堿性蛋白酶限制性酶解對(duì)藍(lán)圓鲹分離蛋白功能特性的影響

孫樂常，劉偉峰，林怡晨，趙阿云，張凌晶，翁 凌，曹敏杰,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程中心，福建 廈門 361021；3.海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

海洋魚類水產(chǎn)品肌肉具有高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)，其蛋白中必需氨基酸含量高、分布均衡，是理想的優(yōu)質(zhì)食物蛋白。2017年，我國海洋魚類產(chǎn)量951.74萬 t，其中海洋捕撈魚類產(chǎn)量820.85萬 t，而低值經(jīng)濟(jì)魚類年捕撈量則高達(dá)412.35萬 t，占總海洋魚類捕撈量的50.23%[1]。隨著海洋捕撈資源的日益匱乏，如何高效利用與開發(fā)低值海洋經(jīng)濟(jì)魚類的優(yōu)質(zhì)蛋白資源是當(dāng)前水產(chǎn)品精深加工領(lǐng)域研究的重點(diǎn)[2]。

目前，國內(nèi)外針對(duì)水產(chǎn)魚類蛋白的開發(fā)與應(yīng)用主要是通過多酶或單酶的酶解方法，制備具有抗氧化活性[3]、礦物質(zhì)離子螯合活性[4]、降血壓活性[5]以及抗凝血活性[6]功能的小分子生物活性肽。另一方面，通過一定的加工手段對(duì)蛋白進(jìn)行修飾改性，可顯著提高蛋白的乳化性、溶解性、分散性以及起泡性等功能特性，將其作為新型蛋白配料應(yīng)用于各類食品中，能進(jìn)一步改善食品的品質(zhì)[7-11]。其中，利用商業(yè)化蛋白酶對(duì)蛋白原料進(jìn)行一定程度的限制性酶解是蛋白修飾改性的主要手段之一。迄今為止，限制性酶法改性研究多集中在植物蛋白方面，如：Klost等[7]通過胰蛋白酶水解以改善豌豆分離蛋白的溶解度和乳液的整體穩(wěn)定性；Thaiphanit等[8]在堿性蛋白酶對(duì)椰子蛋白進(jìn)行處理時(shí)發(fā)現(xiàn)酶解蛋白的水解度（degree of hydrolysis，DH）為8.25%～10.17%的蛋白乳化活性最好，說明特定的限制性酶解能有效提高蛋白的功能特性。類似結(jié)果在國內(nèi)也有研究報(bào)道，如Xu Xingfeng等[9]發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶酶解可以顯著改善稻谷蛋白的功能特性。目前對(duì)于酶解提升動(dòng)物蛋白功能特性的研究主要集中在蛋清蛋白[10]與乳清蛋白[11]，而關(guān)于酶解對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物肌肉蛋白功能特性的影響則鮮見報(bào)道。

藍(lán)圓鲹是我國重要的低值海洋經(jīng)濟(jì)魚類之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年藍(lán)圓鲹全國捕撈總量達(dá)53.52萬 t，其中福建省捕撈量為24.37萬 t，位居全國首位[1]。前期研究發(fā)現(xiàn)，采用等電點(diǎn)沉淀制備得到的藍(lán)圓鲹堿分離蛋白不僅營養(yǎng)價(jià)值與消化性高，而且無明顯魚腥等不良?xì)馕?，具有很好的開發(fā)前景[12]。本研究擬以藍(lán)圓鲹堿分離蛋白為對(duì)象，采用堿性蛋白酶限制性酶解制備酶解蛋白，研究DH對(duì)酶解蛋白溶解性、持水性、持油性、乳化性和起泡性等功能特性的影響，旨在為水產(chǎn)蛋白在食品配料蛋白領(lǐng)域的應(yīng)用提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冰鮮藍(lán)圓鲹（均質(zhì)量約150 g/尾）購于廈門市夏商水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)；壓榨葵花仁油 市售。

堿性蛋白酶（5.0×104U/g） 無錫諾維信酶制劑公司；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、8-苯胺基-1-萘磺酸銨鹽（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS） 美國Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)R-250 興隆達(dá)公司；其他試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；pH計(jì)德國Sartorius公司；恒溫水浴鍋 德國Memmert公司；ATN-300全自動(dòng)凱氏定氮儀 上海洪紀(jì)設(shè)備有限公司；Alpha 1-4 LDplus冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；Avanti J-26S XP大型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；凝膠成像儀 英國Syngen公司；Lambda紫外分光光度計(jì) 美國Perkin Elmer公司；FP-8200熒光分光光度計(jì)日本Jasco公司；1260超高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 堿法提取藍(lán)圓鲹分離蛋白

參考孫樂常等[12]的方法，在4 ℃環(huán)境下進(jìn)行。將藍(lán)圓鲹去頭、去內(nèi)臟和去皮之后，收集肌肉部分，與8 倍體積的冰水混合，并組織搗碎。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 11.0，用玻璃棒攪拌10 min，使魚肉充分溶解。將提取液8 000×g離心10 min，小心收集上清液部分，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 5.5，持續(xù)攪拌10 min后，8 000×g離心10 min，收集沉淀部分。得到的沉淀部分用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0即為藍(lán)圓鲹分離蛋白，并貯存于4 ℃，48 h內(nèi)用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 藍(lán)圓鲹分離蛋白酶解

配制0.25 g/mL的藍(lán)圓鲹分離蛋白溶液，采用堿性蛋白酶酶解。酶解條件：pH 8.0，加酶量（占蛋白質(zhì)量計(jì)）25 U/g，水解溫度50 ℃。反應(yīng)體系用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液維持恒定pH 8.0。水解結(jié)束時(shí)，將酶解液在8 000×g、4 ℃離心15 min，收集上清液部分，進(jìn)行冷凍干燥，即可得到藍(lán)圓鲹分離蛋白的酶解產(chǎn)物。

1.3.3 DH的測(cè)定

參照Church等[13]的方法，用OPA法測(cè)定水解樣品的DH。酶解產(chǎn)物用蒸餾水稀釋至終質(zhì)量濃度為5 mg/mL。將100 μL樣品與750 μL OPA試劑混合，并在室溫下反應(yīng)2 min，而后在340 nm波長處測(cè)量其吸光度。樣品的DH計(jì)算如式（1）所示：

式中：At為樣品在340 nm波長處的吸光度；A0為空白對(duì)照（水）在340 nm波長處的吸光度；M為蛋白質(zhì)量/g；ε為340 nm的摩爾消光系數(shù)（6 000 L/（mol·cm）；N為稀釋因數(shù)；C為蛋白質(zhì)量濃度/（g/L）。

1.3.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

根據(jù)Laemmli[14]的方法略有修改，濃縮膠和分離膠丙烯酰胺凝膠分別為4%和15%。電泳后用考馬斯亮藍(lán)染色法染色，用脫色液脫色后。全蛋白SDS-PAGE樣品制備參考孫樂常等[12]的方法，將蛋白樣品液與蛋白溶解液（20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、1% SDS、8 mol/L尿素、2% β-巰基乙醇）以1∶2比例充分混合，95 ℃加熱20 min。利用Lowry法對(duì)樣品進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，調(diào)節(jié)樣品的上樣量為每泳道10 μg蛋白。

1.3.5 酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布分析

參考Zhong Chan等[15]的高效液相色譜方法，將樣品上樣于TSK-gel G 2000 SWXL色譜柱。色譜條件為：進(jìn)樣體積1 μL，流動(dòng)相為0.1 mmol/L Na2SO4的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.7），洗脫流速0.5 mL/min，紫外檢測(cè)波長230 nm。標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量參照為：L-半胱氨酸（240 Da）、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（hippuryl-histidylleucine，HHL）（430 Da）、神經(jīng)降壓素（1 673 Da）、本實(shí)驗(yàn)室合成的肽IACGNW（6 640 Da）和小清蛋白（11 950 Da）。使用GPC軟件對(duì)所得色譜圖進(jìn)行分子質(zhì)量分布分析。

1.3.6 表面疏水性測(cè)定

采用熒光探針劑ANS法[16]，具體步驟為：用pH 7.0、10 mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液將不同DH的酶解產(chǎn)物稀釋至0.025～0.1 mg/L。將2 mL樣品液加入20 μL 8 mmol/L ANS溶液混勻，于黑暗中反應(yīng)20 min，測(cè)定熒光強(qiáng)度。測(cè)試所用激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為390 nm和470 nm，狹縫寬度為10 nm。

1.3.7 溶解性的測(cè)定

參考Latorres等[17]方法。稱取200 mg魚蛋白水解物樣品，將其溶解在20 mL蒸餾水中，用1 mmol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)樣品pH值至2.0、4.0、6.0、8.0與10.0。混合物30 ℃、100 r/min轉(zhuǎn)速攪拌30 min，然后7 500×g離心15 min。上清液和樣品蛋白質(zhì)含量按照Lowry法測(cè)定。樣品總蛋白質(zhì)含量用0.5 mmol/L NaOH溶液溶解后樣品蛋白含量表示。蛋白質(zhì)溶解度計(jì)算如式（2）所示：

1.3.8 乳化性與乳化穩(wěn)定性分析

蛋白乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsion stability index，ESI）的測(cè)定參照Xu Xingfeng等[9]方法，并做一定改進(jìn)。取0.15 g分離蛋白放入50 mL燒杯中，加入15 mL蒸餾水和5 mL葵花仁油，渦旋混勻，用1 mol/L HCl或1 mmol/L NaOH溶液將樣品pH值分別調(diào)節(jié)至2.0、4.0、6.0、8.0與10.0，隨后在20 000 r/min條件下高速分散1 min。分別在均質(zhì)后0、10 min從離心管底部取50 μL乳狀液，加入5 mL 0.1% SDS溶液，渦旋10 s，隨后在500 nm波長處測(cè)定吸光度。EAI、ESI計(jì)算如式（3）、（4）所示：

式中：A0為0 min時(shí)吸光度；T為濁度（2.303）；DF為稀釋倍數(shù)；ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（g/mL）；φ為油在乳狀液中的比例（0.25）；At為放置10 min后吸光度；Δt為時(shí)間差/min。

1.3.9 起泡性與起泡穩(wěn)定性分析

根據(jù)Agyare等[18]方法測(cè)定。配制50 mL 1 g/100 mL的蛋白液，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)pH值至2.0、4.0、6.0、7.0、10.0，放入250 mL的燒杯中，將蛋白懸浮液用高速分散器以10 000 r/min速率攪打1 min，記錄攪打前后的體積。起泡能力用體積增加的百分比表示。隨后，將攪打起泡的樣品靜置10 min，記錄不同時(shí)間段的泡沫體積，其中所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)量3 次。計(jì)算如式（5）、（6）所示：

式中：V1為攪打前的體積/mL；V2為攪打后的體積/mL；V3為攪打后靜置10 min的體積/mL。

1.3.10 持油力的測(cè)定

參考陳志軍等[19]的方法。準(zhǔn)確稱取分離蛋白水解物0.5 g，并分別置于原質(zhì)量m1的50 mL離心管中，加入10 mL的葵花籽油，混勻，靜置30 min，2 800×g離心30 min，小心去除分離的油層后，稱量離心管總質(zhì)量m2，平行測(cè)定3 次，求取平均值。持油力計(jì)算如式（7）所示：

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)圓鲹分離蛋白DH與蛋白回收率

圖1 酶解時(shí)間對(duì)藍(lán)圓鲹分離蛋白DH和蛋白回收率的影響Fig. 1 Effect of hydrolysis time on DH and protein recovery

由圖1可知，在堿性蛋白酶作用下藍(lán)圓鲹分離蛋白的DH和蛋白回收率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長而增加。在前120 min，分離蛋白DH增幅較大，而隨后的DH增幅逐漸減緩。當(dāng)反應(yīng)到180 min后，DH與蛋白回收率幾乎沒有變化，第180分鐘時(shí)DH和蛋白回收率分別為21.51%和51.21%，這可能是因?yàn)槊附膺^程中產(chǎn)生的產(chǎn)物抑制效應(yīng)、酶的熱失活以及特異性酶解位點(diǎn)的減少等因素的共同影響所導(dǎo)致。這與Xia Yichen等[20]在酶解大麥谷蛋白中DH和蛋白溶解性隨時(shí)間變化的趨勢(shì)一致。

2.2 SDS-PAGE分析

根據(jù)圖1的水解曲線，選取DH為5%、10%、15%與20%的樣品（分別記為DH5、DH10、DH15、DH20），對(duì)全蛋白與酶解上清液中蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，并與未酶解的分離蛋白進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2所示。酶解蛋白上清液中（圖2A），僅DH5的樣品中可觀察到組分中10～20 kDa之間蛋白條帶，其后的酶解樣品上清液中均無明顯的蛋白條帶，推測(cè)其上清液中主要組成可能為寡肽類小分子物質(zhì)。對(duì)酶解樣品的全蛋白（圖2B）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)隨著酶解進(jìn)行，藍(lán)圓鲹分離蛋白中的肌球蛋白重鏈與肌動(dòng)蛋白發(fā)生強(qiáng)烈降解，且產(chǎn)生的酶解產(chǎn)物主要集中在20～60 kDa范圍。其中，泳道2、3更高分子的蛋白條帶可能是伴肌動(dòng)蛋白等肌原纖維蛋白中更大分子質(zhì)量的蛋白。當(dāng)DH為15%以上時(shí)，全蛋白組分中蛋白主要為15 kDa以下的小分子蛋白。結(jié)合圖2A（上清液）與圖2B（全蛋白）的蛋白分布情況，可知隨著酶解時(shí)間的延長，依舊存在部分不溶解的蛋白組分，其分子質(zhì)量分布于10～30 kDa之間，推測(cè)其可能是酶解過程中釋放出來的疏水性較強(qiáng)的多肽片段，這與圖1中蛋白溶解度的結(jié)果一致。劉書來等[21]分別利用3 種蛋白酶（使用量為250～500 U/g）對(duì)鰱魚肌原纖維蛋白進(jìn)行限制性酶解，發(fā)現(xiàn)DH為5%時(shí)，其肌原纖維蛋白的降解條帶主要集中在20～30 kDa范圍，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致。由于未酶解分離蛋白的溶解性較低（圖1），因此在之后實(shí)驗(yàn)中主要對(duì)不同DH的酶解上清液組分（以下簡(jiǎn)稱酶解產(chǎn)物）進(jìn)行比較分析。

圖2 藍(lán)圓鲹分離蛋白酶解產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE profiles of protein isolate of blue round scads and its hydrolysates at different DHs

2.3 藍(lán)圓鲹分離蛋白酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布

圖3 不同DH酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布Fig. 3 Molecular mass distribution of blue round scad protein isolate hydrolysates at different DHs

由圖3可知，隨著水解反應(yīng)的進(jìn)行，大分子的多肽逐漸被分解成大小不一的寡肽。DH為5%時(shí)，大于30 kDa有2.61%，10～30 kDa有16.1%。DH為10%時(shí)，5～10 kDa有9.4%，3～5 kDa有14.8%。當(dāng)DH在15%以上，分子質(zhì)量小于3 kDa的組分所占比例增大，分別為91.8%和96.8%，這與圖2中酶解產(chǎn)物的電泳圖結(jié)果一致。Morales-Medina等[22]利用枯草芽孢桿菌蛋白酶對(duì)沙丁魚和馬鮫魚肌肉蛋白進(jìn)行酶解時(shí)，也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。

2.4 表面疏水性分析

圖4 不同DH酶解產(chǎn)物的表面疏水性Fig. 4 Surface hydrophobicity of blue round scad protein isolate hydrolysates at different DHs

如圖4所示，與分離蛋白（全蛋白）相比，酶解產(chǎn)物的表面疏水性隨DH的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中DH為5%時(shí)酶解產(chǎn)物所呈現(xiàn)的表面疏水性最高，其后則逐漸降低。這說明適度的酶解有助于將原本埋藏在蛋白內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露在溶液當(dāng)中，進(jìn)而使其表現(xiàn)出更高的疏水性[23]。而隨著水解的進(jìn)一步進(jìn)行，釋放出的肽段進(jìn)一步通過離子鍵或氫鍵作用與大分子蛋白結(jié)合，并掩蓋蛋白表面的疏水氨基酸殘基，進(jìn)而使其整體的表面疏水性降低[24]。這與Liu Yongle等[25]在堿性蛋白酶酶解魚糜的結(jié)果一致。

2.5 pH值對(duì)酶解產(chǎn)物溶解度的影響

圖5 pH值對(duì)不同DH藍(lán)圓鲹分離蛋白酶解產(chǎn)物溶解度的影響Fig. 5 Solubility of blue round scad protein isolate hydrolysates at different DHs as influenced by pH

如圖5所示，酶解產(chǎn)物的溶解度隨著DH的增加而增加，且在pH 2.0、7.0以及10.0溶解度均具有較好的溶解性，溶解度達(dá)80%以上。當(dāng)DH為20%，pH 10.0時(shí)，酶解產(chǎn)物的溶解度達(dá)到最大值（（98.3±1.45）%）。當(dāng)溶液pH 4.0時(shí)，所有酶解產(chǎn)物的溶解度均達(dá)到最低值，推測(cè)該pH值接近酶解產(chǎn)物的等電點(diǎn)，此時(shí)蛋白之間的分子作用力減小，容易發(fā)生聚集，從而導(dǎo)致溶解度降低[26]。與其他DH相比，DH20的酶解產(chǎn)物具有更高的溶解度，表明酶解能進(jìn)一步將原本因疏水而易絮凝沉淀的蛋白分解成更小分子肽段，使其溶解于水相中，進(jìn)而提高了酶解產(chǎn)物的溶解性[22]。

2.6 乳化性與乳化穩(wěn)定性分析

表1 pH值對(duì)藍(lán)圓鲹分離蛋白酶解產(chǎn)物乳化性質(zhì)的影響Table 1 Effect of pH on emulsifying properties of blue round scad protein isolate hydrolysates

如表1所示，與未酶解分離蛋白上清液組分相比，酶解產(chǎn)物在不同pH值條件下的EAI均得到不同程度的提升（pH 4.0除外）。但隨著DH的增加，EAI呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)。其中，DH為5%時(shí)EAI最高，在pH 10.0有最高的EAI為（100.87±0.65）m2/g，為未酶解對(duì)照組的5 倍以上。此外，DH15與DH20組的EAI與ESI明顯低于DH5與DH10。酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量對(duì)乳化性質(zhì)具有重要影響。一定的DH范圍內(nèi)，蛋白分子質(zhì)量的減少有利于提升表面疏水性與溶解性。此外，酶解過程中釋放的肽段也會(huì)增強(qiáng)蛋白分子間的電荷作用，有助于在一定程度上提高蛋白的乳化性[21]。而過度水解則會(huì)導(dǎo)致蛋白的肽鏈變短，無法在乳液油滴界面上形成黏彈性的膜，從而使其乳化性降低[27]。所有樣品在pH 4.0時(shí)EAI和ESI均為最小值，這是由于pH 4.0接近酶解產(chǎn)物的等電點(diǎn)，酶解產(chǎn)物中各蛋白片段的表面電荷減小，分子間相互作用減弱，進(jìn)而導(dǎo)致乳化性下降[17]。相對(duì)地，當(dāng)pH 10.0時(shí)所有的酶解產(chǎn)物EAI最高，這可能是由于在堿性條件下，酶解產(chǎn)物分子表面電荷增強(qiáng)，會(huì)誘導(dǎo)蛋白展開，增強(qiáng)酶解產(chǎn)物的乳化性[27]。另一方面，當(dāng)DH為5%，酶解產(chǎn)物具有相對(duì)較高的ESI，其中pH 7.0與pH 10.0的ESI明顯高于pH 4.0與pH 2.0。酶解產(chǎn)物的溶解性是決定蛋白功能特性的重要因素。在本實(shí)驗(yàn)中，DH為5%時(shí)的酶解產(chǎn)物在pH 2.0與pH 4.0時(shí)的溶解度明顯低于pH 7.0與pH 10.0，這可能是其ESI較低的重要原因。

2.7 起泡性與起泡穩(wěn)定性分析

如表2所示，隨著DH的增加，酶解產(chǎn)物的起泡性和起泡穩(wěn)定性呈先上升后下降的趨勢(shì)，DH為5%的酶解產(chǎn)物的起泡性最大（（227.3±3.8）%），當(dāng)DH增加到10%時(shí)，酶解產(chǎn)物的起泡性反而下降。這與陳志軍等[25]使用堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解魚糜加工副產(chǎn)物的結(jié)果一致。起泡性的增加是因?yàn)槊附馐沟玫鞍椎娜芙舛蕊@著增加，從而使更多的多肽能夠吸附到界面，有利于液膜的形成[28]。隨著酶解程度的增加，起泡性和起泡穩(wěn)定性下降，這是因?yàn)檫^度水解破壞了蛋白的結(jié)構(gòu)，對(duì)蛋白的起泡能力和起泡穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響[16]。與表1結(jié)果相似，所有酶解產(chǎn)物在pH 4.0時(shí)的起泡性和起泡穩(wěn)定性最差，這與酶解產(chǎn)物在接近等電點(diǎn)時(shí)溶解性降低有關(guān)[25]。劉書來等[21]采用胰蛋白酶、中性蛋白酶及復(fù)合酶對(duì)鰱魚肌原纖維蛋白進(jìn)行限制性酶解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)合蛋白酶酶解40 min時(shí)，蛋白的起泡性達(dá)到最高值（110%），并認(rèn)為酶解時(shí)所使用的蛋白酶與DH對(duì)酶解產(chǎn)物的蛋白功能特性具有重要影響。相比之下，本研究酶解產(chǎn)物具有更高的起泡性，這可能與酶解蛋白的不同有關(guān)。本研究中酶解蛋白為分離蛋白，其不僅含有肌原纖維蛋白，還包含了較高含量的水溶性蛋白，因此在蛋白的整體溶解性上優(yōu)于單純肌原纖維蛋白樣品。

表2 pH值對(duì)不同DH藍(lán)圓鲹分離蛋白酶解產(chǎn)物起泡特性的影響Table 2 Foaming properties of blue round scad protein isolate hydrolysates at different DHs as influenced by pH

2.8 持油力分析

圖6 不同DH酶解產(chǎn)物的持油力Fig. 6 Oil-holding capacity of blue round scad protein isolate hydrolysates at different DHs

由圖6可知，蛋白經(jīng)酶解后，持油力先提高后降低，DH在15%以下時(shí)，持油力為3.00 g/g（油/蛋白）以上，其中，DH5的持油力最高，達(dá)3.50 g/g。而當(dāng)DH為20%時(shí)，持油力僅為1.20 g/g。蛋白對(duì)油脂的吸附力與其表面疏水性以及暴露在蛋白表面的氨基酸殘基側(cè)鏈的非極性基團(tuán)有關(guān)[29]。在本研究中，適度的酶解能有效增強(qiáng)分離蛋白的表面疏水性（圖1）與蛋白的溶解性（圖2），使得蛋白與油脂的接觸率與親和力提高，故而其持油力顯著提升。值得一提的是，蛋白的持油力是一種物理阻隔作用，過度的酶解則會(huì)導(dǎo)致酶解產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化為較小的小肽和游離氨基酸，無法有效阻隔油脂，因此導(dǎo)致持油力下降[30]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用堿性蛋白酶對(duì)藍(lán)圓鲹分離蛋白進(jìn)行酶解，研究不同DH藍(lán)圓鲹分離蛋白酶解產(chǎn)物的功能性質(zhì)。結(jié)果表明，通過限制酶解可以顯著提高分離蛋白的溶解性、乳化性、起泡性及持油力等功能性，其中DH為5%時(shí)酶解產(chǎn)物的蛋白功能性最佳，但繼續(xù)增加DH，蛋白功能性反而呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，這說明酶解程度對(duì)開發(fā)利用藍(lán)圓鲹分離蛋白有關(guān)鍵影響。本研究酶解產(chǎn)物DH5在pH 2.0、pH 7.0以及pH 10.0均具有較好的起泡性與溶解性，表明其在未來蛋白飲料方面具有良好應(yīng)用前景。此外，酶解產(chǎn)物還具有良好持油力，也表明其可以應(yīng)用于肉糜制品的油脂乳化之中。綜上所述，本研究結(jié)果可為藍(lán)圓鲹分離蛋白在食品配料蛋白中的應(yīng)用提供一定的理論參考。