膝痹通絡方通過調節(jié)MAPK-MEK信號通路延緩對白細胞介素1β誘導的關節(jié)軟骨細胞退變

宋奕， 丁道芳， 朱寅， 王星華

（1.蘇州市中西醫(yī)結合醫(yī)院，江蘇蘇州 215000；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院石氏傷科醫(yī)學中心，上海 201203；3.上海市中醫(yī)藥研究院骨傷科研究所，上海 201203）

骨性關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）好發(fā)于使用頻繁，且負重大、活動多的關節(jié)，如膝、髖、脊柱、踝等，其中又以膝關節(jié)骨性關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）最為常見。根據(jù)最新的流行病學調查數(shù)據(jù)顯示，我國目前癥狀性KOA 的患病率為8.1%，這一比例意味著我國目前大約有1.1 億KOA 患者，而65 歲以上KOA 患病率甚至已達到50%[1]。KOA 的主要病理改變是軟骨的退行性變。正常情況下軟骨細胞外基質的合成和降解是一個動態(tài)平衡的過程，而在KOA 狀態(tài)，這一平衡被打破，最終導致軟骨細胞的退變和凋亡，細胞外基質的松散。有學者研究發(fā)現(xiàn)，關節(jié)腔的炎癥是導致這一平衡被打破的主要原因之一，且KOA 發(fā)病過程中的炎癥反應及軟骨退變都有絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）- MAPK 激酶（MEK）信號通路參與。對于KOA 的治療，目前除了健康教育和功能鍛煉外，仍以藥物治療為主。膝痹通絡方是蘇州市中西醫(yī)結合醫(yī)院治療KOA 的經驗方，臨床取得較好療效，能顯著改善膝關節(jié)疼痛及活動度。炎癥因子白細胞介素1β（IL-1β）是KOA 炎癥反應中的關鍵因子，本研究通過以其誘導軟骨細胞退變模擬KOA 軟骨退變，觀察膝痹通絡方含藥血清對退變軟骨細胞的影響，并從MAPK-MEK 信號通路探討其作用機制，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物新生24 h 雌性SD 大鼠10 只，清潔級雌性3 月齡SD 大鼠20 只，體質量（200±20）g，購自上海實驗動物資源中心，動物質量合格證號：SCXK（滬2008-0016）。

1. 2藥物、試劑與儀器膝痹通絡方組成中藥（杜仲10 g，牛膝10 g，黃芪20 g，當歸10 g，川芎10 g，白芍10 g，獨活10 g，雞血藤30 g，秦艽6 g，木瓜10 g）由蘇州市中西醫(yī)結合醫(yī)院提供，為江陰江天藥業(yè)免煎顆粒劑；胎牛血清、H-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（法國Biowest 公司）；IL-1β（美國RD 公司）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料（美國Sigma 公司）；PCR 試劑盒（美國Selleck 公司）；性別決定區(qū)Y框蛋白（SOX9）抗體、基質金屬蛋白酶13（MMP13）抗體、磷酸化原癌基因絲蘇氨酸蛋白激酶（P-Raf1）抗體、Raf1 抗體、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶激酶（p-MEK1）抗體、MEK1抗體、GAPDH 抗體、異硫氰酸熒光素（FITC）抗體（美國EarthOx 公司）。離心機（德國Sigma 公司）；多功能酶標儀（美國BioTek 公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific 公司）；IX41 顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3軟骨細胞培養(yǎng)方法及免疫熒光鑒定采用上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院石氏傷科醫(yī)學中心已成熟的軟骨細胞培養(yǎng)方法[2]。將10只新生24 h雌性SD 大鼠脫頸椎處死，取雙側肱骨頭處軟骨，清除殘留組織后剪成1 mm × 1 mm × 1 mm 大小骨塊，在37 ℃細胞培養(yǎng)箱內用1 g/L 的Ⅱ型膠原酶消化1 h，收集消化后的細胞懸浮液，并重復3～4 次，懸浮液離心后收集細胞，細胞培養(yǎng)液重懸并接種細胞，隔日換液。取P1代細胞進行實驗。

細胞鑒定：以40 g/L多聚甲醛固定細胞10 min后磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2 次，磷酸鹽Tween20緩沖液（PBST）通透20～30 min，體積分數(shù)5%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉浸泡1 h，加入Ⅱ型膠原抗體（稀釋度為1∶200），4 ℃孵育過夜。再用PBS清洗3 次，加入FITC 標記的抗小鼠二抗（稀釋度1∶200），室溫避光孵育1 h，PBST 清洗3次后加入DAPI 染液（10 μg/L），5 min 后熒光倒置顯微鏡下觀察細胞并拍照。

1.4膝痹通絡方含藥血清制備膝痹通絡方中藥顆粒劑混合后用開水沖泡，充分攪拌溶解、冷卻，根據(jù)人-大鼠體表面積比值折算出大鼠口服劑量為10.86 g·kg-1·d-1，以5.43、10.86、21.72 g·kg-1·d-1的口服劑量分別設為低、中、高濃度組。將20 只清潔級雌性3 月齡SD 大鼠隨機分成4 組，其中正常組8只，高、中、低濃度中藥組各4只，每200 g體質量大鼠每日灌胃2 mL，高、中、低濃度中藥組大鼠分別對應灌胃高、中、低濃度膝痹通絡方，正常組每日灌胃等體積生理鹽水。每日灌服1 次，連續(xù)3 d。末次灌藥1 h后腹主動脈取血，取上層血清56 ℃滅活后過濾分裝，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5細胞分組培養(yǎng)收集生長狀態(tài)良好的軟骨細胞，調整細胞密度為5×105個/mL，以5 mL接種于直徑6 cm 培養(yǎng)皿，將細胞隨機分為5 組，即正常對照組、IL-1β 組、高濃度中藥組、中濃度中藥組和低濃度中藥組。正常對照組：加入正常大鼠血清培養(yǎng)；IL-1β組：加入正常大鼠血清和20 ng/mL IL-1β培養(yǎng)；高、中、低濃度中藥組：分別對應加入高、中、低濃度的膝痹通絡方含藥血清進行培養(yǎng)，并加入20 ng/mL IL-1β。培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡（100 倍）下觀察軟骨細胞大小、密度與形態(tài)，同時提取細胞RNA 和蛋白進行定量聚合酶鏈反應（qPCR）和蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測。

1.6 qPCR法檢測軟骨細胞MMP3、SOX9、A-CAN、ADAMTS4/5基因的表達細胞培養(yǎng)24 h 后，抽提軟骨細胞總RNA并進行濃度測定，取2 μg RNA 逆轉錄，進行qPCR 檢測。每個樣品設3 個復孔，重復3次。以GAPDH作為內參基因，采用2-△△Ct法計算目的基因表達的相對變化，引物序列見表1。反應條件：95 ℃30 s，初步變性1 個循環(huán)；95 ℃5 s變性，60 ℃30 s 退火，重復40 個循環(huán)；72 ℃30 s延伸。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.7 Western Blot法檢測軟骨細胞SOX9、MMP13、P-Raf1、Raf1、P-MEK1、MEK1蛋白表達細胞培養(yǎng)24 h 后進行細胞裂解提取蛋白，測定濃度，分裝，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。蛋白電泳、轉膜，溫封閉液浸泡1 h，加入上述一抗孵育過夜，洗膜后，再加入二抗溫孵育1 h，洗膜，化學發(fā)光法檢測并X 線膠片曝光顯影，應用ImageJ 軟件進行灰度值分析。

1.8統(tǒng)計方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間差異通過單因素方差分析并采用LSD-t法進行多重比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1軟骨細胞的免疫熒光染色鑒定倒置熒光顯微鏡下觀察到細胞質經Ⅱ型膠原免疫熒光染色后發(fā)出鮮亮的紅色熒光（見圖1-a），為強陽性表現(xiàn)，證實為軟骨細胞，細胞核未著色，表明Ⅱ型膠原蛋白在細胞核內無表達。幾乎所有細胞經DAPI 染色后細胞核均發(fā)出藍色熒光（見圖1-b）。圖1-c 為圖1-a和圖1-b的疊加，絕大多數(shù)細胞表達Ⅱ型膠原蛋白，證明提取的軟骨細胞純度高。

圖1 軟骨細胞Ⅱ型膠原的免疫熒光染色Figure 1 Immunofluorescence staining results for typeⅡcollagen in chondrocytes

圖2 各組軟骨細胞形態(tài)比較（×100）Figure 2 Comparison of the morphological features of chondrocytes in various groups（×100）

圖3 各組軟骨細胞MMP3、SOX9、A-CAN、ADAMTS4、ADAMTS5基因表達比較（±s）Figure 3 Comparison of the expression levels of MMP3，SOX9，A-CAN，ADAMTS4，ADAMTS5 genes in chondrocytes of various groups（±s）

2. 2各組軟骨細胞形態(tài)比較倒置顯微鏡下可見：正常對照組軟骨細胞呈三角形、多角形，形態(tài)飽滿，融合后呈“鋪路石”樣；與正常對照組比較，IL-1β組及各濃度中藥膝痹通絡方組軟骨細胞形態(tài)明顯細長、單薄，呈長梭形改變，呈明顯的退變形態(tài)，但各濃度中藥組軟骨細胞退變形態(tài)較IL-1β組減輕。見圖2。

2. 3各組軟骨細胞MMP3、SOX9、A-CAN、ADAMTS4、ADAMTS5基因表達比較圖3 結果顯示：與正常對照組比較，IL-1β 組軟骨細胞MMP3、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05），SOX9、A-CAN mRNA 表達水平降低（P＜0.05）；與IL-1β 組比較，各濃度中藥組軟骨細胞MMP3、ADAMTS4、ADAMTS5 mRNA表達水平明顯降低，SOX9、A-CAN mRNA 表達水平升高，其中，高濃度中藥組差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.4各組軟骨細胞MMP13、SOX9、P-Raf1、Raf1、P-MEK1、MEK1 蛋白表達比較圖4 結果顯示：與正常對照組比較，IL-1β 組軟骨細胞MMP13 蛋白表達，Raf1、MEK1磷酸化水平明顯升高，SOX9蛋白表達水平降低（均P＜0.05）。與IL-1β 組比較，各濃度中藥組MMP13蛋白表達、Raf1、MEK1磷酸化水平明顯降低，SOX9 蛋白表達水平升高（均P＜0.05）。

圖4 各組軟骨細胞MMP13、SOX9、P-Raf1、Raf1、P-MEK1、MEK1蛋白表達比較（±s）Figure 4 Comparison of the expression levels of MMP13,SOX9,P-RAF1,Raf1,P-Mek1,and MEK1 proteins in chondrocytes of various groups（±s）

3 討論

3.1 KOA的中醫(yī)學認識膝關節(jié)骨性關節(jié)炎（KOA）屬于中醫(yī)學“痹證”范疇，歷代醫(yī)家對于其論述及治法各有特色。其雖病位在筋骨，但本在于腎。老齡患者肝腎漸虧，髓枯血虛，筋骨失于濡養(yǎng)而不復堅固，損傷或復感風、寒、濕、熱等外邪時疼痛發(fā)作，久病則筋脈攣縮，無力束骨，可引起關節(jié)不穩(wěn)及屈伸不利癥狀。而血瘀則是機體衰退過程中潛在的病理因素，外傷勞損、氣候變化都可致瘀血痹阻，阻礙筋骨關節(jié)的潤養(yǎng)，加重關節(jié)的退化[3]。膝痹通絡方是蘇州市中西醫(yī)結合醫(yī)院骨科治療KOA 的經驗方，方中：杜仲、牛膝補肝腎、強筋骨；黃芪補氣健脾；當歸、川芎、白芍養(yǎng)血活血；獨活、雞血藤、秦艽、木瓜祛風除痹，舒筋通絡。全方共奏補益肝腎、活血祛瘀之功。

3.2 KOA的現(xiàn)代醫(yī)學認識現(xiàn)代醫(yī)學認為，KOA患者因為年齡增長及膝關節(jié)力線的改變，膝關節(jié)長期處于疲勞狀態(tài)，關節(jié)穩(wěn)定性下降，軟骨和半月板存在物理性磨損。而近些年來，關節(jié)滑膜的炎癥所扮演的角色越來越得到重視，滑膜炎癥的進展程度可以直接反映KOA 的嚴重程度，也是KOA 發(fā)生、發(fā)展的獨立性危險因素[4-5]。有學者對只有癥狀而無影像學改變的KOA 患者進行關節(jié)鏡隨防，發(fā)現(xiàn)約50%的患者關節(jié)鏡下有局限性滑膜炎癥表現(xiàn)，且這些患者在1年之后，都出現(xiàn)了局部軟骨破壞的表現(xiàn)[6]。在關節(jié)退變的早期即有炎癥的參與，并伴隨軟骨細胞的退變、細胞外基質的破壞。當關節(jié)滑膜受到刺激，可誘發(fā)滑膜內血管增生擴張、滑膜細胞的活躍增生等一系列反應，并釋放大量炎癥因子，侵蝕關節(jié)內軟骨，軟骨在化學性侵蝕及物理性摩擦的惡性循環(huán)下，進行性磨損、變薄甚至缺如，致關節(jié)間隙變窄，軟骨下骨質硬化。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1 是關鍵性炎性因子之一，也是炎癥發(fā)生的始動因素，可直接調節(jié)軟骨細胞MMPs的生成，抑制蛋白多糖及Ⅱ型膠原等軟骨基質的合成，促進軟骨細胞的退變及凋亡，直接導致軟骨的化學性損傷，加速骨關節(jié)炎的發(fā)生[7]。IL-1 又分IL-1α 和IL-1β 2 種亞型，其中IL-1β 是主要亞型，隨著KOA 的病情發(fā)展，關節(jié)內IL-1β可呈持續(xù)性增高，基于此，本研究采用IL-1β作為軟骨細胞退變的誘導因子，模擬KOA 患者體內軟骨退變模型。

MMPs是一個龐大的蛋白酶超家族，其家族成員能降解幾乎所有的細胞外基質，在膝關節(jié)，MMPs 可因IL-1 等炎癥因子刺激后，由軟骨細胞、滑膜細胞以及中性粒細胞產生，MMPs的過度表達，可加速軟骨細胞外基質的降解，導致關節(jié)內軟骨進行性破壞。在MMPs家族中，以MMP3和MMP13在KOA 的參與度最為突出。膝關節(jié)軟骨細胞外基質中最為主要的成分是Ⅱ型膠原，其次為蛋白多糖，MMP13 是所有MMPs 家族中降解Ⅱ型膠原蛋白能力最強的，而MMP3 對于A-CAN 又有較高的裂解活性，隨著細胞外基質的降解，軟骨的生物學特點發(fā)生改變，抗應力能力也大大下降，加速退變，因此，MMP3 和MMP13 是反映KOA 軟骨退變程度的重要標志物[8]。與MMPs 等經典蛋白酶相比，聚蛋白多糖酶家族（ADAMTSs）對KOA 的影響在近些年才逐漸受到重視，其中ADAMTS4 和ADAMTS5 是軟骨細胞外A-CAN 的主要降解酶。研究發(fā)現(xiàn)，敲除ADAMTS4和ADAMTS5基因的小鼠在誘導KOA 過程中，與正常小鼠相比，僅出現(xiàn)了輕度膝關節(jié)退變，特別是敲除ADAMTS5 基因后，小鼠軟骨缺損程度明顯輕于敲除ADAMTS4 基因及正常的小鼠[9-10]。SOX9 對軟骨細胞及細胞外基質的調節(jié)起著至關重要的作用，被稱為軟骨的“主調節(jié)因子”。SOX9 可同時調控Ⅱ型膠原及A-CAN 的表達促進軟骨細胞外基質的生成與修復，又可抑制ADAMTS4 和ADAMTS5 等聚蛋白酶以及MMPs 在KOA 早期的表達，可以說是KOA軟骨的保護器[11-12]。

3.3 MAPK-MEK信號通路在KOA中的作用IL-1等關節(jié)內炎癥因子還能誘發(fā)軟骨細胞中的一系列酶促反應，進一步加速軟骨細胞的退變，其中MAPKs 信號通路是參與骨關節(jié)炎中軟骨破壞最重要的通路之一[13]。MAPK-MEK 通路是MAPKs 家族中的經典通路，主要由Raf、MEK、ERK三級酶聯(lián)功能單位構成，當其依次被磷酸化激活后，可誘發(fā)下游更為廣泛的蛋白表達，在調節(jié)細胞生理應答過程中發(fā)揮重要作用。在膝關節(jié)中，上游的Ras活化可進一步激活Raf 蛋白，Raf 磷酸化后激活MEK1/MEK2，進而活化ERK1和ERK2，最后下游的轉錄因子進入軟骨細胞核內參與細胞的增殖、分化、鈣化等一系列生理病理過程，大大改變軟骨細胞的內環(huán)境[14]。當IL-1、TNF-α等炎癥因子與軟骨細胞膜上的受體結合或機械應力刺激后，軟骨細胞內的MAPKs 信號通路被激活，引起MMPs大量表達，導致軟骨被快速破壞，此外，該信號通路還廣泛參與軟骨細胞的凋亡、肥大、鈣化等病理過程[15]。針對MAPK-MEK 信號通路的一些治療，在臨床和實驗中也被證實是有效的。Prasadam等[16]給KOA 大鼠關節(jié)腔注射透明質酸及UO126（MAPK-MEK 通路抑制劑），結果發(fā)現(xiàn)UO126 可明顯抑制軟骨細胞肥大相關蛋白（COL10 和RUNX2）及退變相關蛋白（ADAMTs5和MMP13）的表達，延緩軟骨細胞的退化，治療效果優(yōu)于未治療組及單用透明質酸組。國內一些學者研究發(fā)現(xiàn)，電針、手法松解等中醫(yī)傳統(tǒng)醫(yī)學也可通過調節(jié)該通路，達到改善關節(jié)疼痛癥狀，延緩關節(jié)退化，以及減輕關節(jié)炎癥的目的[17-18]。

3.4膝痹通絡方治療KOA的機制探討膝痹通絡方為我院經驗方，臨床療效肯定。本研究從細胞分子生物學角度，對其治療機制進行了探索。本研究在軟骨細胞培養(yǎng)液中加入IL-1β，模擬軟骨細胞退變，顯微鏡下直觀可見細胞形態(tài)明顯發(fā)生改變，與正常組相比呈扁平、狹長的退化形態(tài)。進一步以qPCR 和Western Blot 法檢測相關基因及蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)MMPs、ADAMTs 等促軟骨細胞退變的蛋白酶水平明顯上升，而抑軟骨細胞退變的轉錄因子SOX9 及A-CAN 表達水平明顯下降，與既往研究[7]結果相符。而加入不同濃度膝痹通絡方含藥血清組的軟骨細胞雖也呈現(xiàn)退化狀態(tài)，但整體狀態(tài)優(yōu)于IL-1β組。表明膝痹通絡方可一定程度抑制IL-1β 所致的軟骨細胞MMPs、ADAMTs 的過表達，亦可緩解IL-1β對SOX9、A-CAN 的抑制作用。

基于MAPK-MEK信號通路在KOA發(fā)病過程中的重要作用，本研究進一步觀察膝痹通絡方含藥血清對該信號通路的影響。MAPK-MEK 信號通路的活性主要取決于通路中相關磷酸化蛋白的水平，而非總蛋白含量。本研究中，軟骨細胞經IL-1β誘導后Raf1、MEK 磷酸化水平顯著增高，證實了IL-1β 可上調MAPK-MEK 信號通路的活性，而各濃度中藥組軟骨細胞Raf1 和MEK 磷酸化水平較IL-1β組明顯下降，提示膝痹通絡方含藥血清可抑制IL-1β 所誘導的MAPK-MEK 信號通路的過度活躍。

綜上所述，膝痹通絡方含藥血清可抑制IL-1β誘導的軟骨細胞的退變，保護軟骨細胞，其具體機制可能是抑制了IL-1β 所致的MAPK-MEK 信號通路的過度活躍。但本實驗僅為體外實驗，軟骨細胞在體內和體外的生物學活性可能存在一定差異，因此需進一步通過動物體內實驗驗證本方的有效性和安全性，這也是本課題組下一步的研究計劃。