芪術(shù)抗癌方對肝癌細胞上皮間質(zhì)化的影響

馮文杏， 胡銳， 孫新鋒， 韓志毅， 馬文峰， 張衛(wèi)， 周小舟

（廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院，廣東深圳 518033）

原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，異質(zhì)性強，死亡率高。約90%與癌癥相關(guān)的死亡是由轉(zhuǎn)移性疾病而不是原發(fā)性腫瘤引起的[1-2]。侵襲性腫瘤前緣細胞多表現(xiàn)出一種去分化的形態(tài)，這種形態(tài)是由上皮標志物和細胞與細胞間連接的丟失引起的，并獲得間葉細胞標志物的表達[3-4]，這種細胞表型的轉(zhuǎn)變程序稱為上皮間質(zhì)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。上皮間質(zhì)化與多種腫瘤功能相關(guān)，包括腫瘤的發(fā)生、惡性進展、腫瘤的干性、腫瘤細胞的遷移、侵入血管、轉(zhuǎn)移和對治療的抵抗等方面[5]。中醫(yī)學無“肝癌”病名，根據(jù)相關(guān)癥狀其隸屬于“鼓脹”“肝積”“肝脹”等范疇，在病因病機上存在正虛邪實的特點。基于這一特點，周小舟主任在臨床中運用芪術(shù)抗癌方治療肝癌獲得了良好的療效[6]，但其機制尚不明確。因此，本研究通過體外實驗探討芪術(shù)抗癌方對肝癌HepG2 細胞上皮間質(zhì)化的影響，以期為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞株人肝癌細胞株HepG2購自武漢博士德公司。

1.2試劑與儀器轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）（美國R&D 公司）；E 鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、N 鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體、Vimentin 抗體、Snail 抗體、纖黏蛋白（Fibronectin）抗體（美國Abcam 公司）；GAPDH 抗體、β-actin 抗體（美國Sigma 公司）。ChemiDocTMMP 全自動凝膠成像和化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)、垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3芪術(shù)抗癌方凍干粉浸提液制備芪術(shù)抗癌方由黃芪10 g、炒白術(shù)15 g、柴胡5 g、白芍10 g、薏苡仁30 g、淮山藥15 g、雞內(nèi)金10 g、莪術(shù)10 g、白花蛇舌草15 g、炙甘草5 g 組成，各中藥材凍干粉由深圳市中醫(yī)院制劑科制備。浸提液制備方法：用微量天平稱取凍干粉置于無菌離心管中，以DMEM培養(yǎng)液充分溶解，用0.22 μm微孔濾器過濾得到母液，以DMEM稀釋獲得1 mg/mL濃度的浸提液，均現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4細胞培養(yǎng)與傳代人肝癌細胞株HepG2細胞復蘇后，以含體積分數(shù)10%胎牛血清（FBS）+1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分數(shù)95%濕度、體積分數(shù)5%CO2。每2 d 換液1 次，當細胞生長融合達80% ～90%時，以2.5 g/L 胰蛋白酶[含0.2 g/L 乙二胺四乙酸（EDTA）]消化、傳代。

1. 5分組并鏡下觀察細胞形態(tài)將指數(shù)生長的HepG2 細胞按1×106個/孔接種在6 孔板，貼壁后，空白對照組以DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，TGF-β1組加入TGF-β 10 ng/mL 培養(yǎng)，中藥組分別加入TGF-β1 10 ng/mL+芪術(shù)抗癌方浸提液1 mg/mL、TGF-β1 10 ng/mL+芪術(shù)抗癌方浸提液2 mg/mL 培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化并拍照。

1.6劃痕實驗觀察細胞遷移能力實驗前在超凈臺用記號筆在6 孔板背后沿直尺均勻地劃橫線5 ～6 條，接種細胞量以隔夜能達到80%為計。第2 天吸除培養(yǎng)基，用槍頭比著直尺垂直于板背后的橫線劃痕，然后用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕洗3 次，洗去劃下的細胞。分組培養(yǎng)方法同“1.5”項，分別于0 h 和培養(yǎng)24 h 在同一劃痕處顯微鏡下拍照。用ImageJ 軟件計算0、24 h 劃痕面積，愈合百分比=（0 h 劃痕面積-24 h 劃痕面積）/0 h 劃痕面積×100%。

1. 7蛋白免疫印記法檢測細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Fibronectin、Snail的表達將指數(shù)生長的HepG2 細胞按1×106個/孔接種在6 孔板，貼壁后分組培養(yǎng)方法同“1.5”項。48 h 后吸除培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿置于冰上提取細胞蛋白，蛋白濃度及配平采用Bradford 法，配平后于100 ℃水浴10 min 變性，離心，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)蛋白分子量配制相應(yīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠，將等量蛋白進行電泳、轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉60 min，孵育對應(yīng)一抗4 ℃冰箱過夜，孵育對應(yīng)二抗，曝光顯影、圖像分析。采用Image-Lab軟件進行電泳條帶灰度值分析，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin或GAPDH）灰度值的比值表示。

1.8統(tǒng)計方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較，方差齊時采用LSD 檢驗，方差不齊時采用Games-Howell檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1各組HepG2細胞形態(tài)變化比較圖1 結(jié)果顯示：HepG2細胞加入TGF-β1后，可見細胞形態(tài)呈細長多形樣間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變（箭頭處），而加入芪術(shù)抗癌方共培養(yǎng)的2個治療組，可見細胞呈鈍圓，維持緊密連接。

圖1 各組HepG2細胞形態(tài)變化比較（×40）Figure 1 Comparison of the morphological changes of HepG2 cells in various groups（×40）

2.2各組HepG2細胞遷移能力比較圖2 結(jié)果顯示：HepG2細胞加入TGF-β1后，細胞劃痕愈合百分比增加，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；加入芪術(shù)抗癌方共培養(yǎng)的2 個治療組細胞劃痕愈合百分比較TGF-β1 組均顯著減?。≒<0.05）。

圖2 各組HepG2細胞遷移能力比較Figure 2 Comparison of the migration abilities of HepG2 cells in various groups

2. 3各組HepG2細胞上皮間質(zhì)化蛋白表達情況比較圖3 結(jié)果顯示：TGF-β1 組上皮表型標記物E-cadherin表達水平較空白對照組降低，間質(zhì)表型標記物N-cadherin、Vimentin、Fibronectin 和Snail表達水平較空白對照組均升高，其中，2 組的Fibronectin 表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與TGF-β1組比較，芪術(shù)抗癌方2 個治療組E-cadherin表達水平均升高，N-cadherin、Vimentin、Snail 和Fibronectin 表達水平均降低，其中：芪術(shù)抗癌方1 mg/mL 組Vimentin、Snail 表達水平，與TGF-β1組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；芪術(shù)抗癌方2 mg/mL 組E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Fibronectin表達水平，與TGF-β1組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P< 0.05 或P<0.01）。表明芪術(shù)抗癌方對HepG2 細胞上皮間質(zhì)化的抑制作用呈濃度依賴性，濃度越高，抑制效果越大。

圖3 各組HepG2細胞上皮間質(zhì)化蛋白表達情況比較Figure 3 Comparison of the expression of EMT proteins in HepG2 cells from various groups

3 討論

芪術(shù)抗癌方為周小舟教授在臨床治療肝癌患者經(jīng)驗中總結(jié)創(chuàng)立的。周小舟教授認為肝癌的主要病因是正氣不足與外感疫毒相互作用所致，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學有關(guān)乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、過度飲酒等病原因素與機體免疫失調(diào)研究[7]的綜合結(jié)果，通過臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)肝癌的主要證型是氣虛血瘀[8]。芪術(shù)抗癌方以益氣散結(jié)、疏肝健脾為法，方中：黃芪益氣扶正、莪術(shù)活血消積為君，白術(shù)、雞內(nèi)金、山藥補脾散結(jié)為臣，柴胡、白芍疏肝柔肝，白花蛇舌草、薏苡仁養(yǎng)肝利濕為佐，炙甘草調(diào)和諸藥。突出了“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”的思想。周小舟課題組對芪術(shù)抗癌方進行了系列臨床研究，發(fā)現(xiàn)經(jīng)導管肝動脈化療栓塞術(shù)（TACE）+抗癌方組與單純行TACE組比較，總有效率分別為90.6%（29/32）、65.6%（21/32），腫瘤初次復發(fā)率分別為9.37%（3/32）、34.38%（11/32），可明顯改善患者的生存質(zhì)量、減少腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移并提高患者的生存率[9]。

上皮間質(zhì)化是胚胎發(fā)育和器官形成過程中至關(guān)重要的細胞重塑過程，是上皮細胞獲得間質(zhì)特征的細胞生物學行為，表現(xiàn)為上皮細胞失去極性和細胞間連接，變成多形和松散的間質(zhì)狀態(tài)。上皮間質(zhì)化是執(zhí)行對特殊誘導轉(zhuǎn)化因子即上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)錄因子（EMT-TFs）、miRNAs、表觀遺傳和轉(zhuǎn)化后調(diào)節(jié)子表達的反應(yīng)[10]，誘導上皮細胞去分化，抑制上皮細胞特征蛋白的表達，包括E-cadherin，以及激活間質(zhì)化表型蛋白，包括N-cadherin、Vimentin、Fibronectin等。SNAIL、TWIST、ZEB家族被認為是主要的EMT-TFs，已被大量實驗證實[11-12]。

癌細胞的上皮間質(zhì)化以上皮細胞極性的喪失、E-cadherin 相關(guān)的細胞與細胞間黏合劑的崩解、間質(zhì)標記陽性獲得為特征，誘導腫瘤細胞的遷移性增加[13]。在一定情況下多種經(jīng)典生長因子均可誘發(fā)上皮間質(zhì)化，這些因子不僅僅由腫瘤細胞分泌，也可以由腫瘤基質(zhì)細胞分泌，其中TGF-β被認為是上皮間質(zhì)化最有效的誘導因子之一[14-15]。中醫(yī)藥在肝癌的治療中顯示其獨特優(yōu)勢，在對部分中藥單體（如姜黃素、槲皮素、木犀草素、白藜蘆醇等）及復方的研究中發(fā)現(xiàn)其有一定的抗上皮間質(zhì)化效果[16]。

綜上所述，本研究用TGF-β1刺激HepG2細胞后，HepG2 細胞的形態(tài)向多形和狹長狀間質(zhì)樣細胞轉(zhuǎn)變，間質(zhì)表型蛋白表達增強，細胞遷移能力增加，提示TGF-β1誘導HepG2 細胞發(fā)生了上皮間質(zhì)化。而加入芪術(shù)抗癌方共培養(yǎng)后，細胞可維持在緊密連接狀態(tài)，上皮表型蛋白表達增強，間質(zhì)表型蛋白表達較減弱，細胞遷移能力下降，表明芪術(shù)抗癌方對TGF-β1誘導的HepG2細胞上皮間質(zhì)化具有抑制作用，但這種抑制效果的具體機制還需要進一步研究。