采用核酸酶酶解聯(lián)合離子交換樹(shù)脂吸附開(kāi)發(fā)低嘌呤腐竹

萬(wàn)茵，余新金，馮思麟，王家槐，肖輝，雷宇，皮瀟文，李文輝，付桂明*

1(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(南昌大學(xué))，江西 南昌，330047)2(南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌，330047) 3(北京二商(江西大觀樓)食品有限公司，江西 高安，330802)

嘌呤(purine)，又稱普林，是一類(lèi)帶堿性的2個(gè)相鄰碳氮環(huán)的含氮有機(jī)化合物，分子式C5H4N4[1]，在食品中主要以核酸、嘌呤核苷酸的形式存在[2]，在人體內(nèi)代謝成終產(chǎn)物尿酸(2,6,8-三氧嘌呤)[3]。若嘌呤代謝出現(xiàn)障礙，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體尿酸生成增加或尿酸排泄減少，出現(xiàn)高尿酸血癥[4]，超飽和的尿酸易以尿酸鈉晶體形式在各個(gè)組織和器官等處沉積(如關(guān)節(jié)、軟組織及腎器官)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)發(fā)炎、尿路結(jié)石及其他并發(fā)癥[1,5]。男性體內(nèi)血清尿酸鈉濃度超過(guò)420 μmol/L，女性超過(guò)357 μmol/L的患者易得痛風(fēng)和尿酸性結(jié)石[6]。

腐竹是大豆植物蛋白制品，其結(jié)構(gòu)為蛋白質(zhì)-脂類(lèi)薄膜，由豆?jié){中的蛋白質(zhì)受熱變性與脂類(lèi)物質(zhì)在液-氣界面吸熱聚合，同時(shí)蒸發(fā)脫水凝結(jié)而成[7]，又名腐皮，起源于唐朝，距今已有一千多年的歷史，是中國(guó)人很喜愛(ài)的傳統(tǒng)大豆制品[8]。腐竹含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，每100 g腐竹含有14 g脂肪、25.2 g蛋白質(zhì)、48.5 g糖類(lèi)及其他維生素和礦物元素[9]，素有“豆制品中的營(yíng)養(yǎng)冠軍”之稱[10]。據(jù)檢測(cè)豆制品中嘌呤含量在84.4～1 674.9 μg/g，平均為823.0 μg/g[11]，歸屬為痛風(fēng)患者宜限量食用的中等嘌呤含量食物[12]，而腐竹總嘌呤含量在1 528.1～1 669.3 μg/g，遠(yuǎn)高于豆制品的平均值，因此痛風(fēng)病人更需限量食用腐竹。

為降低豆?jié){中的核酸、核苷酸和嘌呤(統(tǒng)稱嘌呤類(lèi)物質(zhì))，本文將樹(shù)脂吸附和核酸酶酶解核酸2種方法相結(jié)合，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定去除嘌呤類(lèi)物質(zhì)的最佳技術(shù)條件，開(kāi)發(fā)出適宜高尿酸血癥等特殊人群的低嘌呤腐竹產(chǎn)品，擴(kuò)大腐竹消費(fèi)人群，同時(shí)可為其他豆制品的嘌呤去除提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：大豆，北京二商(江西大觀樓)食品有限公司提供；離子交換樹(shù)脂NUF01、NUF110、NUF10和NUF20，為向樹(shù)脂生產(chǎn)企業(yè)訂制實(shí)驗(yàn)室改良產(chǎn)品；腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤，色譜純，美國(guó)Sigma公司；四丁基氫氧化銨(含體積分?jǐn)?shù)10%的甲醇溶液)，國(guó)產(chǎn)色譜純；食品級(jí)核酸酶(4萬(wàn)U/g，5′-磷酸二酯酶)、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸、腺嘌呤核苷酸為國(guó)產(chǎn)生化試劑，KH2PO4、K2HPO4、冰乙酸、KOH、高氯酸、氯仿、正丁醇、無(wú)水乙醇、NaCl、檸檬酸三鈉、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸鈉、NaOH、氯仿、異戊醇、高氯酸鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純。

Waters高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)Waters公司；PHS-3C精密pH計(jì)、FA1604上皿分析天平、UV-7504單光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、FA-1604電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；5810R離心機(jī)，Eppendorf 股份有限公司；JJ-2高速組織搗碎機(jī)，金壇區(qū)西城新瑞儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高效液相色譜法測(cè)定嘌呤含量

Waters高效液相色譜系統(tǒng)，e2695泵，2998檢測(cè)器，Phenomenex luna 5 μm C18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)，集成自動(dòng)進(jìn)樣器，Empower Pro工作站；柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)254 nm；流速0.8 mL/min。流動(dòng)相，超純水、冰乙酸、四丁基氫氧化銨體積比為997∶1.5∶1.5的混合液[13](流動(dòng)相A)與無(wú)水甲醇(流動(dòng)相B)按97∶3的體積比混合。參照毛玉濤等[14]方法繪制嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中嘌呤含量。

1.2.2 豆?jié){中嘌呤含量的測(cè)定

1.2.2.1 原料預(yù)處理

取85 g干大豆，洗凈，加入300 g蒸餾水浸泡10 h，用高速組織搗碎機(jī)打成豆?jié){，再加入900 g蒸餾水混勻，100目紗布過(guò)濾除豆渣，得到豆?jié){樣液，分裝凍藏待用。

1.2.2.2 豆?jié){總嘌呤含量檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[15]的方法。量取2 mL豆?jié){樣液于50 mL燒杯中，加入10 mL 體積分?jǐn)?shù)70% HClO4溶液，沸水浴水解0.5 h，冰浴冷卻，用8 mol/L KOH溶液調(diào)pH至7.0，濾去沉淀，再用0.2 mol/L的冰乙酸調(diào)pH至3.0，離心，取上層清液加水定容至50 mL，取1 mL上清液過(guò)0.22 μm濾膜濾，進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.2.3 根據(jù)嘌呤核苷酸吸附率選擇樹(shù)脂

準(zhǔn)確稱量50 mg鳥(niǎo)嘌呤核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品、50 mg腺嘌呤核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品，用雙蒸水定容至500 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸和腺嘌呤核苷酸混合溶液。取30 mL 100 μg/mL核苷酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液于100 mL小燒杯中，加入1 g樹(shù)脂，置于恒溫水浴鍋，60 ℃攪拌吸附1 h，過(guò)濾，稀釋?zhuān)捎米贤夥止夤舛确ㄔ?60 nm處測(cè)光吸收值，按公式(1)計(jì)算濾液中的核苷酸含量。比較4種樹(shù)脂對(duì)核苷酸的吸附效果，選擇吸附率高的樹(shù)脂。

(1)

式中：OD260為溶液在 260 nm 波長(zhǎng)下的光吸收值；N為稀釋倍數(shù)；0.032為1 mL溶液含1 μg核苷酸的比消光系數(shù)。

1.2.4 豆?jié){的核酸酶酶解條件預(yù)實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 核酸酶用量

取30 mL豆?jié){于100 mL小燒杯中，分別加入6.67、12.33、20.00、26.67 和33.33 U/mL核酸酶，置于60 ℃恒溫?cái)嚢杷″佒忻附? h后，測(cè)定豆?jié){中核苷酸和核酸含量，按公式(2)計(jì)算酶解轉(zhuǎn)化率，并分析核酸酶用量對(duì)酶解轉(zhuǎn)化率的影響。

(2)

1.2.4.2 酶解時(shí)間

取30 mL豆?jié){于100 mL小燒杯中，加入26.67 U/mL核酸酶，置于60 ℃恒溫?cái)嚢杷″佒蟹謩e反應(yīng)0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h，分析酶解時(shí)間對(duì)酶解轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.4.3 酶解溫度

取30 mL豆?jié){于100 mL小燒杯中，加入26.67 U/mL核酸酶，置于恒溫?cái)嚢杷″佒?，分別在50、55、60、65、70和75 ℃下反應(yīng)1 h，分析酶解溫度對(duì)酶解轉(zhuǎn)化率的影響。

1.2.5 樹(shù)脂NUF20結(jié)合核酸酶酶解技術(shù)條件的確定

1.2.5.1 樹(shù)脂添加量對(duì)嘌呤吸附效果的影響

取30 mL豆?jié){于100 mL 燒杯中，分別加入3、4、5、6和7.5 g樹(shù)脂，26.67 U/mL核酸酶，置于70 ℃恒溫水浴鍋中，攪拌吸附1 h，過(guò)濾，按1.2.2.2小節(jié)方法檢測(cè)總嘌呤含量，按公式(3)計(jì)算吸附率。考察樹(shù)脂添加量對(duì)吸附效果的影響。

(3)

式中：X，豆?jié){嘌呤類(lèi)物質(zhì)的吸附率，%；ρ0，酶解吸附前豆?jié){總嘌呤質(zhì)量濃度，mg/mL；ρ，酶解吸附后豆?jié){總嘌呤質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.5.2 處理溫度對(duì)嘌呤吸附效果的影響

取30 mL豆?jié){于100 mL燒杯中，加入6 g樹(shù)脂、26.67 U/mL核酸酶，置于恒溫水浴鍋中，分別在60、70和80 ℃下攪拌吸附1 h，過(guò)濾，分析同上?？疾觳煌瑴囟葘?duì)吸附效果的影響。

1.2.5.3 處理時(shí)間對(duì)嘌呤吸附效果的影響

取30 mL豆?jié){于100 mL燒杯中，加入6 g樹(shù)脂，26.67 U/mL核酸酶，置于70 ℃恒溫水浴鍋中，分別攪拌吸附0.5、1、1.5和2 h，過(guò)濾，分析同上?？疾焯幚頃r(shí)間對(duì)吸附效果的影響。

1.2.5.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定各因素對(duì)應(yīng)水平，按L9(34)正交表安排正交試驗(yàn)。

1.2.5.5 嘌呤吸附率的計(jì)算

按公式(3)計(jì)算豆?jié){中總嘌呤類(lèi)物質(zhì)的吸附率[16]。

1.2.6 腐竹成品嘌呤含量檢測(cè)

采用煮漿揭皮鍋(由北京二商(江西大觀樓)食品有限公司提供)進(jìn)行低嘌呤腐竹工業(yè)化制作實(shí)驗(yàn)，將按照前期研究所獲最佳的酶解條件、最佳樹(shù)脂類(lèi)型及用量、最佳吸附溫度和時(shí)間處理的豆?jié){倒入揭竹盤(pán)，漿量約為盤(pán)容量的2/3，揭竹溫度控制在80～85 ℃。待豆?jié){表面自然凝固成薄膜時(shí)，用涂油的竹棍挑起，將腐竹內(nèi)的漿液控干之后烘干。稱量腐竹樣品(精確到0.000 g)于燒杯中，加入10 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的HClO4溶液，在100 ℃水浴鍋中水解1 h，冰浴冷卻，用8 mol/L KOH溶液中和水解液pH至7.0，濾去沉淀物，再用0.2 mol/L的冰乙酸溶液調(diào)pH至3.0，離心，取上清液加水定容至50 mL，再取1 mL樣品過(guò)0.22 μm濾膜，進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)采用Origin 9.0作圖，并通過(guò)SPSS 21.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1為4種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖，腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤的保留時(shí)間分別為9.859、12.580、17.364和20.439 min，各峰達(dá)到了完全分離。

圖1 四種嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatograms of four purine standards

對(duì)每種嘌呤的峰面積(Y)與對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸分析，得線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)R2及RSD于表1。由表1可知，RSD<1%，可知該方法精密度高，重現(xiàn)性很好。

表1 四種嘌呤的標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法精密度Table 1 Standard curve of four purine and accuracy of the method

2.2 豆?jié){中的嘌呤含量分析

圖2為豆?jié){經(jīng)高氯酸水解后的高效液相色譜圖，經(jīng)與圖1比對(duì)，可見(jiàn)腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤的峰的保留時(shí)間分別為9.888和12.874 min，未見(jiàn)另2種嘌呤的峰，可能是含量太低導(dǎo)致未能檢出。不同品種大豆生產(chǎn)的豆?jié){中嘌呤含量有所不同，但本文中黃嘌呤和次黃嘌呤含量很低的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。如毛玉濤等[14]測(cè)定了貴州地區(qū)大豆制作的豆?jié){中嘌呤含量，未在豆?jié){中檢測(cè)到黃嘌呤和次黃嘌呤；李慧慧等[17]采用高效液相色譜法在豆?jié){中檢出了黃嘌呤和次黃嘌呤，但含量偏低。根據(jù)計(jì)算，豆?jié){中腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤的含量分別為(52.2±1.09)和(68.9±2.28)mg/L，總嘌呤含量為(121.1±3.38)mg/L。

2.3 嘌呤核苷酸吸附效果最佳樹(shù)脂確定

由表2可見(jiàn)，樹(shù)脂NUF10和樹(shù)脂NUF20對(duì)嘌呤核苷酸的吸附效果很好，吸附率分別達(dá)到96.48%和98.4%，均超過(guò)95%，樹(shù)脂NUF110對(duì)嘌呤核苷酸吸附作用微弱，吸附率只有9.6%，而樹(shù)脂NUF01對(duì)核苷酸幾乎沒(méi)有吸附，這可能是由于不同種類(lèi)樹(shù)脂性質(zhì)和結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致對(duì)嘌呤核苷酸的吸附效果存在顯著差異。所以選定樹(shù)脂NUF20進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 豆?jié){中嘌呤的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatograms of various purines in soymilk

表2 四種樹(shù)脂對(duì)嘌呤核苷酸的吸附率 單位：%

2.4 豆?jié){的核酸酶酶解條件

由圖3-a可知，豆?jié){的核酸酶酶解條件：核酸酶用量26.67 U/mL，溫度60 ℃，酶解時(shí)間為1 h時(shí)，酶解轉(zhuǎn)化率為(79.51±1.32)%，較其他水平的高。由圖3-b可知，26.67 U/mL，溫度60 ℃，酶解時(shí)間為2 h時(shí)，酶解轉(zhuǎn)化率為(85.71±3.01)%，較其他水平的高，但1 h的酶解率即可達(dá)到(81.20±1.88)%，為了節(jié)約時(shí)間和生產(chǎn)成本，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用了1 h的作用時(shí)間。由圖3-c可知，核酸酶用量26.67 U/mL，酶解溫度在70 ℃，酶解時(shí)間為1 h時(shí)，酶解轉(zhuǎn)化率為(84.40±4.32)%，較其他水平的高。比較上述酶解轉(zhuǎn)化率數(shù)值，并參考文獻(xiàn)的報(bào)道，陳雪玉等[18]酶解RNA的水解溫度為70 ℃，慕娟[19]以麥芽根為核酸的水解酶源制備核苷酸時(shí)，酶解溫度也為70 ℃，故將核酸酶用量26.67 U/mL、酶解1 h、溫度70 ℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的參考值。

a-酶用量；b-反應(yīng)時(shí)間；c-反應(yīng)溫度圖3 酶用量、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)溫度對(duì)豆?jié){核酸酶解反應(yīng)的影響Fig.3 Effects of enzyme dosage, reaction time and reaction temperature on nuclease hydrolysis in soymilk

2.5 樹(shù)脂NUF20結(jié)合核酸酶酶解的最佳工藝條件

2.5.1 樹(shù)脂添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸附效果的影響

由圖4可知，當(dāng)樹(shù)脂的添加量逐漸增大時(shí)，嘌呤的吸附率也逐漸增大，當(dāng)樹(shù)脂添加量達(dá)到0.2 g/mL時(shí)，吸附率已趨于平穩(wěn)，反應(yīng)溫度對(duì)嘌呤吸附率的影響不是很大，70 ℃時(shí)，嘌呤吸附率最大。隨著反應(yīng)時(shí)間的增長(zhǎng)，嘌呤吸附率先明顯上升，1 h的吸附率高達(dá)95%以上，后即使時(shí)間延長(zhǎng)，吸附率仍保持相對(duì)平穩(wěn)。

由表4可見(jiàn)，R1>R2>R3，因素A對(duì)嘌呤吸附率的影響最大，其次是因素B、因素C，最佳組合為A3B3C3。但從單因素試驗(yàn)中可以得出，當(dāng)樹(shù)脂添加量為0.2 g/mL時(shí)，吸附率已趨于平穩(wěn)；當(dāng)吸附時(shí)間為1 h時(shí)，吸附率增加趨勢(shì)已經(jīng)不明顯。k2與k3相差不大，為節(jié)省能耗，縮短生產(chǎn)周期，且考慮到樹(shù)脂添加量越大以及吸附時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)豆?jié){的理化與感官性質(zhì)影響越大，故在樹(shù)脂添加量為0.2 g/mL、反應(yīng)溫度70 ℃下攪拌吸附1 h，嘌呤平均吸附率(91.73±0.32)%，即豆?jié){絕大部分嘌呤類(lèi)物質(zhì)可被除去。從文獻(xiàn)中獲知幾種對(duì)豆?jié){中嘌呤物質(zhì)的脫除方法的效果，如CaCl2對(duì)豆?jié){中嘌呤物質(zhì)的去除率為45.33%[16]，活性炭對(duì)豆?jié){中嘌呤物質(zhì)的脫除率為48.88%[20]，CaCl2鹽析結(jié)合活性炭吸附處理得到的最高嘌呤脫除率65.87%[17]。通過(guò)對(duì)比可知，本文將樹(shù)脂吸附和核酸酶酶解核酸相結(jié)合的處理方法所得到的嘌呤脫除率較高。

a-樹(shù)脂添加量；b-反應(yīng)溫度；c-反應(yīng)時(shí)間圖4 樹(shù)脂添加量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)豆?jié){中嘌呤吸附率的影響Fig.4 Effect of resin addition，reaction temperature and reaction time on purine adsorption rate in soymik

2.5.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定各因素對(duì)應(yīng)水平見(jiàn)表3。

表3 因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal experiment

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of orthogonal experiment

表5 正交試驗(yàn)方差分析表Table 5 ANOVA of orthogonal experiment

2.6 樹(shù)脂NUF20結(jié)合核酸酶酶解技術(shù)生產(chǎn)的腐竹成品降嘌呤效果分析

由表6可知，對(duì)照組腐竹總嘌呤含量為(1 226.4±8.21)μg/g，不同原材料和生產(chǎn)工藝制作而成的腐竹嘌呤含量有所不同，榮勝忠等[11]測(cè)得的腐竹嘌呤含量為(1 598.7±70.6)μg/g。與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)樹(shù)脂NUF20結(jié)合核酸酶酶解技術(shù)處理加工的腐竹產(chǎn)品，第1～5張腐竹中總嘌呤含量分別下降(89.70±0.80)%、(88.28±0.72)%、(76.69±0.41)%、(72.03±0.58)%和(65.62±0.47)%。其中，第1、2張腐竹總嘌呤含量分別為126.29和143.48 μg/g，低于普通低嘌呤食品250 μg/g限量。

表6 腐竹中嘌呤含量的變化Table 6 Change of purine content in dried beancurd sticks

3 結(jié)論

優(yōu)化得到樹(shù)脂NUF20結(jié)合核酸酶酶解吸附豆?jié){中嘌呤的工藝條件為:核酸酶26.67 U/mL，樹(shù)脂添加量0.2 g/mL，反應(yīng)溫度70 ℃下攪拌吸附1 h，豆?jié){中的嘌呤類(lèi)物質(zhì)吸附率最高達(dá)98.40%。與對(duì)照組相比，經(jīng)過(guò)樹(shù)脂NUF20結(jié)合核酸酶酶解技術(shù)處理加工的腐竹產(chǎn)品，第1～5張腐竹的嘌呤含量分別下降89.70%、88.28%、76.69%、72.03%和65.62%，其中第1、2張腐竹總嘌呤含量分別為126.29 和143.48 μg/g，屬于低嘌呤食品。據(jù)此研究開(kāi)發(fā)出一種適合具高血尿酸癥和痛風(fēng)的特殊人群的低嘌呤腐竹產(chǎn)品，豐富市場(chǎng)上腐竹產(chǎn)品的種類(lèi)，也擴(kuò)大了腐竹的消費(fèi)人群，同時(shí)可為其他豆制品中降嘌呤研究提供理論參考，能進(jìn)一步帶動(dòng)低嘌呤豆制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。