殼聚糖W/O型乳狀液的超聲輔助制備及其穩(wěn)定性

茅芝娟，張昆明,*，黃永春,*，郭 艷，楊 鋒，任仙娥，艾 碩

（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州螺螄粉工程技術(shù)研究中心，廣西 柳州 545006；2.蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530004）

乳液又稱(chēng)乳狀液，是將一種或多種液體以液滴（微?；蛞壕В┬问椒稚⒂诹硪环N與之不相溶的液體中，構(gòu)成外觀不透明、乳滴粒度?。?.1～100 μm），且具有較高穩(wěn)定性的多相分散體系[1-2]，其主要分為水包油（O/W）和油包水（W/O）2 種類(lèi)型。其中，W/O型乳液通常又稱(chēng)為反相乳液，因其內(nèi)相為極性水相，能夠溶解/負(fù)載水溶生物活性物[3]、包載親水性大分子或營(yíng)養(yǎng)制劑[3-4]，具有隔離、防護(hù)、靶向控釋、風(fēng)味保持和微反應(yīng)器等多種用途，因而在食品[5-6]、醫(yī)藥[7-8]、材料[9-10]、化工[11-12]和化妝品[2-13]等眾多領(lǐng)域得到了廣泛運(yùn)用。然而，W/O型乳液的乳化制備參數(shù)及其穩(wěn)定性很大程度上決定了其上述負(fù)載/包載性能，同時(shí)也是其得以有效商業(yè)應(yīng)用實(shí)施的關(guān)鍵，因此，W/O型乳液的制備及其穩(wěn)定性研究近年來(lái)一直備受業(yè)內(nèi)關(guān)注[14-17]。

目前，對(duì)于W/O乳液的研究主要以水或小分子水溶性物的牛頓型液體為分散相[14-19]。例如，Nikolovski等[14]以去離子水為分散相，南瓜籽油為連續(xù)相，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%的非離子表面活性劑聚甘油蓖麻醇酯，采用高速均質(zhì)處理5 min，得到粒徑為400～850 nm的乳液，并于25 ℃靜置15 d，乳析指數(shù)為5.6%。Bhatti等[15]將質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0%的蛋氨酸、賴(lài)氨酸、蘇氨酸、色氨酸同時(shí)分散于大豆油中，并在5.0%乳化劑作用下經(jīng)高壓均質(zhì)得到粒徑為4.0～5.0 μm的乳液，于4 ℃貯存30 d沒(méi)有出現(xiàn)分層現(xiàn)象，乳液粒度仍保持在4.3～5.0 μm；而于25 ℃貯存30 d的乳液出現(xiàn)了輕微的分層現(xiàn)象，乳液粒度由4.2 μm增大至5.8 μm。Rabelo等[16]采用高壓均質(zhì)制備負(fù)載漿果花青素的W/O乳液，得到粒度為131.5～195.3 nm，多分散性指數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.2～0.6的乳液，于4 ℃貯存30 d無(wú)相分離，表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性。Raviadaran等[17]將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的NaCl溶液分散于棕櫚油中，采用超聲協(xié)助制備W/O乳液，于4 ℃貯存14 d，乳液粒度由143.1 nm增大至151.2 nm，PDI由0.131增大至0.156。Pimentel-Moral[18]和Prichapan[19]等也報(bào)道了W/O型乳液類(lèi)似的研究工作。然而，對(duì)于以高分子水溶性物（如多糖殼聚糖、可溶性淀粉）的非牛頓假塑性液體作為分散相的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道[20-21]。

Wardhono[20]和Kundu[22]等研究結(jié)果表明乳液粒度大小對(duì)乳液的穩(wěn)定性存在顯著影響，且乳液粒度小、分布均勻的乳液，更易具備優(yōu)良的乳液穩(wěn)定性。如前所述，超聲作為一種機(jī)械波，通過(guò)高強(qiáng)度的超聲波作用可制備出負(fù)載3% NaCl溶液的W/O均一納米乳液[17]，這為制備負(fù)載高分子多糖殼聚糖溶液的超細(xì)W/O均一乳液提供了可能。基于此，本研究以Span-80為表面活性劑，采用超聲輻射輔助制備殼聚糖W/O型乳液，考察超聲功率、超聲時(shí)間、殼聚糖質(zhì)量濃度、內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)、Span-80用量等對(duì)乳液粒徑和PDI的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化制備工藝，并分析優(yōu)化條件下所制備乳液典型的粒徑大小及其分布，同時(shí)觀測(cè)所得乳液的穩(wěn)定性，分析影響其不穩(wěn)定性的機(jī)制，以期為殼聚糖W/O型乳狀液的超聲輔助制備及其穩(wěn)定性提供一定的科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（脫乙酰度90%，分子質(zhì)量500 kDa） 深圳市中發(fā)源生物科技有限公司；棕櫚油（食品級(jí)） 天津市聚龍糧油有限公司；冰醋酸、無(wú)水乙酸鈉、Span-80等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；所有實(shí)試驗(yàn)用水均為去離子水，電導(dǎo)率≤4.0 μS/cm。

1.2 儀器與設(shè)備

Zetasizer Nano-ZS90激光納米粒度分析儀 英國(guó)Malven儀器有限公司；Frontier傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)PerkinElmer儀器有限公司；MC-D31OU高清數(shù)字光學(xué)顯微攝像儀 深圳市潤(rùn)興光學(xué)儀器有限公司；SCIENTZ-950超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；S312恒速數(shù)顯電動(dòng)攪拌器 鄭州宇詳儀器設(shè)備有限公司；ISO9001電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有公司；DF-101S集熱式恒溫水浴鍋 鞏義市予華儀器有限公司；BCD-256KT冰箱 青島海爾股份有限公司；UPH-IV-20T純水/超純水機(jī) 四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 殼聚糖W/O型乳液的超聲協(xié)助制備

稱(chēng)取適量殼聚糖溶于pH 3.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，配制成一定質(zhì)量濃度的殼聚糖溶液，構(gòu)成水相。實(shí)驗(yàn)以Span-80為乳化劑，量取一定體積的棕櫚油倒于250 mL燒杯（內(nèi)徑6.0 cm，高13.0 cm）中作為油相，并于30 ℃恒溫水浴下將Span-80按一定比例與棕櫚油以450 r/min恒速混合5 min，然后在上述相同溫度和攪拌轉(zhuǎn)速下，將一定體積預(yù)先配制好的殼聚糖溶液以1.0 mL/min滴加至Span-80與棕櫚油的混合液中，邊滴邊攪拌15 min至均勻，形成粗乳液。每次制備的粗乳液體積固定為180 mL，此時(shí)乳液在燒杯中的高度約為6.6 cm。

將上述粗乳液置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中，選用直徑為6 mm的超聲變幅桿，乳液液面浸沒(méi)變幅桿的深度為乳液高度的1/3（約為2.2 cm），工作時(shí)間20 s和間歇時(shí)間40 s，過(guò)程以冰水浴控溫，在相應(yīng)工藝條件下制備得到殼聚糖W/O型細(xì)乳液。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

按上述方法制備殼聚糖W/O型乳液，選取超聲功率（60、150、300、450、600 W）、超聲時(shí)間（0、5、10、15、20、25 min）、殼聚糖質(zhì)量濃度（2、4、6、8、10 g/L）、內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)（5%、10%、15%、25%、35%）以及Span-80用量（體積分?jǐn)?shù)0%、5%、10%、15%、20%）5 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，探究各因素對(duì)殼聚糖W/O型乳狀液粒徑及PDI的影響，每個(gè)因素平行試驗(yàn)3 次，取平均值。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面法，采用中心復(fù)合表面設(shè)計(jì)（face-centered central composite design，F(xiàn)CCD），以超聲功率（A）、內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、Span-80用量（C）為響應(yīng)因素，并以-1、0、1分別代表響應(yīng)因素的低、中、高水平，以乳液平均粒徑和PDI為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，因素取值見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Experimental values and corresponding coded values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

參考Raviadaran等[17]方法進(jìn)行。在響應(yīng)面優(yōu)化條件下，制備殼聚糖W/O型乳狀液。將制備好的乳液置于25 mL的具塞比色管中，用玻璃塞密封后，分別置于25 ℃和50 ℃恒溫水浴下貯存，實(shí)驗(yàn)每隔2 h測(cè)量比色管中的乳液和底部水層高度，并計(jì)算乳析指數(shù)；同時(shí)取樣測(cè)定各組乳液的平均粒度和PDI，每個(gè)條件重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，取平均值。

1.3.5 殼聚糖W/O型乳狀液特性評(píng)價(jià)

1.3.5.1 乳狀液平均粒徑和PDI的測(cè)定采用Zetasizer Nano-ZS90激光納米粒度分析儀測(cè)定殼聚糖W/O型乳液的平均粒徑和PDI。測(cè)試前，為了降低多重光散射效應(yīng)，將乳液預(yù)先用棕櫚油稀釋40 倍，然后將稀釋后的乳液倒入1 cm的聚苯乙烯池比色皿中，再把比色皿放入粒度分析儀中進(jìn)行測(cè)量，測(cè)定條件如下：測(cè)定溫度25 ℃，平衡時(shí)間2 min，散射角90o，折光率1.47，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次，取平均值。

1.3.5.2 乳液的微觀顯微結(jié)構(gòu)觀察

移取新鮮乳液樣品，滴加適量與MC-D31OU高清數(shù)字光學(xué)顯微攝像儀配套使用的載玻片上，并將載玻片正置于顯微鏡的載物臺(tái)上，隨后調(diào)整高清數(shù)字?jǐn)z像儀放大至100 倍，觀察乳液的內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)，照片可從與電腦連接的數(shù)字圖像處理軟件獲得。

1.3.5.3 乳析穩(wěn)定性的測(cè)定

參考Moschakis等[23]方法。取15 mL待測(cè)乳液置于具塞比色管中，將比色管用玻璃塞密封，并分別置于25 ℃和50 ℃貯存，每隔2 h進(jìn)行乳液乳析指數(shù)的測(cè)定并記錄，乳析穩(wěn)定性通常采用乳析指數(shù)（creaming index，CI）表示，如式（1）表示：

式中：HS為乳清層的高度/cm；HT為比色管中乳液的高度/cm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對(duì)乳狀液平均粒徑及PDI的影響

圖1 超聲功率對(duì)乳液平均粒徑及PDI的影響Fig. 1 Effect of ultrasonic power on mean particle size and PDI of emulsions

在微觀層面上，乳液中分散相水滴粒徑的大小及其分布與該乳液的穩(wěn)定性密切相關(guān)[20,22]。固定超聲時(shí)間10 min、殼聚糖質(zhì)量濃度10 g/L、內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、油相中Span-80用量5%，考察超聲功率對(duì)乳液平均粒徑和PDI的影響。由圖1可知，隨著超聲功率的增大，乳液的平均粒徑和PDI均呈先降低后增大的趨勢(shì)，且當(dāng)功率增至300 W時(shí)二者均降至最低值。這主要是由于超聲功率較低時(shí)，超聲波的空化效應(yīng)、機(jī)械剪切強(qiáng)度較低，大液滴不足以破碎成小液滴，粒度分布不夠完全；隨著超聲功率增大，空化效應(yīng)增強(qiáng)，乳滴的平均粒徑減小，分布趨于均勻，PDI降低；但當(dāng)超聲功率過(guò)高時(shí)，超聲波能量密度過(guò)大，且只有小部分能量用于空化和機(jī)械效應(yīng)，大部分以熱能的形式使乳液溫度升高[24]，促使乳液黏度降低，Span-80在水/油界面吸附量減少，界面張力增大，并加劇了乳滴間的布朗運(yùn)動(dòng)而易產(chǎn)生絮凝或聚結(jié)[25]，因而乳液粒度增大，分布變寬，PDI增大，即“過(guò)處理”效應(yīng)[24,26]。這一結(jié)果與Kentish[24]、陳冬[26]和Desrumaux[25]等的研究結(jié)果一致。綜合兩方面因素，超聲功率以150～450 W為宜。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)乳狀液平均粒徑及PDI的影響

圖2 超聲時(shí)間對(duì)乳液平均粒徑及PDI的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic time on mean particle size and PDI of emulsions

固定超聲功率300 W、殼聚糖質(zhì)量濃度10 g/L、內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、油相中Span-80用量5%，考察超聲時(shí)間對(duì)乳液平均粒徑和PDI的影響。由圖2可知，超聲乳化開(kāi)始時(shí)，乳液粒徑和PDI隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)迅速降低，并在15 min時(shí)降至最低值，然后呈略微增大的趨勢(shì)。這一方面由于超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)能強(qiáng)化傳質(zhì)過(guò)程，促進(jìn)了表面活性劑、棕櫚油和殼聚糖溶液三者間的混合，加速降低了油-水相間的界面張力[17]；另一方面由于乳液在超聲空化和機(jī)械剪切效應(yīng)的持續(xù)作用下，大液滴不斷被破裂成小液滴，因而粒徑更小，且分布更均勻的小液滴數(shù)量不斷增加。但當(dāng)超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，液滴間的碰撞概率增加，易發(fā)生聚結(jié)現(xiàn)象，因而乳液粒度略微增大，分布變寬[27]。因此，超聲時(shí)間以15 min為宜。

2.1.3 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)乳狀液平均粒徑及PDI的影響

固定超聲功率300 W、超聲時(shí)間15 min、內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、油相中Span-80用量為5%，考察殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)乳液平均粒徑和PDI的影響。由圖3可知，增大殼聚糖濃度，乳液的粒徑和PDI均呈緩慢增大趨勢(shì)，但當(dāng)質(zhì)量濃度增大至6.0 g/L后，二者呈陡然降低趨勢(shì)。這一方面由于隨著分散水相中的殼聚糖含量增多，水相的密度呈緩慢增大趨勢(shì)，對(duì)乳液體系的穩(wěn)定性不利，在超聲作用下易發(fā)生液滴間的聚結(jié)現(xiàn)象；另一方面由于殼聚糖溶液屬于非牛頓假塑性液體，當(dāng)其質(zhì)量濃度從6.0 g/L分別增大至8.0、10.0 g/L時(shí)，其溶液黏度從0.37 Pa·s分別陡然增大至1.74、1.92 Pa·s[28]，這既增大了液滴間擴(kuò)散聚結(jié)的傳質(zhì)阻力，又增強(qiáng)了在相同超聲強(qiáng)度下高黏度體系內(nèi)的剪切作用力，利于內(nèi)水相的進(jìn)一步分散，從而乳液的平均粒度降低，且更均勻，穩(wěn)定性得到提高。朱旻鵬等[21]也發(fā)現(xiàn)當(dāng)乳液中的分散相淀粉水溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高至12%時(shí)，乳液穩(wěn)定性降低，但繼續(xù)增大淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，乳液的穩(wěn)定性反而升高。因此，選取殼聚糖質(zhì)量濃度10.0 g/L為宜。

圖3 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)乳液平均粒徑及PDI的影響Fig. 3 Effect of chitosan concentration on mean particle size and PDI of emulsions

2.1.4 內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)乳狀液平均粒徑及PDI的影響

圖4 內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)乳液平均粒徑及PDI的影響Fig. 4 Effect of inner water phase content on mean particle size and PDI of emulsions

固定超聲功率300 W、超聲時(shí)間15 min、殼聚糖質(zhì)量濃度10 g/L、Span-80用量5%，考察內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)乳液平均粒徑和PDI的影響。由圖4可知，乳液的平均粒徑和PDI隨內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈先減小后增大的趨勢(shì)，且當(dāng)內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%～15%時(shí)下降較為顯著。這主要是由于當(dāng)內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)低時(shí)，增大內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)，超聲空化效應(yīng)隨之增大，因而小液滴不斷生成，同時(shí)乳狀液的黏度也隨之增大，因而乳滴間的自由度減小，乳滴間難以相互靠近而發(fā)生聚結(jié)[20]；而當(dāng)內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)，乳滴之間靠得過(guò)近，乳滴間的油層變薄，聚結(jié)或奧氏熟化現(xiàn)象很容易發(fā)生，因而乳液粒徑及PDI又緩慢增大，這一現(xiàn)象與Wardhono[20]、Clausse[29]等的研究結(jié)果一致。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到25%時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后5～6 min燒杯底部有“絮凝”水出現(xiàn)，而當(dāng)內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到35%時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)燒杯底部已經(jīng)出現(xiàn)了“絮凝”水。因此，內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)選取10%～20%為宜。

2.1.5 Span-80用量對(duì)乳狀液平均粒徑及PDI的影響

圖5 Span-80用量對(duì)乳液平均粒徑及PDI的影響Fig. 5 Effect of Span-80 concentration on mean particle size and PDI of emulsions

固定超聲功率300 W、超聲時(shí)間15 min、殼聚糖質(zhì)量濃度10 g/L、內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%，考察油相中Span-80用量對(duì)乳液平均粒徑和PDI的影響。由圖5可知，隨著油相中Span-80用量增大，乳液的平均粒徑和PDI呈先降低后增大的趨勢(shì)，且當(dāng)Span-80用量增至10%時(shí)乳液粒徑和PDI降至最低。這主要是由于乳化劑用量加大，其在相界面上排列越緊密，促使棕櫚油相和分散水相間的界面張力減小，形成的界面膜強(qiáng)度越大，對(duì)分散液滴保護(hù)作用越強(qiáng)，液滴間的聚結(jié)現(xiàn)象更難發(fā)生[20]，從而乳液的粒度減小，分布更均勻，PDI減?。坏?dāng)乳化劑添加過(guò)量時(shí)，由于多余的乳化劑相互作用，液滴分散的自由空間相對(duì)降低，造成乳液微粒的聚結(jié)或絮凝[30]，因而乳液的粒徑增大，均一性變差，PDI增大。這一趨勢(shì)和陳冬[26]、Jafari[31]等的研究結(jié)果一致。因此，Span-80用量以5%～15%為宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面法，采用FCCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)模型，以超聲功率（A）、內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）、Span-80用量（C）為響應(yīng)因素，以平均粒徑（Y1）及PDI（Y2）為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件，對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合分析，獲得響應(yīng)值與自變量的邏輯關(guān)系為：Y1=1 208.90-1.06A-153.97B-0.01C-0.02AB+0.03AC+0.12BC+1.75×10-3A2+6.57B2-0.25C2；Y2=1.21-8.40×10-4A-0.05B-0.06C+4.33×10-5AB-5.67×10-5AC+1.50×10-3BC+1.12×10-6A2+4.10×10-4B2+4.01×10-3C2。

表3 平均粒徑二次回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of regression equation for mean particle size

表4 PDI二次回歸方程方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance of regression equation for PDI

由表3和表4可知，Y1和Y2方程的回歸模型P＜0.01，表明二者的回歸模型達(dá)到極顯著水平；二者的失擬項(xiàng)P＞0.05，影響不顯著，說(shuō)明二者的回歸模型有效，可靠性較高。因此，可以應(yīng)用Y1和Y2兩個(gè)回歸方程描述各響應(yīng)因素與2 個(gè)響應(yīng)值之間的關(guān)系，以確定各因素對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性。由表3和圖6可看出，響應(yīng)值為平均粒徑的模型，各響應(yīng)因素影響程度依次是：B＞C＞A，內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)乳液平均粒徑的影響最大；響應(yīng)值為PDI的模型，各響應(yīng)因素影響程度依次為：C＞B＞A，Span-80用量對(duì)乳液粒度大小分布PDI的影響最大。各因素交互作用對(duì)2 個(gè)響應(yīng)值的影響見(jiàn)圖6。

圖6 各因素交互作用對(duì)乳液平均粒徑和PDI的影響Fig. 6 Response surface plots for the interactive effects of variables on mean particle size and PDI of emulsions

根據(jù)所得到的響應(yīng)面模型，通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件分析可得到乳液的最佳超聲協(xié)助制備條件為超聲功率295.1 W、內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)13.3%、油相中Span-80用量6.4%，此時(shí)預(yù)測(cè)的乳液平均粒徑為158.2 nm，PDI為0.44。考慮到實(shí)際可操作性，上述工藝參數(shù)調(diào)整為超聲功率300 W、內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)13%、Span-80用量6%，在此條件下進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，得到的乳液平均粒徑為（156.1±20.0）nm，PDI為（0.43±0.03），與理論預(yù)測(cè)值較接近。由此可見(jiàn)，以乳液平均粒徑及PDI為指標(biāo)，采用響應(yīng)面模型對(duì)殼聚糖W/O型乳狀液的超聲協(xié)助制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)化是行之有效的。

2.3 典型的乳液粒徑及其分布

由圖7可知，乳液粒徑較小，呈單峰分布，且分布范圍較窄，整體分布范圍在70.9～229.3 nm之間。其中，110.0 nm的乳液所占體積分?jǐn)?shù)最大為25.8%，127.5 nm和95.1 nm的乳液所占體積分?jǐn)?shù)分別為22.6%和18.7%，198.0 nm和229.3 nm的乳液所占體積分?jǐn)?shù)分別為2.1%和0.3%。這與實(shí)驗(yàn)所得的乳液平均粒徑（156.1±20.0）nm及PDI（0.43±0.03）數(shù)值一致。

圖7 乳液典型粒徑分布圖Fig. 7 Typical particle size distribution of the optimized emulsion

2.4 乳液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 乳液穩(wěn)定性分析

W/O型乳液的性能與其穩(wěn)定性密切相關(guān)[1-2]。為了觀察負(fù)載高分子殼聚糖的W/O型乳液穩(wěn)定性，在超聲優(yōu)化條件下制備殼聚糖W/O型乳狀液，并觀測(cè)其在不同溫度（25、50 ℃）的CI、平均粒徑及PDI隨貯存時(shí)間的變化情況。如圖8a和9所示，2 種貯存溫度下的樣品CI變化趨勢(shì)一致，且隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，乳液CI值均不斷增大，6 h后基本穩(wěn)定。此外，當(dāng)貯存時(shí)間為2 h時(shí)，25 ℃貯存的乳液沒(méi)有出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象，表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性，而50 ℃貯存的乳液穩(wěn)定性急劇下降，出現(xiàn)了明顯的水層，此時(shí)乳液的CI值分別為0.6%和7.0%。這一結(jié)果說(shuō)明在以棕櫚油為連續(xù)油相制備負(fù)載高分子殼聚糖溶液的W/O乳液，室溫條件下更有利于該乳液的貯存，這可能是由于溫度較高時(shí)布朗運(yùn)動(dòng)加快，乳滴之間的碰撞概率增大，導(dǎo)致乳滴間易發(fā)生絮凝或聚結(jié)，造成乳液沉降現(xiàn)象易于發(fā)生并形成分層。

圖8 不同貯存溫度下乳層析指數(shù)（a）、乳液粒徑（b）和PDI（c）隨時(shí)間變化圖Fig. 8 Variations in creaming index (a), mean particle size (b) and PDI (c)of the optimized emulsion during storage at different temperatures

如圖8b、c所示，在整個(gè)貯存期10 h內(nèi)，乳液的平均粒徑、PDI和CI的變化趨勢(shì)相似，均隨貯存時(shí)間的延長(zhǎng)呈不斷增大趨勢(shì)；且貯存溫度50 ℃的乳液平均粒徑和PDI整體大于25 ℃的乳液平均粒徑和PDI，這一結(jié)果和50 ℃的乳液CI整體高于25 ℃的乳液CI（圖8a）一致；此外，取2 種溫度下貯存4 h的上層乳液分別進(jìn)行顯微觀察，結(jié)果如圖9所示，相比于50 ℃貯存的乳液，25 ℃貯存的乳液平均粒度較小為225.6 nm，且分布較為均一，PDI為0.58，而50 ℃貯存的乳液平均粒度和PDI分別為255.3 nm和0.61。以上結(jié)果說(shuō)明乳液粒度增大，乳液不均勻性分布加劇，乳液的CI值增大，不利于乳液的穩(wěn)定。

圖9 25 ℃（a）及50 ℃（b）乳液的穩(wěn)定性及內(nèi)部結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微鏡圖Fig. 9 Stability and micro-morphology of the optimized emulsion at 25 (a) and 50 ℃ (b)

2.4.2 乳液的失穩(wěn)機(jī)制

圖10 25 ℃和50 ℃條件下乳液的不穩(wěn)定性評(píng)估Fig. 10 Evaluation of emulsion instability at 25 and 50 ℃

乳液液滴長(zhǎng)大的過(guò)程主要有聚結(jié)和奧氏熟化2 種形式[32]。為進(jìn)一步分析殼聚糖W/O型乳狀液的不穩(wěn)定性原因，現(xiàn)將乳液的粒徑隨貯存時(shí)間的變化分別按式（2）和（3）進(jìn)行擬合[32]：

式中：r為貯存時(shí)間t時(shí)乳滴的平均半徑；r0為液滴初始半徑；ω為液滴表面受破壞頻率。由式（2）可知：如果聚結(jié)是造成乳液不穩(wěn)定的主要機(jī)制，那么1/r2-t-1的函數(shù)關(guān)系將呈線性。根據(jù)Lifshitz-Slezov-Wagner（LSW）理論[22]，奧氏熟化速率ω可由式（3）表示：

式中：C∞為無(wú)限大液滴在體相中的溶解度；γ為界面張力；Vm為分散相的摩爾體積；D為分散相在連續(xù)相中的擴(kuò)散系數(shù)；ρ為分散相密度；R為氣體常數(shù)；T為絕對(duì)溫度。由式（3）可知：如果奧氏熟化是造成乳液不穩(wěn)定的主要機(jī)制，那么r3-t的函數(shù)關(guān)系將呈線性。

圖10為25 ℃和50 ℃的乳液粒徑按上述兩種方式擬合得到的1/r2-t-1和r3-t關(guān)系圖。擬合得到的2 個(gè)函數(shù)關(guān)系均呈明顯的線性，這說(shuō)明聚結(jié)和奧氏熟化均是造成殼聚糖W/O型乳狀液不穩(wěn)定的原因。其中，在1/r2-t-1的函數(shù)關(guān)系中，25 ℃時(shí)擬合優(yōu)度R2為0.991，50 ℃時(shí)擬合優(yōu)度R2為0.972；在r3-t的函數(shù)關(guān)系中，25 ℃時(shí)擬合優(yōu)度R2為0.930，50 ℃時(shí)擬合優(yōu)度R2為0.901，1/r2-t-1函數(shù)的擬合效果明顯優(yōu)于函數(shù)r3-t，這一結(jié)果說(shuō)明在2 種失穩(wěn)機(jī)制中，聚結(jié)是造成負(fù)載假塑性多糖殼聚糖溶液的W/O型乳狀液失穩(wěn)的主要原因。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)目前W/O乳液主要以水或小分子水溶性物的牛頓型液體為分散相這一缺陷，采用超聲協(xié)助制備負(fù)載假塑性大分子多糖殼聚糖溶液的W/O型乳液，并對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)考察該類(lèi)型乳液的長(zhǎng)期貯存穩(wěn)定性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：內(nèi)水相含量和Span-80用量分別是影響乳液粒徑大小和粒度分布PDI的關(guān)鍵因素，且超聲功率對(duì)乳液的粒度及其分布存在過(guò)處理現(xiàn)象。利用響應(yīng)面優(yōu)化法確定的最佳工藝條件為：超聲功率300 W、超聲時(shí)間15 min、內(nèi)水相質(zhì)量分?jǐn)?shù)13%、Span-80用量6%。在此工藝條件下制備的樣品平均粒徑最小為（156.1±20.0）nm，PDI為（0.43±0.03）。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)及乳液內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)分析表明，25 ℃貯存的乳液表現(xiàn)出相當(dāng)好的穩(wěn)定性，2 h的乳層析指數(shù)為0.6%，而50 ℃貯存的乳液穩(wěn)定性急劇下降，且2 h后的乳析指數(shù)達(dá)7.0%；乳液粒度及其不均勻分布增大，不利于乳液的穩(wěn)定性，同時(shí)聚結(jié)是造成殼聚糖W/O型乳液失穩(wěn)的主要機(jī)制。