丹芪散對(duì)氣虛血瘀型冠心病患者血管內(nèi)皮功能的影響及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制預(yù)測

許祿華， 林豐夏， 宋銀枝， 曾志聰， 吳子君， 鄧斌，張維維， 李亮， 鐘勇輝

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院深圳市寶安中醫(yī)院心內(nèi)科，廣東深圳 518133；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣東廣州 510405）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（coronary artery disease，CAD），簡稱“冠心病”，是由多種危險(xiǎn)因素（年老、高血壓、糖尿病、吸煙等）導(dǎo)致的，多種機(jī)制（脂肪代謝紊亂學(xué)說、炎癥學(xué)說、損傷應(yīng)答學(xué)說等）共同參與的，發(fā)生于冠狀動(dòng)脈的疾病。冠心病是心血管常見疾病，發(fā)病率和致死率高，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。隨著生活方式的改變，心血管危險(xiǎn)因素持續(xù)增加，冠心病已成為20 世紀(jì)西方發(fā)達(dá)國家的主要死因[1]，嚴(yán)重威脅人類健康。數(shù)據(jù)顯示，我國心血管病死亡率高居首位，高于腫瘤及其他疾病，且我國城市和農(nóng)村居民冠心病死亡率均保存持續(xù)上升趨勢[2]。冠心病耗費(fèi)了大量的醫(yī)療資源，已作為目前社會(huì)的重大負(fù)擔(dān)而廣受關(guān)注[3]。

祖國醫(yī)學(xué)對(duì)冠心病的認(rèn)識(shí)源遠(yuǎn)流長，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》已有“心痹者，脈不通”的描述，并在數(shù)千年實(shí)踐中形成了極具特色的辨證論治體系。中醫(yī)藥防治冠心病優(yōu)勢突出，從臨床癥狀的減輕到病理損傷的改善效果均佳，且簡便價(jià)廉。李貴華團(tuán)隊(duì)[4]統(tǒng)計(jì)84 697例冠心病患者的中醫(yī)證候分型，發(fā)現(xiàn)辨證為氣虛血瘀型患者達(dá)74.3%。針對(duì)胸痹心痛病氣虛血瘀基本證候特點(diǎn)，我科運(yùn)用丹芪散治療胸痹心痛病患者，獲得良好療效。

本研究觀察基于“虛-瘀”病機(jī)基礎(chǔ)的中藥復(fù)方丹芪散治療冠心病的臨床療效與安全性，并觀察治療前后臨床癥狀改善情況及膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、踝肱指數(shù)（ABI）、肱踝脈搏波（PWV）、血清一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素1（ET-1）的變化，從保護(hù)血管內(nèi)皮、改善動(dòng)脈僵硬度探討其作用機(jī)制，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)丹芪散改善冠心病患者血管內(nèi)皮功能的作用進(jìn)行理論驗(yàn)證，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 丹芪散對(duì)氣虛血瘀型冠心病患者的血管內(nèi)皮功能及血管僵硬度的影響

1.1對(duì)象與方法

1.1.1 一般資料 病例選自2014年5月至2017年5月深圳寶安中醫(yī)院（集團(tuán)）心血管病科住院部及門診收治的冠心病患者。采用隨機(jī)數(shù)表的方法將病例隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組2 組，每組各30 例。本研究經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審查通過。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)與辨證分型標(biāo)準(zhǔn) 參考2013年歐洲心臟病學(xué)會(huì)發(fā)布的《穩(wěn)定性冠狀動(dòng)脈疾病管理指南》[5]中冠心病穩(wěn)定性心絞痛的診斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)典型的發(fā)作特點(diǎn)和體征，結(jié)合年齡和存在冠心病高危因素，結(jié)合發(fā)病時(shí)心電圖、運(yùn)動(dòng)平板、動(dòng)態(tài)心電圖、冠脈血管成像（CTA）、冠脈造影等檢查，排除其他病因引起的心絞痛后可確定診斷。中醫(yī)辨證分型參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[6]及《血瘀證中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)》[7]，符合以下表現(xiàn)：神疲乏力，氣短，少氣懶言，汗出，舌質(zhì)淡暗，苔薄白，舌體胖大有齒痕，脈細(xì)，脈結(jié)代。

1. 1. 3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合“1.1.2”項(xiàng)診斷標(biāo)準(zhǔn)及“氣虛血瘀”辨證標(biāo)準(zhǔn)，患者及家屬對(duì)本研究知情同意者。排除標(biāo)準(zhǔn)：年齡>75 歲或<30 歲患者；急性冠脈綜合征或嚴(yán)重心功能不全患者；甲狀腺疾病患者；近1個(gè)月合并嚴(yán)重感染者；有嚴(yán)重伴發(fā)疾病者，如腦卒中、腎功能不全、惡性腫瘤等；妊娠期或哺乳期婦女；嚴(yán)重精神疾患患者。

1.1.4 治療方法 對(duì)照組：根據(jù)指南[5]予以冠心病二級(jí)預(yù)防治療。治療組：在對(duì)照組治療基礎(chǔ)上，加予丹芪散（院內(nèi)顆粒制劑，5 g/包，主要成分為黃芪、西洋參、丹參、田七、山楂），每日2 次，每次1 包沖服。2 組治療及觀察時(shí)間為12 周。治療過程中每2周門診復(fù)診隨訪1次。

1.1.5 觀察指標(biāo)

1.1.5.1 臨床癥狀改善情況 依據(jù)《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[8]觀察患者胸悶、胸痛、心悸、神疲乏力、氣短、少氣懶言、汗出等臨床癥狀改善情況。上述癥狀根據(jù)其嚴(yán)重程度劃分為等級(jí)積分：無癥狀積0分；有癥狀，但不影響正常工作和生活積1分；癥狀明顯影響正常工作和生活積2分；癥狀嚴(yán)重，不能正常生活和工作積3分。觀察時(shí)間點(diǎn)為治療前、治療12周后。

1. 1. 5. 2 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 2 組患者治療前及治療12 周后清晨空腹抽取靜脈血10 mL。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測TC、LDL-C 水平；采用放射免疫法測定ET-1 含量；采用硝酸還原酶法測定NO 含量。同時(shí)記錄治療前后血、尿常規(guī)，肝腎功能、肌酶等結(jié)果。

1. 1. 5. 3 ABI、PWV 檢測 應(yīng)用VS-1500A 動(dòng)脈硬化檢測儀（日本福田產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社）測量患者的ABI、PWV值。分別測量右側(cè)踝動(dòng)脈和肱動(dòng)脈的收縮壓，二者相除之值為ABI；PWV[v/（m?s-1）]=l/t，l為右側(cè)肱踝動(dòng)脈兩個(gè)動(dòng)脈搏動(dòng)點(diǎn)之間的距離，t為2個(gè)波形的傳導(dǎo)時(shí)間差。

1.1.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，若符合正態(tài)分布，組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，若不符合正態(tài)分布，組間采用獨(dú)立秩和檢驗(yàn)，組內(nèi)采用配對(duì)秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2結(jié)果

1.2.1 2組患者一般資料比較 2組一般資料經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有可比性（P>0.05）。具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 2組冠心病患者一般資料比較Table 1 Comparison of baseline data in CAD patients of the two groups （±s）

表1 2組冠心病患者一般資料比較Table 1 Comparison of baseline data in CAD patients of the two groups （±s）

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1. 2. 2 2 組患者臨床癥狀積分比較 表2 結(jié)果顯示：治療后，2組臨床癥狀積分較治療前均明顯降低（P＜0.01），且治療組降低作用優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01）。表明2 組均能改善患者臨床癥狀，但治療組效果更佳。

1. 2. 3 2 組患者血脂比較 表2 結(jié)果顯示：治療后，2 組LDL-C、TC 值較治療前均明顯降低（P＜0.01），表明2組治療均有較好的調(diào)脂作用。但2組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明丹芪散協(xié)同降脂的作用不明顯。

1.2.4 2組患者血管僵硬度指標(biāo)比較 表2結(jié)果顯示：經(jīng)過3個(gè)月的干預(yù)后，治療組ABI值較治療前升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），而對(duì)照組ABI值有所升高，但與治療前比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。2 組治療后PWV 值均下降（P<0.05 或P< 0.01），且治療組降低作用優(yōu)于對(duì)照組（P<0.01）。表明丹芪散具有一定改善血管硬化功能作用。

1. 2. 5 2 組患者血管內(nèi)皮因子比較 表2 結(jié)果顯示：治療后，2 組ET-1 水平均較治療前顯著降低（P＜0.01），且治療組的降低作用優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01）；治療后，2組NO 水平均較治療前顯著升高（P＜0.01），且治療組的升高作用優(yōu)于對(duì)照組（P＜0.01）。

1.2.6 2組患者不良反應(yīng)比較 治療前后2組患者血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能檢查均無明顯變化。對(duì)照組共發(fā)生4 例不良反應(yīng)，發(fā)生率為13.3%（4/30），其中，牙齦出血1 例，頭痛2 例，下肢水腫1 例；治療組共發(fā)生不良反應(yīng)3 例，發(fā)生率為10.0%（3/30），其中，腹瀉1例，頭痛1例，皮下瘀斑1例。觀察組與對(duì)照組不良反應(yīng)發(fā)生率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 2組冠心病患者臨床癥狀積分、血脂、血管僵硬度指標(biāo)、血管內(nèi)皮因子水平比較Table 2 Comparison of the clinical symptoms scores，blood lipids，vascular stiffness indexes and vascular endothelial factors in the two groups （±s）

表2 2組冠心病患者臨床癥狀積分、血脂、血管僵硬度指標(biāo)、血管內(nèi)皮因子水平比較Table 2 Comparison of the clinical symptoms scores，blood lipids，vascular stiffness indexes and vascular endothelial factors in the two groups （±s）

①P<0.05，②P<0.01，與治療前比較；③P<0.01，與對(duì)照組治療后比較

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2 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討丹芪散改善冠心病患者血管內(nèi)皮功能的可能機(jī)制

2.1方法

2.1.1 丹芪散的化學(xué)成分及靶點(diǎn)挖掘 借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP）（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）獲得丹芪散（丹參、三七、山楂、黃芪、西洋參）中各個(gè)中藥的化學(xué)成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%和類藥性（drug-likeness，DL）＞0.18 為條件，篩選出符合條件的候選化合物及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

2. 1. 2 冠心病患者血管內(nèi)皮功能相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 在GeneCards 數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org/，Version 4.5.0）和OMIM 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim，update in 2019-7-23）中，分別以“coronary artery disease”“vascular endothelial function”為關(guān)鍵詞，搜索與冠心病及血管內(nèi)皮功能相關(guān)的基因。搜索GeneCards數(shù)據(jù)庫時(shí)設(shè)置篩選條件：reference＞1；其余保持默認(rèn)設(shè)置。兩者取交集后得到冠心病患者血管內(nèi)皮功能的相關(guān)靶點(diǎn)。

2.1.3 “中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 將“2.1.1”項(xiàng)與“2.1.2”項(xiàng)步驟獲取的靶點(diǎn)取交集，所得交集靶點(diǎn)即為丹芪散改善氣虛血瘀型冠心病患者的血管內(nèi)皮功能的預(yù)測靶點(diǎn)。然后構(gòu)建中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.7.1 軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)中藥化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。“節(jié)點(diǎn)”代表丹芪散中所含藥物化學(xué)成分與潛在作用靶點(diǎn)，“邊”展現(xiàn)了中藥成分和其作用靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。根據(jù)化合物與靶點(diǎn)連接情況篩選出丹芪散改善氣虛血瘀型冠心病患者血管內(nèi)皮功能的關(guān)鍵化合物。

2. 1. 4 靶蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選 將藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/，Version 11.0），限定研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用評(píng)分設(shè)置為最高等置信度[“highest confidence（0.900）”]，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。結(jié)果保存成TSV 格式，保留文件中“node1、node2 和Combined score”列出的信息并導(dǎo)入Cytoscape 軟件繪制相互作用網(wǎng)路，并使用軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，然后使用Cytoscape 軟件中的Generate style from statistics 工具將節(jié)點(diǎn)大小和顏色設(shè)置用于反映度值的大小，邊的粗細(xì)設(shè)置用于反映結(jié)合率評(píng)分（Combine score）的大小，獲得最終的丹芪散改善氣虛血瘀型冠心病患者血管內(nèi)皮功能的PPI網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)基于拓?fù)浞治鼋Y(jié)果，選取自由度（Degree）、介度（Betweenness）和中心性（Closeness）均大于中位數(shù)的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)，并分析其藥理作用。

2.1.5 相關(guān)通路和注釋分析 利用Cytoscape軟件中的Clue GO 插件，對(duì)藥物-疾病交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（GO）基因功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。分別選擇“Biological Process”“Cellular Component”“Molecular Function”和“KEGG-Pathway”得到相關(guān)數(shù)據(jù)，保存結(jié)果，并將所得結(jié)果按照P值降序排列，綜合“%Associated Genes”“Number Gene”等指標(biāo)篩選可能與冠心病內(nèi)皮功能相關(guān)的排名靠前的生物過程和通路。

2.2結(jié)果

2.2.1 丹芪散候選化合物及靶點(diǎn)的篩選 丹芪散中有5 味中藥，即丹參、三七、山楂、黃芪、西洋參，在TCMSP 中，以O(shè)B ≥30%，DL ≥0.18 作為篩選條件，共得到候選化合物103個(gè)，其中，丹參化學(xué)成分65 個(gè)，三七化學(xué)成分8 個(gè)，山楂化學(xué)成分6 個(gè)，黃芪化學(xué)成分20 個(gè)，西洋參化學(xué)成分11 個(gè)。根據(jù)候選化合物篩選靶點(diǎn)，分別去除重復(fù)靶點(diǎn)，共得到靶點(diǎn)120 個(gè)，其中，丹參靶點(diǎn)61 個(gè)，三七靶點(diǎn)89個(gè)，山楂靶點(diǎn)93個(gè)，黃芪靶點(diǎn)97個(gè)，西洋參靶點(diǎn)28個(gè)。

2.2.2 冠心病患者血管內(nèi)皮功能相關(guān)靶點(diǎn)獲取結(jié)果以“coronary artery disease”為關(guān)鍵詞從GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到6 567個(gè)靶點(diǎn)，從OMIM 數(shù)據(jù)庫中檢索到123個(gè)靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，共得到6 677 個(gè)冠心病相關(guān)靶點(diǎn)基因；以“vascular endothelial function”為關(guān)鍵詞從GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索到12 819 個(gè)靶點(diǎn)，從OMIM 數(shù)據(jù)庫中檢索到94 個(gè)靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，共得到12 867 個(gè)血管內(nèi)皮功能相關(guān)靶點(diǎn)基因。把兩者交集，即得到冠心病患者血管內(nèi)皮功能相關(guān)靶點(diǎn)，共15 059個(gè)。

2.2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析結(jié)果 將103 個(gè)化合物的120個(gè)化合物靶點(diǎn)與15 059個(gè)冠心病患者血管內(nèi)皮功能相關(guān)靶點(diǎn)基因取交集，得到115個(gè)共同靶點(diǎn)基因，共對(duì)應(yīng)84個(gè)化合物。利用Cytoscape 軟件構(gòu)建中藥化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中共有199 個(gè)節(jié)點(diǎn)（其中化合物節(jié)點(diǎn)84 個(gè)，靶基因節(jié)點(diǎn)115 個(gè)）和1 043 條邊，見圖1。度值最高的化合物為槲皮素（quercetin）， 其余依次為山柰酚（kaempferol）、異鼠李亭（isorhamnetin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）和木犀草素（luteolin）等，度值排名前20位的化合物信息見表3，這些度值較高的化合物可能是丹芪散改善冠心病患者內(nèi)皮功能的關(guān)鍵化合物。

2.2.4 靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選將交集得到的115 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，然后利用Cytoscape 軟件對(duì)所得PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行優(yōu)化，得到最終的丹芪散改善冠心病患者血管內(nèi)皮功能的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。網(wǎng)絡(luò)中發(fā)生蛋白相互作用的靶點(diǎn)有113 個(gè)（其中有2 個(gè)靶點(diǎn)未發(fā)生蛋白相互作用），1 029條邊代表了蛋白之間相互作用。根據(jù)PPI網(wǎng)路的拓?fù)浞治鼋Y(jié)果，網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)連接度的中位數(shù)為18.3，節(jié)點(diǎn)介度的中位數(shù)為1.00×10-2，節(jié)點(diǎn)緊密度的中位數(shù)為0.502，其中連接度、介度、緊密度均超過中位數(shù)的靶點(diǎn)有43個(gè)，見表4，推測這些靶點(diǎn)可能是丹芪散改善冠心病患者血管內(nèi)皮功能的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.2.5 丹芪散改善冠心病患者血管內(nèi)皮功能的基因功能分析 丹芪散的藥物靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)功能分析結(jié)果見表5。生物分析過程發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)基因主要參與了G 蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性、膠質(zhì)細(xì)胞凋亡過程、神經(jīng)元內(nèi)在凋亡信號(hào)通路的調(diào)控、缺氧時(shí)RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、通過化學(xué)信號(hào)調(diào)節(jié)心臟收縮力和血管平滑肌細(xì)胞發(fā)育等。對(duì)分子功能分析發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)基因具有配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體活性，以及半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與凋亡信號(hào)通路、乙酰膽堿受體的活動(dòng)和RNA 聚合酶Ⅱ一般轉(zhuǎn)錄起始因子結(jié)合等作用。對(duì)細(xì)胞成分分析發(fā)現(xiàn)，共表達(dá)基因主要涉及膜筏、膜微區(qū)、突觸前膜的組成部分、凋亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體和突觸后膜的組成部分等細(xì)胞組分。

2. 2. 6 丹芪散改善冠心病患者血管內(nèi)皮功能的KEGG通路富集分析 丹芪散改善冠心病患者血管內(nèi)皮功能的KEGG 通路富集分析結(jié)果見表6。P值排名前20 位的通路中，主要涉及流體剪切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞凋亡、p53信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號(hào)通路、c型凝集素受體信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、白細(xì)胞介素17（IL-17）信號(hào)通路和松弛素信號(hào)通路等。

圖1 丹芪散改善冠心病患者血管內(nèi)皮功能的“中藥-活性成分-關(guān)鍵靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)圖Figure 1 “Herb-Compound-Target”network of Danqi San in improving vascular endothelial functions in CAD patients

3 討論

目前，以調(diào)脂、抗血小板為核心的藥物已成為冠心病治療的基礎(chǔ)，而經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（PCI）治療及外科手術(shù)如冠脈搭橋術(shù)等發(fā)展日漸成熟，也已成為治療冠心病的重要武器。但這些手段都存在一定的局限性。心肌梗死后的患者人群中，盡管接受著標(biāo)準(zhǔn)的冠心病二級(jí)預(yù)防治療，但因存在高危動(dòng)脈粥樣硬化病灶，其中超過40%的患者仍具有更高的再發(fā)心肌梗死、卒中或心因性死亡的風(fēng)險(xiǎn)[9]。PCI 及搭橋術(shù)雖然能夠增多冠脈血流量，改善血液循環(huán)，但是仍未能逆轉(zhuǎn)或改變冠脈粥樣硬化病程的進(jìn)展。而中醫(yī)藥的冠心病防治研究中已取得較好的成果。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的發(fā)生多與年老體虛、飲食不當(dāng)、情志失調(diào)等因素有關(guān)。氣虛血瘀乃本病之根本病機(jī)，“心主血脈”，憑借氣之溫煦推動(dòng)，方可使血?dú)庋谛拿}，氣虛推動(dòng)乏力則心血瘀阻，脈絡(luò)不通，不通則痛，發(fā)為本病。丹芪散的基本藥物組成為黃芪、丹參、三七、西洋參、山楂。其中：黃芪為君，益氣升陽，使氣旺而血行，陽盛而瘀散；丹參為臣，涼血活血、祛瘀止痛；三七活血化瘀定痛，兼有補(bǔ)虛之功而為臣；佐以西洋參補(bǔ)氣養(yǎng)陰，清火生津，山楂行氣散瘀。五藥共奏益氣活血通脈之功?，F(xiàn)代藥理研究表明：黃芪能夠保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗動(dòng)脈硬化、擴(kuò)張血管、降低血壓、增加心肌收縮力和心排血量、保護(hù)缺血缺氧損傷[10]；丹參的主要成分丹參酚酸B、丹參酮等均具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈血流量、改善微循環(huán)、降低心肌耗氧量、防治心肌缺血和心肌梗塞等作用[11]；三七的活性成分具有抑制血小板凝集、延長凝血時(shí)間、抑制血栓形成、降血脂、抗炎、消除自由基及抗氧化等藥理活性[12]；西洋參具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化及抗炎等作用，可延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[13]；山楂可通過提高膽固醇7α-羥化酶的表達(dá)水平，抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（ACAT）的活性，增加LDL-C 受體水平及通過調(diào)控多種脂肪代謝酶的機(jī)制調(diào)節(jié)血脂[14]。

表3 丹芪散中關(guān)鍵化合物Table 3 Data of key compounds in Danqi San

圖2 丹芪散改善冠心病患者內(nèi)皮功能的靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Figure 2 PPI network of target proteins of Danqi San in improving vascular endothelial function in patients with coronary artery disease

本課題組通過本臨床研究，證實(shí)了丹芪散在慢性穩(wěn)定性冠心病患者中的療效。經(jīng)過12 周丹芪散的治療，治療組患者胸悶、胸痛、心悸、神疲乏力、氣短、少氣懶言、汗出等臨床癥狀均得到較好的改善，與對(duì)照組比較，臨床癥狀積分改善更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明丹芪散不僅能減輕心絞痛的發(fā)作頻率與程度，還能進(jìn)一步改善患者的神疲乏力、少氣懶言、汗出等全身癥狀，這是西醫(yī)常規(guī)治療難以達(dá)到的效果。

丹芪散中三七、山楂等藥物的藥理研究均提示具有一定調(diào)節(jié)血脂的作用，但在本研究中丹芪散的調(diào)脂效果并不顯著。其原因可能與基礎(chǔ)治療已使用較強(qiáng)的HMG-CoA還原酶抑制劑，遮蓋了丹芪散的調(diào)脂效果有關(guān)，此外，山楂與三七的藥理研究多停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，在人體的有效調(diào)脂劑量尚不明確，亦可能與本研究使用的丹芪散顆粒未達(dá)有效降脂劑量有關(guān)。

表4 丹芪散改善冠心病患者內(nèi)皮功能的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其拓?fù)湫再|(zhì)Table 4 The key targets and topological properties of Danqi San in improving vascular endothelial function in CAD patients

表5 丹芪散改善冠心病患者內(nèi)皮功能關(guān)鍵靶標(biāo)基因功能分析Table 5 Functional information of key target genes of Danqi San in improving vascular endothelial function in CAD patients

（續(xù)表5）

表6 丹芪散改善冠心病患者血管內(nèi)皮功能關(guān)鍵靶標(biāo)的通路富集分析Table 6 Analysis of KEGG pathway enrichment of Danqi San in improving vascular endothelial function in CAD patients

治療組干預(yù)3 個(gè)月后ABI 上升，與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），但與對(duì)照組比較改善未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ABI已被作為預(yù)測心血管風(fēng)險(xiǎn)的觀察指標(biāo)，對(duì)心血管死亡率及全因死亡率具有預(yù)測價(jià)值[15]。ABI下降幅度與動(dòng)脈狹窄程度相關(guān)，機(jī)理為動(dòng)脈狹窄引起遠(yuǎn)端灌注壓下降。丹芪散治療后ABI 下降，表明丹芪散具有一定改善動(dòng)脈硬化、改善遠(yuǎn)端灌注壓的作用，但與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可能與干預(yù)時(shí)間較短有關(guān)。2 組治療后PWV 下降明顯，治療組下降幅度與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。PWV 可評(píng)估動(dòng)脈僵硬度，能較好地反映動(dòng)脈血管彈性，PWV 值越大，表明血管僵硬度愈高，彈性愈差。2 組經(jīng)治療后PWV 值均下降，而治療組下降幅度較對(duì)照組更明顯（P<0.01），表明丹芪散具有增加動(dòng)脈彈性、改善血管僵硬度作用。已有研究表明，ABI 和PWV 與冠狀動(dòng)脈病變積分顯著相關(guān)[16]，本研究中ABI 與PWV 值的變化可間接表明丹芪散可改善冠狀動(dòng)脈狹窄，這可能是丹芪散防治冠心病的機(jī)制。

本研究進(jìn)一步從血管內(nèi)皮功能探討丹芪散發(fā)揮作用的可能機(jī)制，結(jié)果提示，丹芪散可下調(diào)ET-1 水平，上調(diào)NO 水平。血管內(nèi)皮功能障礙常早于動(dòng)脈粥樣硬化出現(xiàn)，且逐漸被認(rèn)為是動(dòng)脈硬化發(fā)生的標(biāo)志。ET-1 是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的活性多肽，可引起血管平滑肌收縮，并可損傷血管壁；NO是最重要的擴(kuò)張血管物質(zhì)。一方面，ET-1可促進(jìn)白細(xì)胞介素、單核細(xì)胞趨化因子1等分泌，進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬低密度脂蛋白，加重脂質(zhì)在動(dòng)脈內(nèi)膜的沉積，加重血管內(nèi)皮損傷而誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，導(dǎo)致冠脈血管狹窄[17]；另一方面，當(dāng)ET-1 與NO 分泌的平衡被打破時(shí)，便可引起冠脈血管痙攣收縮，加重心肌缺血缺氧，誘發(fā)心絞痛發(fā)作。本研究發(fā)現(xiàn)：丹芪散可以改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，基于ABI 與PWV 的變化提示其可改善動(dòng)脈粥樣硬化，為“治本”；丹芪散還可以調(diào)節(jié)血管舒張、收縮因子而減輕血管痙攣，為“治標(biāo)”。標(biāo)本同治，從而改善氣虛血瘀型冠心病患者的臨床癥狀。在不良反應(yīng)觀察方面，2組不良事件發(fā)生率無顯著性差異，表明丹芪散具有良好的安全性。

以上臨床研究提示，丹芪散可能通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能，從而改善冠心病患者的臨床癥狀。因此，我們進(jìn)一步基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從整體角度對(duì)丹芪散改善冠心病患者血管內(nèi)皮功能的可能機(jī)制進(jìn)行理論探討。在丹芪散針對(duì)冠心病血管內(nèi)皮功能的“有效成分-靶標(biāo)”網(wǎng)絡(luò)分析中，我們根據(jù)網(wǎng)絡(luò)度值排名篩選出丹芪散改善冠心病患者血管內(nèi)皮功能的關(guān)鍵化合物，包括槲皮素、山柰酚、異鼠李亭、β-谷甾醇和木犀草素等。這些關(guān)鍵化合物分子具有高度的中心性，并且大多已經(jīng)廣泛應(yīng)用于心血管領(lǐng)域的研究。其中，從山楂、黃芪或三七中提取的黃酮類化合物槲皮素可通過介導(dǎo)糖尿病大鼠中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）其受體VEGFR2表達(dá)的增加，及介導(dǎo)NO 和環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平的下降，從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的氧化應(yīng)激，并最終改善糖尿病大鼠的內(nèi)皮功能[18]；且已有大量研究[19]證明，槲皮素具有顯著的心臟相關(guān)益處，如抑制低密度脂蛋白氧化、非內(nèi)皮依賴性血管舒張作用、減少黏附分子和其他炎性標(biāo)記、在氧化應(yīng)激條件下對(duì)NO和內(nèi)皮功能的保護(hù)作用等。又如，山柰酚可以通過激活KCa 1.1通道，增強(qiáng)內(nèi)皮源性和外源性NO以及內(nèi)皮依賴性超極化引起的舒張作用，從而抑制血管內(nèi)皮增殖，改善血管內(nèi)皮功能[20]；異鼠漢素是槲皮素的甲基化代謝物，可以通過抑制caspase 3、caspase 8和FAS/FASL的表達(dá)，抑制核因子-kappa B 的核易位，表現(xiàn)出抗炎、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等多種功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)甲基乙二醛（MGO）加氧葡萄糖剝奪（OGD）暴露誘導(dǎo)的人大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用[21]；β-谷甾醇可以通過增強(qiáng)細(xì)胞谷胱甘肽氧化還原循環(huán)，從而對(duì)心肌細(xì)胞缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡提供保護(hù)作用[22]；而木犀草素可以通過抗氧化和抗炎機(jī)制預(yù)防肥胖引起的全身性代謝改變和血管功能障礙[23]，還可以通過改善體內(nèi)缺血/再灌注大鼠肌漿網(wǎng)Ca（2+）-ATP 酶活性發(fā)揮心臟保護(hù)作用[24]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，這些關(guān)鍵化合物在炎癥反應(yīng)、抗氧化、改善血流灌注、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能等方面均有一定的作用，這與丹芪散前期功效的研究結(jié)論高度契合。

通路分析結(jié)果提示丹芪散可能通過流體剪切應(yīng)力、動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞凋亡、p53 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、c 型凝集素受體信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路和松弛素信號(hào)通路等通路改善冠心病患者的血管內(nèi)皮功能。其中，大部分通路均已有研究證據(jù)支持。比如，流體剪切應(yīng)力在調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)作用中至關(guān)重要[25]，而Siasos G 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，微血管功能或心外膜內(nèi)皮功能異常的冠狀動(dòng)脈段的流體剪切應(yīng)力較微血管功能或心外膜內(nèi)皮功能正常的冠狀動(dòng)脈段低，提示在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的早期階段，微血管和心外膜內(nèi)皮功能障礙與局部低流體剪切應(yīng)力存在密切關(guān)聯(lián)。細(xì)胞凋亡可被認(rèn)為是通過有絲分裂來抵消細(xì)胞增殖作用的機(jī)制。已有大量研究證實(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、糖尿病性心肌病、再灌注損傷和心肌炎等心血管疾病息息相關(guān)[27]。Leblond 等[28]的研究表明，通過抑制p53的表達(dá)，可以發(fā)揮抗高膽固醇血癥作用，進(jìn)而保護(hù)小鼠的血管內(nèi)皮功能。而HIF-1也已被研究[29]證實(shí)，通過上調(diào)VEGF、NO、ROS、PDGF，其可引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、增殖、血管生成和炎癥等，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展中有關(guān)鍵作用。

綜上所述，丹芪散可以改善氣滯血瘀型冠心病患者的臨床癥狀，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮因子ET-1 及NO 的分泌，從而減輕血管痙攣、改善心肌供血。丹芪散可以改善動(dòng)脈粥樣硬化、遠(yuǎn)端灌注壓，亦可以改善冠心病患者的血管條件，可能與抑制ET-1有關(guān)。丹芪散可以改善冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮功能，其機(jī)制可能涉及流體剪切應(yīng)力、動(dòng)脈粥樣硬化、細(xì)胞凋亡、p53 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、c 型凝集素受體信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路和松弛素信號(hào)通路等多條通路。

丹芪散能否進(jìn)一步減少冠心病患者的終點(diǎn)事件？能否延長冠心病患者的遠(yuǎn)期預(yù)后與生存期？在急性冠脈綜合征及心肌梗死后患者人群中能否獲益？這值得我們進(jìn)一步探索。我們期望對(duì)丹芪散開展大樣本、多中心、高質(zhì)量的臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，延長觀察時(shí)限，以明確丹芪散的遠(yuǎn)期治療效果，并開展更深入的分子機(jī)制研究，以全面地證明中醫(yī)藥在冠心病治療的臨床療效。