基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)的黃芪赤風(fēng)湯在化濕敗毒方治療新型冠狀病毒肺炎中的作用

崔連杰,李 科,秦雪梅,李震宇,杜昱光,王盛金

(1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006;2山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;3中國科學(xué)院過程工程研究所;4陵川縣農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)中心;*通訊作者,E-mail:like@sxu.edu.cn)

新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)目前在全球蔓延,我國疫情已基本穩(wěn)定,中醫(yī)藥在此次疫情防控表現(xiàn)出其特色優(yōu)勢,在參與全國救治確診病例中占比達91.5%,在湖北省確診病例中使用率和總有效率超過90%[1]。中醫(yī)藥通過臨床篩選出的“三藥三方”在針對新冠肺炎的不同癥狀治療中發(fā)揮了重要的作用,其中化濕敗毒方是由經(jīng)典名方麻杏石甘湯、宣白承氣湯、達原飲、藿香正氣散、桃仁承氣湯、葶藶大棗瀉肺湯、黃芪赤風(fēng)湯和玉屏風(fēng)散化裁而來,已有研究表明[2,3],化濕敗毒方主要是通過調(diào)控機體的免疫和炎癥相關(guān)通路來治療COVID-19,是多成分、多靶點、多途徑作用的結(jié)果。本文將著重對黃芪赤風(fēng)湯在該方中產(chǎn)生的作用進行研究,黃芪赤風(fēng)湯出自《醫(yī)林改錯》,由黃芪、赤芍、防風(fēng)三味藥組成,其中黃芪益氣扶正,赤芍行瘀,防風(fēng)解毒,黃芪赤風(fēng)湯具有補氣扶正、調(diào)理氣血功效,對提高人體免疫力起到重要作用。新冠肺炎治療過程中發(fā)現(xiàn)免疫力差的人更容易患病,病情也較重,免疫力強的人即使患病后也多為輕癥,因此自身免疫力和抵抗力的提高是防治新冠肺炎最重要的一環(huán),中醫(yī)理論稱之為“正氣存內(nèi),邪不可干”,以扶助人體正氣為主,可促進患者恢復(fù)。因此,本文將對黃芪赤風(fēng)湯發(fā)揮作用的活性成分和作用機制進行研究,闡明其在化濕敗毒方治療COVID-19中發(fā)揮的作用,豐富中醫(yī)藥治療COVID-19的理論依據(jù)。

中藥方劑具有多成分、多靶點、多通道、多環(huán)節(jié)的特點,具體活性成分和活性成分間的相互作用關(guān)系難以確定,而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)和高通量組織學(xué),可以將網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)與藥理學(xué)相結(jié)合,直接從大量數(shù)據(jù)中識別藥物和疾病靶標,并展現(xiàn)它們之間的相互關(guān)系和作用機制,因此網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成為研究中藥方劑物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制的有效手段[4]。分子對接技術(shù)作為一種輔助篩選手段,在中藥藥效物質(zhì)、尋找藥物作用靶點、探索中藥作用機制方面廣泛運用,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接技術(shù)應(yīng)用于中藥活性基礎(chǔ)研究具有顯著的優(yōu)勢[5]。因此本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對黃芪赤風(fēng)湯中核心活性成分及其作用靶標進行篩選,預(yù)測其治療COVID-19可能的生物途徑,并通過分子對接技術(shù)對方劑中主要成分與COVID-19疾病相關(guān)靶點進行分子對接,闡明黃芪赤風(fēng)湯藥效的作用機制。

1 方法

1.1 黃芪赤風(fēng)湯中活性成分篩選及作用靶點的收集

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/index.php),以“黃芪”“赤芍”“防風(fēng)”為關(guān)鍵詞搜索黃芪赤風(fēng)湯中的化合物成分?？诜锢枚?oral bioavailability,OB)是藥物通過口服方式進入體循環(huán)發(fā)揮藥效的重要指示參數(shù),類藥性(drug likeness,DL)是化合物表現(xiàn)出來的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征等與已知藥物的相似度。通常認為中藥中OB≥30%和DL≥0.18的化學(xué)成分為活性成分[6,7]。以O(shè)B≥30%和DL≥0.18篩選黃芪赤風(fēng)湯中活性成分,并通過在TCMSP數(shù)據(jù)庫收集所有活性成分作用靶點,在線數(shù)據(jù)庫Uniprot(https://www.uniprot.org/)收集活性成分作用靶點的對應(yīng)基因名,構(gòu)建藥物作用靶點庫。

1.2 中藥—活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將黃芪赤風(fēng)湯中收集整理好的中藥,活性成分,對應(yīng)靶點基因?qū)隒ytoscape 3.6.0軟件,構(gòu)建中藥—活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)。對三味中藥活性成分靶點取交集,得出黃芪赤風(fēng)湯體內(nèi)作用的重要靶點。

1.3 COVID-19疾病靶點篩選

通過在線GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/),以“novel coronavirus pneumonia”、“fatigue”、“dry cough”“fever”檢索與COVID-19疾病相關(guān)靶點基因,匯總后去重,其中基因打分值越高表明與疾病的相關(guān)性越強,篩選打分值靠前基因,構(gòu)建疾病靶點庫。

1.4 藥物作用靶點和疾病相關(guān)靶點交集

通過Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html),將黃芪赤風(fēng)湯作用靶點和COVID-19疾病靶點基因取交集,根據(jù)Venn圖得出黃芪赤風(fēng)湯產(chǎn)生藥效的所有作用靶點。

1.5 核心靶點篩選

將藥物作用靶點和疾病相關(guān)靶點的交集導(dǎo)入String在線數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/),構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò),代表靶點蛋白間的關(guān)聯(lián)度,PPI網(wǎng)絡(luò)信息導(dǎo)入Cytoscape3.6.0構(gòu)建可視化模型,根據(jù)靶點節(jié)點大小,連線數(shù)量與粗細,篩選出黃芪赤風(fēng)湯的核心作用靶點。

1.6 黃芪赤風(fēng)湯靶點通路分析

將黃芪赤風(fēng)湯中產(chǎn)生藥效的所有作用靶點基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)進行GO生物學(xué)過程富集分析和KEGG信號通路富集分析,基因名稱物種限定為人,篩選P值小于0.05,選取前20個條目可視化處理,分別繪制成柱狀圖和氣泡圖。

1.7 分子對接研究

選取中藥—活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)中拓撲值較高的前15個藥效成分,下載其sdf格式的結(jié)構(gòu)文件,從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載SARS-CoV-2 3CL水解酶(6LU7)和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ(ACE2)pdb格式文件,通過軟件SYBYL2.0,移除靶蛋白上水分子,提取配體,并進行殘基修飾、加氫、優(yōu)化蛋白等操作后,與黃芪赤風(fēng)湯中活性成分結(jié)構(gòu)進行分子對接,根據(jù)打分值進行評價。

2 結(jié)果

2.1 黃芪赤風(fēng)湯活性成分篩選結(jié)果

黃芪赤風(fēng)湯由黃芪、赤芍和防風(fēng)組成,經(jīng)TCMSP檢索到黃芪赤風(fēng)湯中的化合物共379個,其中黃芪甘,微溫,歸脾肺經(jīng),為補脾肺氣要藥,包含87個化學(xué)成分;赤芍苦,微寒,歸肝經(jīng),可治肺邪氣,包含119個化學(xué)成分;防風(fēng)甘辛,微溫,歸肝脾膀胱經(jīng),有祛風(fēng)解表功效,包含173個化學(xué)成分。經(jīng)OB≥30%和DL≥0.18篩選后,黃芪赤風(fēng)湯滿足條件的活性成分共49個(見表1),其中黃芪包含17個,赤芍包含14個,防風(fēng)包含18個。

表1 黃芪赤風(fēng)湯中活性成分的基本信息 (未完待續(xù))

續(xù)表1 黃芪赤風(fēng)湯中活性成分的基本信息

2.2 中藥—活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)篩選到的黃芪赤風(fēng)湯中活性成分,收集每個成分的作用靶點構(gòu)建中藥—化合物—靶點網(wǎng)絡(luò)(見圖1),其中包含3個中藥,49個化合物,232個靶點,網(wǎng)絡(luò)圖中自由度值排名前15的化合物分別是:槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、黃芩素、刺芒柄花素、異鼠李素、豆甾醇、3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、5-O-甲維阿斯米醇、常春藤皂苷元、黃芪紫檀烷、鞣花酸、毛蕊異黃酮、黃花菜木脂素A,它們可作用靶點數(shù)分別為145,59,44,42,36,35,32,28,23,23,22,22,21,19,18個;網(wǎng)絡(luò)圖中自由度值排名前15的靶點分別是:PTGS1、PTGS2、DPP4、AR、PRSSI、GABRA1、NOS2、ESR1、RXRA、SCN5A、CHRM1、ADRB2、PGR、HSP90AB1、PDE3A,分別有34,21,21,20,16,16,16,16,15,14,13,12,12,11,11個化合物共同作用于這些靶點。對黃芪、赤芍、防風(fēng)中活性成分作用靶點取交集,三味藥共同作用靶點有54個(見圖2)。這些自由度較高的成分與靶點以及三味藥共同作用靶點數(shù)說明黃芪赤風(fēng)湯可能通過多成分、多靶點間相互協(xié)同作用在治療新冠肺炎中起作用。

圖1 黃芪赤風(fēng)湯中藥—活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)Figure 1 Chinese medicine-compound-target network of Huangqi Chifeng decoction

圖2 黃芪赤風(fēng)湯中三味中藥共同作用靶點Veen圖Figure 2 Veen diagram of the targets of Chinese medicines in Huangqi Chifeng decoction

2.3 黃芪赤風(fēng)湯活性成分靶點與COVID-19疾病靶點的交集

黃芪赤風(fēng)湯232個活性成分靶點與COVID-19疾病1 158個相關(guān)的靶點取交集得到共同靶點105個(見圖3)。將共同靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫,得到PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),其中包含105個靶點蛋白,1 986條靶點蛋白間連線,平均度值為37.8,用Cytoscape3.6.0軟件將PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進一步可視化處理(見圖4),其中節(jié)點顏色越深、連線越多說明該節(jié)點對應(yīng)的靶點蛋白與其他蛋白關(guān)聯(lián)程度越高,該靶點蛋白越重要。其中自由度排名前20的靶點有:IL-6、TNF、VEGFA、AKT1、MMP-9、CASP3、TP53、CXCL8、CCL2、PTGS2、EGF、IL-1B、IL-10、FN1、MAPK1、MMP-2,IL-4、MYC、EGFR、ICAM-1,度值分別為64,64,62,61,56,55,55,55,54,54,53,53,53,53,51,51,49,49,48,47。藥物與疾病交集得到105個靶點均為黃芪赤風(fēng)湯藥效靶點,其中度值排名越靠前的靶點蛋白表明其越重要,可能是黃芪赤風(fēng)湯治療COVID-19疾病的核心靶點。

圖3 黃芪赤風(fēng)湯與COVID-19疾病相關(guān)靶點Veen圖Figure 3 Veen diagram of targets of Huangqi Chifeng decoction and COVID-19 disease

2.4 黃芪赤風(fēng)湯靶點通路分析

對黃芪赤風(fēng)湯中105個藥效靶點在DAVID數(shù)據(jù)庫中進行GO功能富集分析,按P≤0.05篩選得到GO條目共528條,生物過程(BP)有424條,細胞組成(CC)有43條,分子功能(MF)有61條,排名前20見圖5。KEGG通路富集分析得到105條信號通路(P≤0.05),其中肺結(jié)核(tuberculosis)、百日咳(pertussis)、乙型肝炎(hepatitis B)、甲型流感(influenza A)、小細胞肺癌(small cell lung cancer)、NOD樣受體信號通路(NOD-like receptor signaling pathway)和Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)等與肺部炎癥、肺部感染和肺損傷保護相關(guān),其中肺結(jié)核相關(guān)基因有IL-6、TNF、RAF1、STAT1、IL-10、TGFB1等;百日咳相關(guān)基因有IL-6、TNF、CXCL8、IL-10、MAPK1、FOS等;乙型肝炎相關(guān)基因有IL-6、TNF、MMP-9、TP53、CXCL8、RAF1等;甲型流感相關(guān)基因有ICAM-1、IL-6、TNF、CCL2、PRSS1、CXCL8等;小細胞肺癌相關(guān)基因有AKT1、CCND1、CASP9、PTGS2、BCL2、TP53等;NOD樣受體信號通路相關(guān)基因有MAPK1、IL-6、TNF、HSP90AA1、CCL2、MAPK14等;Toll樣受體相關(guān)基因有IL-6、TNF、CXCL8、NFKBIA、STAT1、CXCL10、AKT1、MAPK1、FOS、MAPK14、JUN、CASP8、IL-1B、MAPK8、LBP、CD14、SPP1等,排名前20見圖5。

圖4 黃芪赤風(fēng)湯與COVID-19疾病共同靶點的PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 4 The Protein-protein interaction network of the common targets of Huangqi Chifeng decoction and COVID-19 disease

2.5 活性成分與SARS-CoV-2 3CL水解酶和ACE2分子對接結(jié)果

SARS-CoV-2 3CL水解酶在病毒生命周期中發(fā)揮重要作用,COVID-19病毒以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2作為受體侵入細胞導(dǎo)致肺損傷,因此認為SARS-CoV-2 3CL水解酶和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ(ACE2)可作為治療COVID-19病毒的兩個有效靶點。分子對接是通過幾何匹配和能量匹配找到分子與靶點蛋白之間最佳匹配模式的過程,在SYBYL2.0軟件的Dock系統(tǒng)中,一般認為打分值越大,結(jié)合越穩(wěn)定,打分值>4.25說明分子與靶點有一定的結(jié)合活性,打分值>5.0說明結(jié)合活性較好,打分值>7.0說明有強烈的結(jié)合活性[8]。利用SYBYL2.0軟件對中藥—活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)中自由度較大的前15個化合物進行分子對接,模擬分子20種構(gòu)象與靶蛋白相互識別,找到最佳匹配模式并得出分值,黃芪赤風(fēng)湯中連接靶點較多的前15個化合物中,有5個與SARS-CoV-2 3CL水解酶有一定結(jié)合活性,分別為:3,9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、黃花菜木脂素A、豆甾醇、異鼠李素、毛蕊異黃酮(見表2);有8個與ACE2有一定結(jié)合活性,其中5個結(jié)合活性較好,分別為:槲皮素、異鼠李素、5-O-甲維阿斯米醇、常春藤皂苷元、黃花菜木脂素A、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、豆甾醇、毛蕊異黃酮(見表2)。根據(jù)分子對接打分值排名前五的化合物與靶點蛋白的結(jié)合模式(見圖6),表明這些化合物可以通過氫鍵與靶蛋白上一個或多個氨基酸結(jié)合發(fā)揮作用。

圖5 黃芪赤風(fēng)湯中藥效靶點GO富集分析和KEGG富集分析Figure 5 Analysis of GO enrichment and KEGG pathway enrichment of the key targets in Huangqi Chifeng decoction

表2 黃芪赤風(fēng)湯中15個化合物分子對接打分值

圖6 黃芪赤風(fēng)湯中活性成分與ACE2和SARS-CoV-2 3CL水解酶分子對接模型Figure 6 Molecular docking model of SARS-CoV-2 3CL hydrolase and ACE2 with active compounds in Huangqi Chifeng decoction

3 討論

COVID-19肺炎屬于中醫(yī)“疫”病范疇,病因為感受“疫戾”之氣,疫病專著《溫疫論》載“本氣充滿,邪不易入,本氣適逢虧欠,呼吸之間,外邪因而乘之”,即認為瘟疫中戾氣是疫病的外因,正氣虛弱是發(fā)病的內(nèi)因,中醫(yī)對疫病治療原則強調(diào)“扶正祛邪”[9],現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明COVID-19為病毒性肺炎,對人體的多個重要臟器和免疫系統(tǒng)都造成損害,愈后的關(guān)鍵因素取決于人的免疫力,這與中醫(yī)理論不謀而合。黃芪赤風(fēng)湯中黃芪益氣補虛,防風(fēng)祛風(fēng)壯氣,增強黃芪補氣之功效,赤芍涼血活血,與黃芪相配補氣行血[10],現(xiàn)代藥理研究表明黃芪能雙向調(diào)節(jié)免疫、抗氧化[11],赤芍能抗炎、抗氧化[12],防風(fēng)能抗炎、解熱[13]。因此推測黃芪赤風(fēng)湯在化濕敗毒方治療COVID-19病毒性肺炎過程中主要作用是提高機體免疫力,同時減輕炎癥損傷,促進機體恢復(fù)。

黃芪赤風(fēng)湯的活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)顯示PTGS1、PTGS2、DPP4、AR、PRSSI、GABRA1、NOS2、ESR1、RXRA、SCN5A具有較高度值,其中PTGS1和PTGS2主要參與炎癥反應(yīng),PTGS1通過參與合成前列腺素(PG),調(diào)節(jié)腎臟,胃腸和血小板功能,PTGS2可被生長因子、炎性細胞因子和腫瘤啟動子迅速誘導(dǎo),合成細胞中的PG,主要參與局部和全身炎癥反應(yīng)[14]。DPP4是一種T細胞表面抗原,在維持免疫淋巴細胞組成和功能、T細胞共刺激和記憶性T細胞生成方面起著重要作用[15]。AR可以影響細胞因子和細胞免疫,表現(xiàn)出抗炎反應(yīng)[16]。NOS2參與炎癥,增強促炎介質(zhì)如IL-6和IL-8的合成[17]。ESR1可以影響靶組織中的細胞增殖和分化,還可以與NF-κB協(xié)同作用,激活涉及機體防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細胞分化和凋亡以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞[18];RXRA在對病毒感染導(dǎo)致的免疫力下降中發(fā)揮作用,可能通過負調(diào)控抗病毒基因(例如I型IFN基因)的轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)[19],這表明黃芪赤風(fēng)湯中度值較高的靶點基因與冠狀病毒導(dǎo)致肺組織損傷引發(fā)的加重炎癥反應(yīng)和過度免疫細胞激活有關(guān),可能通過調(diào)節(jié)免疫力改善炎癥反應(yīng)的方式來發(fā)揮作用。PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中度值較高的靶點基因有IL-6、TNF、VEGFA、AKT1、MMP-9、CASP3、TP53、CXCL8、CCL2、PTGS2、EGF、IL-1B、IL-10、FN1、MAPK1、MMP-2,IL-4、MYC、EGFR、ICAM-1,其中IL-6、IL-1B、IL-10和IL-4在炎癥和各種免疫細胞中均起不同程度的調(diào)節(jié)作用,基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9和MMP-2可以影響凋亡趨化因子和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,這些因子會影響免疫反應(yīng)[20]。MAPK1可影響細胞生長、分化和凋亡,還可以誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[21];AKT1與呼吸道炎癥性疾病的治療有關(guān),AAK1的破壞還可以中斷病毒進入細胞的通道以及病毒顆粒在細胞內(nèi)的組裝[22,23];TNF與巨噬細胞/單核細胞在急性炎癥過程中產(chǎn)生炎癥細胞因子有關(guān),在抵抗感染和癌癥中起作用[24]。核心靶點基因富集到的通路有肺結(jié)核、乙型肝炎、甲型流感、小細胞肺癌、NOD樣受體信號通路和Toll樣受體信號通路等均與肺部炎癥感染和免疫損傷保護有關(guān),這進一步表明黃芪赤風(fēng)湯是通過多成分、多靶點、多通道對COVID-19病毒性肺炎造成的炎癥感染和免疫降低產(chǎn)生作用。SARS-CoV-2 3CL水解酶在病毒生命周期中發(fā)揮重要作用[25],COVID-19病毒以血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2作為受體侵入細胞導(dǎo)致肺損傷[22],因此選擇活性成分—靶點網(wǎng)絡(luò)中度值高的化合物與兩種酶進行分子對接,其中的槲皮素、異鼠李素、豆甾醇、黃花菜木脂素A、毛蕊異黃酮、5-O-甲維阿斯米醇等成分對血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ和SARS-CoV-2 3CL水解酶均顯示出良好的結(jié)合活性,進一步說明黃芪赤風(fēng)湯對COVID-19病毒性肺炎有一定作用。

綜上,本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù),對黃芪赤風(fēng)湯在化濕敗毒方治療新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)中的作用進行了研究,化濕敗毒方治療新冠肺炎有兩個特點,一是消滅病毒,二是增強自身免疫力。研究表明黃芪赤風(fēng)湯主要功能是通過方劑中多個活性成分,如槲皮素、異鼠李素、豆甾醇、黃花菜木脂素A、毛蕊異黃酮、5-O-甲維阿斯米醇等,作用于多個靶點,影響免疫和炎癥相關(guān)通路,發(fā)揮消除炎癥,提高免疫力的作用,進一步豐富了中醫(yī)藥治療COVID-19的理論依據(jù)。