腎氣丸對膝骨性關(guān)節(jié)炎模型大鼠炎癥因子和軟骨基質(zhì)的影響

李梓灝， 黃剛， 嚴(yán)偉健， 胡贏， 謝家豪

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；2.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東廣州 510000）

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種以膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解、軟骨退變、滑膜無菌性炎癥以及繼發(fā)骨贅形成為主要特征的慢性退行性病變[1]，主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹畸形、活動(dòng)受限，是中老年人群除心腦血管疾病以外致殘的最主要原因[2]。調(diào)查顯示，我國中老年人群KOA的發(fā)病率為12%～15%，女性高于男性[3]。隨著我國步入老齡化社會(huì)，KOA 的發(fā)病率和致殘率呈現(xiàn)直線上升的趨勢，不僅影響患者的生活質(zhì)量，也對家庭和社會(huì)造成嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素9（IL-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、Ⅱ型膠原、雌二醇（E2）在KOA 的發(fā)生、發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用[4-7]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為KOA 的核心病機(jī)是肝腎虧虛。腎氣丸出自《金匱要略》，具有補(bǔ)益肝腎的功效，本團(tuán)隊(duì)臨床應(yīng)用腎氣丸治療KOA 患者，發(fā)現(xiàn)其可降低患者血清炎癥因子水平，改善膝關(guān)節(jié)功能，緩解膝關(guān)節(jié)疼痛，增加膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度，提高生活質(zhì)量，但其具體機(jī)制尚不明確。因此，本研究建立了KOA 大鼠模型，觀察腎氣丸對KOA 大鼠膝關(guān)節(jié)寬度、膝關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)度、滑膜厚度、壓痛閾值、熱痛閾值和關(guān)節(jié)軟骨中的TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9、Ⅱ型膠原、E2 的影響，以期闡明腎氣丸防治KOA 的作用和機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級健康SD 大鼠40 只，體質(zhì)量（210±10）g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號：SCXK（粵）2018-0002。本實(shí)驗(yàn)于廣東省中醫(yī)院中醫(yī)藥科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20 ～25 ℃，濕度40%～60%，光照周期12 h/12 h。

1.2試劑與儀器木瓜蛋白酶（上海源葉生物科技有效公司）；TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（美國GeneTex 公司）；IL-1β、IL-9 ELISA試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司）；MMP-3、MMP-9 ELISA 試劑盒（美國ScienCell 研究實(shí)驗(yàn)室）；Ⅱ型膠原ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；E2 ELISA 試劑盒（上海歌凡生物科技有限公司）。爪觸覺測試儀（意大利Ugo Basile 公司）；YLS-3E 型電子壓痛儀（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；BW-Plantar390 足底熱測痛儀（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；Multiskan Sky 全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；關(guān)節(jié)測量尺、游標(biāo)尺（上海益聯(lián)醫(yī)學(xué)儀器發(fā)展有限公司）；ESJ30-5A/B 電子天平（沈陽神宇龍騰天平有限公司）。

1. 3腎氣丸組成及制備腎氣丸由熟地黃15 g、山藥30 g、山茱萸15 g、澤瀉10 g、茯苓10 g、牡丹皮10 g、桂枝10 g、熟附子10 g組成。上述中藥飲片由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房提供，加4 倍量的水分別煎煮2 次，濾渣取液，2 次藥液混合后濃縮至含生藥0.23 g·mL-1，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4動(dòng)物分組、造模和給藥40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)表隨機(jī)分為正常組（10只）和造模組（30 只）。造模組大鼠參照Panicker 等[8]的方法建立KOA 模型：將大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)上，雙膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射40 g/L木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，每2 d 1 次，共注射2 周。正常組大鼠僅對膝關(guān)節(jié)腔注射生理鹽水。造模期間均自由飲食和飲水。2周后，進(jìn)行膝關(guān)節(jié)X線片檢查，若X 線片可見膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)骨面欠光滑、不平整，且關(guān)節(jié)間隙狹窄，則提示造模成功。結(jié)果顯示造模組36 只大鼠造模成功。隨后將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組（9 只）、中藥組（9只）、西藥組（9只）。參照劑量-體表面積換算方法，中藥組給予腎氣丸11.55 g·kg-1·d-1灌胃，分2 次進(jìn)行，西藥組給予氨基葡萄糖生理鹽水溶液157.5 g·kg-1·d-1灌胃，分2 次進(jìn)行，正常組和模型組給予等體積（3 mL）的生理鹽水灌胃，灌胃時(shí)間為8周。

1.5觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 測量膝關(guān)節(jié)厚度、被動(dòng)活動(dòng)度 末次給藥禁食禁飲12 h 后，用游標(biāo)尺測量大鼠膝關(guān)節(jié)寬度，用關(guān)節(jié)測量尺測量膝關(guān)節(jié)的最大屈曲角度和最大伸直角度，計(jì)算被動(dòng)關(guān)節(jié)活動(dòng)度，被動(dòng)關(guān)節(jié)活動(dòng)度=最大屈曲角度-最大伸直角度。

1.5.2 測量膝關(guān)節(jié)滑膜厚度 麻醉處死大鼠后，打開膝關(guān)節(jié)腔取關(guān)節(jié)滑膜組織，用螺旋測微器測量膝關(guān)節(jié)滑膜厚度。

1.5.3 測定壓痛閾值、熱痛閾值 將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上，壓痛儀的扁形頭壓大鼠的患側(cè)足背，當(dāng)大鼠掙扎時(shí)即為壓痛閾值。將熱痛儀置于大鼠的足底中央，打開計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)，當(dāng)大鼠掙扎抬腿時(shí)所用的時(shí)間即為熱痛閾值。

1. 5. 4 檢測關(guān)節(jié)液中TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9、Ⅱ型膠原、E2水平 常規(guī)消毒膝關(guān)節(jié)后，用5 mL 注射液抽取1.5 mL 生理鹽水注射進(jìn)大鼠的膝關(guān)節(jié)腔，反復(fù)活動(dòng)膝關(guān)節(jié)20 次，緩慢抽取膝關(guān)節(jié)液，離心后取上清液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩０凑照f明書采用ELISA 法檢測關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9、Ⅱ型膠原、E2的含量。

1.6統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1正常組和造模組大鼠膝關(guān)節(jié)X線檢查結(jié)果比較圖1結(jié)果顯示：正常組膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨厚度正常，關(guān)節(jié)間隙無狹窄；模型組膝關(guān)節(jié)間隙明顯變窄，關(guān)節(jié)軟骨變薄，輕度骨刺，關(guān)節(jié)面硬化。提示造模成功。

圖1 正常組和KOA造模組大鼠膝關(guān)節(jié)X線檢查結(jié)果比較Figure 1 Comparison of X-ray examination results in the control group and KOA modeling group

2.2各組大鼠膝關(guān)節(jié)厚度、關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)度、滑膜厚度的比較表1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠的膝關(guān)節(jié)厚度、滑膜厚度顯著增加（P<0.05），關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)度顯著減?。≒<0.05）；與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠的膝關(guān)節(jié)厚度、滑膜厚度均顯著減?。≒<0.05），關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)度均顯著增加（P< 0.05），且2 個(gè)治療組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)厚度、關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)度、滑膜厚度的比較Table 1 Comparison of the knee joint space width，passive knee joint range of motion，thickness of synovial membrane in various groups （±s）

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)厚度、關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)度、滑膜厚度的比較Table 1 Comparison of the knee joint space width，passive knee joint range of motion，thickness of synovial membrane in various groups （±s）

①P<0.05，與正常組比較；②P<0.05，與模型組比較

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2.3各組大鼠壓痛閾值、熱痛閾值的比較表2結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠的壓痛閾值、熱痛閾值降低（P<0.05）；與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠的壓痛閾值、熱痛閾值顯著升高（P<0.05），且2 個(gè)治療組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4各組大鼠關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、IL-9含量的比較表3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠的關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、IL-9 含量顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，中藥組、西藥組大鼠的關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、IL-9含量顯著降低（P<0.05），且2 個(gè)治療組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表2 各組大鼠壓痛閾值、熱痛閾值的比較Table 2 Comparison of the tenderness threshold and thermal pain threshold in various groups （±s）

表2 各組大鼠壓痛閾值、熱痛閾值的比較Table 2 Comparison of the tenderness threshold and thermal pain threshold in various groups （±s）

①P<0.05，與正常組比較；②P<0.05，與模型組比較

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表3 各組大鼠關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、IL-9含量比較Table 3 Comparison of the contents of TNF-α，IL-1β and IL-9 in synovial fluid of various groups （±s，pg·mL-1）

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)液TNF-α、IL-1β、IL-9含量比較Table 3 Comparison of the contents of TNF-α，IL-1β and IL-9 in synovial fluid of various groups （±s，pg·mL-1）

①P<0.05，與正常組比較；②P<0.05，與模型組比較

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2.5各組大鼠關(guān)節(jié)液MMP-3、MMP-9、Ⅱ型膠原、E2含量的比較表4 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠的關(guān)節(jié)液MMP-3、MMP-9含量顯著升高（P< 0.05），Ⅱ型膠原、E2 含量顯著降低（P<0.05）；對模型組比較，中藥組、西藥組大鼠的關(guān)節(jié)液MMP-3、MMP-9 含量顯著降低（P< 0.05），Ⅱ型膠原、E2 含量顯著升高（P<0.05），且2 個(gè)治療組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）的主要病理機(jī)制是膝關(guān)節(jié)軟骨的退行性病變，多種因素均通過破壞關(guān)節(jié)軟骨引起KOA。

炎癥反應(yīng)、軟骨基質(zhì)在KOA 中起到重要的作用。KOA 是一種無菌性炎癥，以TNF-α、IL-1β、IL-9 升高為主要表現(xiàn)。TNF-α 可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的降解，破壞軟骨細(xì)胞，導(dǎo)致骨贅形成[9]。IL-1β 由軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌生成，可以促進(jìn)滑膜細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)Ⅱ型膠原蛋白合成和強(qiáng)度下降，促進(jìn)滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞生成前列腺素E2 和膠原酶，引起滑膜炎癥和軟骨基質(zhì)降解。研究[10]發(fā)現(xiàn)，KOA患者血清或關(guān)節(jié)液中IL-1β的表達(dá)較正常人群顯著升高。IL-9主要由單核細(xì)胞分泌，可以引起軟骨細(xì)胞死亡和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解。研究[11]發(fā)現(xiàn)，KOA患者血清中的TNF-α、IL-1β、IL-9水平較正常健康者顯著升高，提示炎癥因子是引起KOA 的重要危險(xiǎn)因素。Ⅱ型膠原是軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，KOA 患者中Ⅱ型膠原降解增多，而合成減少，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)破壞?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）可以促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解、抑制蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白的合成，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞變性和軟骨缺損。MMP-3 和MMP-9 是MMPs 的主要成員，主要在KOA 患者的滑膜細(xì)胞中表達(dá)，是引起KOA 的重要原因之一。研究發(fā)現(xiàn)，MMP-3 和MMP-9 在KOA 患者軟骨組織中高度表達(dá)，而Ⅱ型膠原表達(dá)顯著減少[12]，提示MMP-3和MMP-9可引起軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分Ⅱ型膠原蛋白和蛋白多糖降解，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞、退變。E2 可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化，促進(jìn)Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的合成，保護(hù)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，對膝關(guān)節(jié)具有重要的保護(hù)作用[13]。

KOA屬于中醫(yī)學(xué)“痹癥”“骨痹”的范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎主骨生髓”“肝主筋，為罷極之本”“腎之和，骨也”“膝為筋之府”。KOA的核心基礎(chǔ)為年老體虛、肝腎虧虛[14]。人至中老年，肝腎逐漸虧虛，腎虛不能主骨生髓，骨不得腎陰滋養(yǎng)，引起骨質(zhì)脆弱而無法生長，肝主筋，肝血虧虛，不能濡養(yǎng)筋脈，不榮則痛。正氣虧虛于內(nèi)，風(fēng)寒濕邪侵襲，或瘀血內(nèi)生，痹阻筋脈，是本病發(fā)作的重要誘因。寒濕內(nèi)侵或瘀血內(nèi)生而痹阻筋脈，引起關(guān)節(jié)腫脹畸形，這與TNF-α、IL-1β、IL-9 等引起關(guān)節(jié)軟骨膝關(guān)節(jié)骨贅形成，關(guān)節(jié)腔間隙狹窄的病理表現(xiàn)不謀而合?！案沃鹘蠲}”“腎主骨”，KOA患者肝腎虧虛，無以濡養(yǎng)筋脈，與膝關(guān)節(jié)液Ⅱ型膠原蛋白、E2水平降低和MMP-3、MMP-9導(dǎo)致軟骨基質(zhì)破壞、降解不謀而合。因此，TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3 和MMP-9 在一定程度上代表了KOA的致病因子，Ⅱ型膠原蛋白和E2在一定程度上反映了KOA患者的正氣和肝腎功能的強(qiáng)弱。

治病必求于本，因此，KOA 治療主要在于補(bǔ)益肝腎以強(qiáng)筋骨，正所謂“正氣存內(nèi)，邪不可干”。腎氣丸為補(bǔ)益肝腎的經(jīng)典名方，方中：附子大辛大熱，溫陽助火，桂枝辛溫，補(bǔ)腎陽，主氣化，通血脈，附子和桂枝合用，寓陽中求陰之意；熟地黃滋陰補(bǔ)腎生精，山藥養(yǎng)脾生精，吳茱萸助陽生精，熟地黃、山藥、吳茱萸重用以滋補(bǔ)肝腎陰精；澤瀉、茯苓淡滲利濕，牡丹皮活血化瘀，合桂枝可溫通血脈。諸藥合用，共奏補(bǔ)益肝腎，兼活血化瘀、淡滲利濕之功。本研究結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組大鼠的膝關(guān)節(jié)寬度和滑膜厚度增加，膝關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)度、壓痛閾值、熱痛閾值減小，關(guān)節(jié)液中的TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9含量升高，Ⅱ型膠原、E2含量降低；與模型組比較，中藥組大鼠的膝關(guān)節(jié)寬度和滑膜厚度減小，膝關(guān)節(jié)被動(dòng)活動(dòng)度、壓痛閾值、熱痛閾值增加，關(guān)節(jié)液中的TNF-α、IL-1β、IL-9、MMP-3、MMP-9含量降低，Ⅱ型膠原、E2含量升高。表明腎氣丸可以緩解KOA 疼痛，減輕關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng)，抑制骨質(zhì)增生，抑制軟骨基質(zhì)的降解。

綜上所述，腎氣丸可以通過抑制關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng)，抑制關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解有效減輕KOA 大鼠軟骨損傷，改善膝關(guān)節(jié)功能。

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)液MMP-3、MMP-9、Ⅱ型膠原、E2含量的比較Table 4 Comparison of the contents of MMP-3，MMP-9，typeⅡcollagen，E2 in synovial fluid of various groups（±s）

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)液MMP-3、MMP-9、Ⅱ型膠原、E2含量的比較Table 4 Comparison of the contents of MMP-3，MMP-9，typeⅡcollagen，E2 in synovial fluid of various groups（±s）

①P<0.05，與正常組比較；②P<0.05，與模型組比較

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