。而通過雙熒光素酶切報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-129-5p mimic+BDNF-WT組的熒光素酶信號(hào)與mimic-NC+BDNF-WT組相比顯著下降(P<0.01),miR-129-5p mimic+BDNF-MUT組與mimic-NC+BDNF-MUT組的的熒光素酶信號(hào)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05,見圖5),證明miR-129-5p能靶向性調(diào)控BDNF。

3 討論

近年來,MM患者的發(fā)病率和死亡率越來越高,但是當(dāng)前的治療策略不佳[21],因此,我們迫切需要探索一些新的參與了MM中腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的實(shí)用分子候選物。據(jù)報(bào)道,越來越多的miRNA通過參與細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等而成為MM進(jìn)展的調(diào)節(jié)因子[5]。例如,在MM中miR-20a[22],與miR-210[23]發(fā)生失調(diào)并充當(dāng)腫瘤抑制因子或啟動(dòng)子,能調(diào)節(jié)MM細(xì)胞的進(jìn)程和發(fā)育。但更引人注目的是,據(jù)報(bào)道,miR-129-5p可抑制多種癌癥進(jìn)展,其中包括直腸腺癌、胃癌、乳腺癌、大腸癌、肝癌以及前列腺癌[6-11]等。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)在MM骨髓組織中miR-129-5p表達(dá)下調(diào)。此外,體外研究表明miR-129-5p充當(dāng)MM細(xì)胞中細(xì)胞增殖與IL-6、TNF-α、IL-1β及VEGF分泌的抑制劑,細(xì)胞凋亡的促進(jìn)劑。這些發(fā)現(xiàn)表明,miR-129-5p是MM中的一種抗癌基因。

前人的研究已經(jīng)證實(shí),BDNF能促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活,并保護(hù)細(xì)胞免受化學(xué)療法的侵害[15,16]。并且已有研究發(fā)現(xiàn)MM患者中BDNF高表達(dá),BDNF能刺激MM患者血管的形成[19]。在本項(xiàng)研究中,我們用生物信息學(xué)工具(microRNA.org)以及熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)的數(shù)據(jù)證實(shí)miR-129-5p能夠結(jié)合BDNF的3′UTR,而且我們發(fā)現(xiàn),MM患者骨髓組織中miR-129-5p顯著低表達(dá),BDNF高表達(dá),Pearson相關(guān)系數(shù)分析也表明miR-129-5p與BDNF之間存在負(fù)相關(guān),miR-129-5p在MM細(xì)胞中對(duì)BDNF表達(dá)負(fù)調(diào)控。以上數(shù)據(jù)證明BDNF是MM中miR-129-5p的靶標(biāo),并且BDNF通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡而在MM中充當(dāng)癌基因,這與以前的研究一致[14]。因此,我們證實(shí)在MM中miR-129-5p的下調(diào)導(dǎo)致BDNF的上調(diào),從而促進(jìn)MM的發(fā)展與IL-6、TNF-α、IL-1β及VEGF的分泌。

與mimic-NC組比較,*P<0.05;與mimic-NC組比較,**P<0.01圖5 miR-129-5p靶向負(fù)調(diào)控BDNFFigure 5 BDNF is targeted and negatively regulated by miR-129-5p

總而言之,本研究報(bào)道了miR-129-5p在MM中下調(diào)及其臨床意義。miR-129-5p通過靶向抑制BDNF來抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)其凋亡,并抑制IL-6、TNF-α、IL-1β及VEGF的分泌,從而起到抑癌作用。這些發(fā)現(xiàn)表明,miR-129-5p可能是MM有價(jià)值的潛在的分子靶標(biāo)。