苦蕎清蛋白酶解物對高糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的保護(hù)作用

費 燁，王 雍，龔仕英，田 艷，王筑婷，雷霆雯，張禮林，汪希蘭，李紅梅,*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

糖尿病是由胰島素分泌不足或胰島素抵抗（insulin resistance，IR）引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝失調(diào)綜合征[1]。它是一種慢性內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，主要表現(xiàn)為長期高血糖。糖尿病主要分為1型和2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM），其中T2DM占所有糖尿病病例的90%～95%[2]。近幾十年來，全球T2DM患病率持續(xù)以驚人的速度增長。目前，全球約有3 710萬 人患有T2DM，其中中國和美國患者分別占總量的11.6%和11.3%[3]。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會（international diabetes federation，IDF）估計，到2030年，全球T2DM患者人數(shù)將達(dá)到3.42億，并且年輕人的患病率將會增高[4]。因此，T2DM的防治已成為一個嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題。

T2DM的主要病因是IR，IR在T2DM的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。IR的特征是胰島素調(diào)節(jié)和功能受損，正常水平的胰島素?zé)o法在靶組織（如肝臟、脂肪和骨骼?。┲幸鸬湫偷囊葝u素反應(yīng)[5]。當(dāng)體內(nèi)出現(xiàn)IR時，胰島素敏感組織對葡萄糖的利用率下降，導(dǎo)致糖尿病[6]。大量的研究表明氧化應(yīng)激是導(dǎo)致IR的關(guān)鍵因素[7]，因此通過抗氧化改善IR是T2DM的一種防治策略。

苦蕎（tartary buckwheat）學(xué)名韃靼蕎麥，別名萬年蕎、野蘭蕎、蕎葉七，隸屬于蓼科蕎麥屬（FagoPyrum tataricum Gaertn.），與何首烏、大黃等同屬蓼科，是我國藥食同源文化的典型體現(xiàn)，具有很高的食藥兩用價值?？嗍w營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維、黃酮類化合物和多種微量礦物質(zhì)元素等營養(yǎng)物質(zhì)[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)苦蕎蛋白具有降膽固醇、抑制脂肪蓄積、抗衰老、抑制大腸癌和乳腺癌、抑制膽結(jié)石等作用[10]。本課題組前期采用堿性蛋白酶酶解苦蕎清蛋白后發(fā)現(xiàn)酶解物具有體外抗氧化活性[11]，并且分子質(zhì)量小于3 kDa的酶解物抗氧化活性最強(qiáng)。因此本研究將苦蕎清蛋白酶解物（tartary buckwheat albumin hydrolysate，TBAH）超濾后，采用分子質(zhì)量小于3 kDa的TBAH作用于高糖高胰島素誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系HepG2 IR模型，探討TBAH對細(xì)胞IR的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細(xì)胞株（HepG2細(xì)胞） 上海細(xì)胞庫；苦蕎粉貴州威寧苦蕎專賣店。

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清 美國HyClone公司；乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；胰島素受體底物1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）（Ser407）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）、β-肌動蛋白（β-actin） 美國Proteintech公司；磷酸化IRS-1（phosphorylated IRS-1，p-IRS-1）（Ser307） 北京Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulins G，IgG）、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 美國Jackson Immuno Research公司；羅格列酮、重組人胰島素 北京Solarbio公司；堿性蛋白酶南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本松下公司；制膠器及電轉(zhuǎn)移裝置、DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠；多功能酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；Syngene凝膠成像儀 美國基因有限公司；熒光倒置顯微鏡 日本尼康公司；氨基酸自動分析儀 德國Sykam公司。

1.3 方法

1.3.1 苦蕎清蛋白的制備

按1∶1（m/V）的比例用正己烷溶解苦蕎粉48 h以脫脂，然后將已脫脂苦蕎粉按1∶10（m/V）的比例加入ddH2O，攪拌2 h，4 ℃、6 000 r/min離心15 min，取上清液用1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5，以利于苦蕎清蛋白充分沉淀，蛋白沉淀用ddH2O沖洗2 次后用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)至中性，置于真空冷凍干燥機(jī)除去水分，由此制得苦蕎蛋白粉末[12]。

1.3.2 TBAH的制備

準(zhǔn)確稱取一定量的苦蕎蛋白凍干粉，用ddH2O溶解配制3%的底物溶液。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至10.0，加入堿性蛋白酶（酶與底物質(zhì)量比為5%）45 ℃孵育4 h，反應(yīng)完成后將酶解液置于100 ℃沸水浴中滅酶10 min，冷卻后6 000 r/min離心10 min，收集上清液即得TBAH。采用截留分子質(zhì)量為3 kDa的超濾管對TBAH進(jìn)行截留分離，收集分子質(zhì)量不大于3 kDa的組分，凍干成粉末，－20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 TBAH的氨基酸組成

凍干后的TBAH加入6 mol/L HCl溶液混勻，放入液氮中冷凍，然后110 ℃水解24 h，冷卻后用0.45 μm濾膜過濾，然后真空干燥，加入pH 2.2樣品緩沖液溶解，0.22 μm濾膜過濾，隨后通過氨基酸自動分析儀進(jìn)行分析。

1.3.4 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

利用含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2飽和濕度下對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化、傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.5 HepG2細(xì)胞IR模型建立

將處于對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞，加新鮮培養(yǎng)液吹打成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個/mL，均勻接種于48 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，更換為無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，然后更換為含1 μmol/L胰島素和25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，設(shè)置3 個復(fù)孔并設(shè)無胰島素空白孔。經(jīng)37 ℃、5% CO2孵育36 h后檢測培養(yǎng)基上清液的葡萄糖含量。以空白孔葡萄糖含量減去樣品孔葡萄糖含量計算出各孔細(xì)胞的葡萄糖消耗量[13]。

1.3.6 葡萄糖消耗實驗

實驗分為6 組：正常對照組（Control）、IR模型組、低質(zhì)量濃度苦蕎蛋白酶解肽組（2.5 μg/mL TBAH，L-TBAH）、中質(zhì)量濃度苦蕎蛋白酶解肽組（5 μg/mL TBAH，M-TBAH）、高質(zhì)量濃度苦蕎蛋白酶解肽組（10 μg/mL TBAH，H-TBAH）、羅格利酮陽性對照組（4 μg/mL，RGT）。TBAH各組的劑量根據(jù)葡萄糖消耗實驗確定，羅格列酮的劑量參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。建模完成后將48 孔培養(yǎng)板中舊培養(yǎng)液去除，正常對照組、IR模型組更換正常DMEM培養(yǎng)液。藥物干預(yù)組分別給予相應(yīng)濃度的藥物處理24 h。24 h后采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測定每孔細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，通過與未接種細(xì)胞DMEM葡萄糖濃度平均值相減，計算每孔細(xì)胞葡萄糖的含量。

1.3.7 氧化損傷標(biāo)志物活性及含量的檢測

收集各組細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解1 h，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清液，細(xì)胞內(nèi)總蛋白水平采用BCA法測定，SOD、LDH活力、MDA、NO含量的測定按照相應(yīng)試劑盒說明書操作。

1.3.8 ROS水平檢測

按照ROS試劑盒說明書操作。建模完成以后每孔加入母液DCFH-DA于培養(yǎng)基，使其濃度為10 μmol/L，37 ℃孵育細(xì)胞1 h。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞3 min，加入培養(yǎng)基終止消化，制成細(xì)胞懸液，1 000×g離心5 min收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，離心收集細(xì)胞沉淀物用于熒光檢測。將收集好的細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液重懸，計數(shù)，并用于檢測。波長設(shè)置：最佳激發(fā)波長500、485 nm，最佳發(fā)射波長525 nm。孵育完畢，未消化的細(xì)胞使用熒光倒置顯微鏡記錄拍照。

1.3.9 IRS-1、Akt、PI3K、GLUT4、p-IRS-1、p-Akt蛋白表達(dá)水平檢測

提取各組細(xì)胞蛋白，采用BCA法蛋白定量后，取蛋白樣品15 μg進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉、加入IRS-1、Akt、PI3K、GLUT4、p-IRS-1、p-Akt抗體孵育。洗滌之后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，孵育，洗滌后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑反應(yīng)，曝光后掃描，采用Image J軟件進(jìn)行光密度分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗重復(fù)3 次，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用方差齊性檢驗和單因素方差分析對多組進(jìn)行比較，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 TBAH的氨基酸組成

表1 分子質(zhì)量小于3 kDa TBAH的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of TBAH (＜ 3 kDa)

由表1可知，TBAH富含谷氨酸（Glu）和精氨酸（Arg），質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為14.47%和14.13%，其他帶電荷的極性氨基酸如天冬氨酸（Asp）、組氨酸（His）和賴氨酸（Lys），質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.58%、6.79%和6.83%，酸性氨基酸和堿性氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為49.80%；總的非極性疏水性氨基酸（甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile））的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.78%；芳香族氨基酸中苯丙氨酸（Phe）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.67%，酪氨酸（Tyr）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.00%；而含硫氨基酸量很少，如甲硫氨酸（Met）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.93%，半胱氨酸（Cys）質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.17%。

2.2 TBAH對IR HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗的影響

如表2所示，在HepG2細(xì)胞中，25 mmol/L葡萄糖和1 μmol/L胰島素聯(lián)合作用36 h可顯著降低葡萄糖消耗量，IR組較正常對照組葡萄糖消耗量下降66%，表明高糖高胰島素可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞IR。羅格列酮和TBAH作用后可提高葡萄糖消耗，TBAH的作用更強(qiáng)，并且呈劑量依賴性。結(jié)果表明TBAH可以減輕IR。

表2 TBAH對HepG2細(xì)胞IR的影響（n＝3）Table 2 Effect of TBAH on insulin resistance in HepG2 cells (n= 3)

2.3 TBAH對IR HepG2細(xì)胞氧化指標(biāo)的影響

表3 TBAH對IR HepG2細(xì)胞氧化指標(biāo)的影響（n＝3）Table 3 Effect of TBAH on oxidative stress indices in HepG2 cells with insulin resistance (n= 3)

如表3所示，25 mmol/L葡萄糖和1 μmol/L胰島素孵育HepG2細(xì)胞36 h，導(dǎo)致MDA、NO和ROS水平升高，同時SOD活力下降，LDH活力升高，說明在IR時氧化應(yīng)激增強(qiáng)。與IR模型組相比，羅格列酮和TBAH可顯著降低MDA、NO和ROS水平（表3和圖1），同時提高SOD活力，降低LDH活力。TBAH對SOD的影響呈劑量依賴性。結(jié)果表明TBAH能改善IR的氧化損傷。

圖1 TBAH對IR HepG2細(xì)胞中ROS的影響Fig.1 Effect of TBAH on ROS generation in HepG2 cells with insulin resistance

2.4 TBAH對IRS-1/PI3K/Akt胰島素信號通路的影響

圖2 TBAH對IR HepG2細(xì)胞IRS-1/PI3K/Akt信號通路的影響Fig.2 Effect of TBAH on IRS-1/PI3K/Akt signaling pathway in HepG2 cells with insulin resistance

如圖2所示，高糖高胰島素誘導(dǎo)的IR模型中，p-IRS-1（Ser307）表達(dá)水平增加，說明IR的發(fā)生與IRS-1的磷酸化調(diào)節(jié)密切相關(guān)，而羅格列酮和TBAH能明顯地逆轉(zhuǎn)這種變化。其次，IR模型中，PI3K、p-Akt表達(dá)水平降低，而羅格列酮和TBAH能促進(jìn)PI3K、p-Akt的表達(dá)，結(jié)果提示TBAH對IR的改善可能與細(xì)胞中Akt蛋白的磷酸化調(diào)節(jié)有關(guān)。與IR模型組相比，羅格列酮和TBAH能促進(jìn)GLUT4蛋白的表達(dá)，其中TBAH對GLUT4的影響呈劑量依賴性，說明TBAH通過促進(jìn)GLUT4的表達(dá)提供細(xì)胞對葡萄糖的利用，從而降低血糖。

3 討 論

因為氧化應(yīng)激是IR發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，因此，一些抗氧化劑用于改善IR和治療T2DM。如N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是一種有效的自由基清除劑，已被證實可以降低高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的高血糖和高胰島素血癥，并改善IR[15]。近年來，蛋白水解物以其多種生物活性和高度的安全性引起眾多研究者的關(guān)注[16]。研究認(rèn)為生物活性肽的生物活性取決于它們的氨基酸組成和序列[17]。在具有抗氧化活性的生物活性肽中，含有羧基或氨基的氨基酸，如酸性氨基酸Glu、Asp和堿性氨基酸Arg、Lys和His可通過其電離基團(tuán)與自由基相互作用，從而清除自由基，His的咪唑基還能通過提供電子將自由基轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定分子而使自由基失活[18]。疏水氨基酸（Ala、Val、Gly、Ile和Leu）和芳香族氨基酸（如Tyr和Phe）可以通過直接電子轉(zhuǎn)移或與疏水性靶點（如脂肪酸和細(xì)胞膜）相互作用來促進(jìn)肽的自由基清除活性[19]。在本實驗中，TBAH富含Glu（14.47%）和Arg（14.13%），此外，酸性氨基酸和堿性氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到49.80%，非極性疏水性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.78%，說明TBAH含有豐富的抗氧化氨基酸。在IR細(xì)胞模型實驗中，TBAH能降低氧化物MDA、NO和ROS的含量，同時提高了抗氧化酶SOD的活力，降低了氧化酶LDH的活力。說明TBAH能通過清除ROS來增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化活性。

IR是T2DM的主要發(fā)病原因，IR的特征是葡萄糖消耗減少[20]。當(dāng)體內(nèi)出現(xiàn)IR時，胰島素敏感組織對葡萄糖的利用率下降，導(dǎo)致糖尿病[21]。本實驗采用高糖高胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立IR模型，發(fā)現(xiàn)25 mmol/L葡萄糖聯(lián)合1 μmol/L胰島素孵育細(xì)胞36 h后，葡萄糖消耗減少，而TBAH能增加細(xì)胞對葡萄糖的消耗，且呈劑量依賴性，提示TBAH可阻礙IR的發(fā)展。

在正常細(xì)胞中，胰島素主要通過PI3K/Akt信號途徑調(diào)節(jié)葡萄糖代謝[22-23]。當(dāng)血糖水平升高，胰島素結(jié)合并激活胰島素受體，促進(jìn)IRS-1的酪氨酸磷酸化，從而激活PI3K和Akt，調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運和代謝[24-25]。此外，激活的PI3K/Akt信號途徑促進(jìn)GLUT4向細(xì)胞膜的運輸，促進(jìn)葡萄糖攝入到細(xì)胞中，并最終降低血糖水平[26]。研究認(rèn)為IR的形成主要是由于胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受阻，或者通路中關(guān)鍵蛋白作用減弱而使胰島素不能發(fā)揮其正常的生理作用[27]。IRS蛋白的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化被認(rèn)為是IR的分子基礎(chǔ)[28-29]，IRS-1的絲氨酸磷酸化，特別是Ser307和Ser636/639上的絲氨酸磷酸化后，可抑制IRS-1的酪氨酸磷酸化[30]。在本研究中，TBAH可逆轉(zhuǎn)高糖高胰島素引起的IRS-1蛋白Ser307磷酸化水平的升高，調(diào)節(jié)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活PI3K/Akt信號通路增加GLUT4的表達(dá)，從而增加細(xì)胞對葡萄糖的攝取。

綜上所述，在高糖高胰島素誘導(dǎo)的IR中，TBAH可防止HepG2細(xì)胞氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，通過抑制IRS-1蛋白Ser307磷酸化，激活PI3K/Akt信號通路，增加GLUT4的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞對葡萄糖的攝取，從而改善IR。