生物-化學(xué)法合成維生素D的研究進(jìn)展

曲麗莎，于文文，呂雪芹*，李江華，堵國成，劉龍*

1(江南大學(xué) 未來食品中心，江蘇 無錫，214122) 2(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

維生素D(Vitamin D, VD)，被稱為“陽光維生素”，是維持機(jī)體健康所必需的一種脂溶性維生素。麥角鈣化醇(ergocalciferol, VD2)和膽鈣化醇(Cholecalciferol, VD3)是VD系列化合物中主要的兩種存在形式[1]。人體皮膚組織內(nèi)含有大量的7-脫氫膽固醇(7-dehydrocholesterol, 7-DHC)，經(jīng)紫外光照射后會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)閂D3，該合成途徑也是人體獲得VD最主要的來源。與VD3可在體內(nèi)自主代謝合成不同，VD2在人體內(nèi)無法代謝合成，必須依靠外界的飲食攝取。

VD本身沒有生理活性，只有經(jīng)過羥基化修飾后轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问讲拍茉谌梭w內(nèi)發(fā)揮生理作用。如圖1所示，飲食攝取或人體自身合成的VD3由結(jié)合蛋白(vitamin D-binding protein, DBP)從血液轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，在肝臟中經(jīng)細(xì)胞色素P450酶羥基化修飾形成25-羥基維生素D3(25-hydroxyvitamin D3, 25(OH)D3)，25(OH)D3是VD在人體內(nèi)的主要循環(huán)方式，其濃度是衡量體內(nèi)VD狀況的標(biāo)準(zhǔn)之一。之后25(OH)D3將由DBP再次運(yùn)輸至腎臟并修飾轉(zhuǎn)變?yōu)?,25-二羥基維生素D3(calcitriol，1,25(OH)2D3)、24,25-二羥基維生素D3(24,25-hydroxyvitamin D3，24,25(OH)2D3)等活性形式[2]。

VD是骨骼正常生長發(fā)育所需的重要營養(yǎng)物質(zhì)，人體缺乏VD時(shí)會(huì)導(dǎo)致佝僂病、骨質(zhì)軟化等疾病[3]。VD不僅能夠促進(jìn)鈣磷吸收[4]，還能作用于大腦神經(jīng)，預(yù)防精神分裂癥、自閉、認(rèn)知障礙和神經(jīng)退化等疾病[5-8]，同時(shí)適當(dāng)補(bǔ)充VD可有效治療和預(yù)防糖尿病[9-10]。此外越來越多的實(shí)驗(yàn)證明,VD在治療免疫性系統(tǒng)疾病、癌癥以及心血管疾病等方面也具有良好的生理作用[11-13]。

圖1 VD活性形式轉(zhuǎn)變示意圖Fig.1 Schematic diagram of VD active form transformation

隨著VD的各種生理活性不斷被發(fā)現(xiàn)，VD的全球市場(chǎng)年需求量也在日益增長。目前工業(yè)化生產(chǎn)VD的主要方法為半化學(xué)合成法，即以膽固醇、麥角固醇、豆甾醇、巖藻甾醇以及孕烯醇酮等為底物，經(jīng)過簡單的化學(xué)反應(yīng)生成[14]。反應(yīng)底物是半化學(xué)合成的重要因素之一，如何大量廉價(jià)地獲取天然甾醇也是目前工業(yè)化生產(chǎn)VD過程中面臨的挑戰(zhàn)之一。麥角固醇、7-DHC分別是半化學(xué)合成VD2及VD3的理想前體，但這些天然甾醇在宿主中的單體含量較少，已漸漸無法滿足當(dāng)下工業(yè)化合成VD的生產(chǎn)需求。

合成生物學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)和代謝工程學(xué)的研究為基礎(chǔ)，使用工程化設(shè)計(jì)思路，將已知或未知的天然生物模塊進(jìn)行構(gòu)建串聯(lián)，從而建立全新的人工生物系統(tǒng)。隨著合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展，越來越多的代謝機(jī)理途徑得到闡明，這使得人們可以借助合成生物學(xué)在微生物細(xì)胞內(nèi)對(duì)宿主固有途徑進(jìn)行調(diào)控，協(xié)調(diào)外源基因表達(dá)模塊與內(nèi)源代謝路徑模塊，平衡各模塊之間的代謝流通量，從而在工業(yè)規(guī)模上實(shí)現(xiàn)其高效合成。這種新技術(shù)不僅可以滿足市場(chǎng)的增長需求，而且綠色環(huán)保，是解決資源可持續(xù)化問題、提高目標(biāo)代謝物產(chǎn)量的最佳途徑之一。

利用合成生物學(xué)技術(shù)在微生物體內(nèi)重構(gòu)代謝途徑是提高產(chǎn)物產(chǎn)量的有效手段。由于提高VD前體甾醇的合成是增加VD得率的關(guān)鍵步驟，因此本篇文章著重介紹當(dāng)前VD前體合成的新興技術(shù)與手段，主要包括動(dòng)態(tài)調(diào)控、亞細(xì)胞工程、無細(xì)胞系統(tǒng)、定向進(jìn)化等。

1 VD前體的生物合成進(jìn)展

1.1 VD前體生物合成途徑

如圖2所示，甾醇在細(xì)胞內(nèi)的生物合成途徑可以分為2個(gè)部分，即法尼基二焦磷酸(farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)合成途徑與后角鯊烯合成途徑[15]。

ERG10：乙酰乙酰輔酶A 硫解酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase)；ERG13：3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) synthase)；HMG1：3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶 (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase)；ERG12:甲羥戊酸激酶(mevalonate kinase)；ERG8:磷酸甲羥戊酸激酶(phosphomevalonate kinase)；ERG19：甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(mevalonate pyrophosphate decarboxylase)；IDI1：異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(isopentenyl diphosphate isomerase)；ERG20：法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthetase)；ERG1：鯊烯環(huán)氧酶(squalene epoxidase)；ERG7：羊毛甾醇合酶(lanosterol synthase)；ERG11：甾醇14α-去甲基化酶(lanosterol 14-alpha-demethylase)；ERG24：C-14甾醇還原酶(C-14 sterol reductase)；ERG25：C-4固醇甲基氧化酶(C-4 methyl sterol oxidase)；ERG26：C-3甾醇脫氫酶(C-3 sterol dehydrogenase)；ERG27：C3-酮基還原酶(3-keto sterol reductase)；ERG2：C-8 甾醇異構(gòu)酶(C-8 sterol isomerase)；ERG3：甾醇-C5-去飽和酶(sterol C5-desaturase)； ERG4：固醇C-24(28)還原酶(C-24(28) sterol reductase)；ERG5：固醇C-22-去飽和酶(C-22 sterol desaturase)；ERG6：甾醇C-24 甲基轉(zhuǎn)移酶 (Delta(24)-sterol C-methyltransferase)圖2 甾醇代謝合成途徑Fig.2 Sterol metabolic pathway

原核細(xì)胞內(nèi)的FPP主要通過2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP)途徑代謝合成，而真核生物則是通過甲羥戊酸(mevalonate，MVA)途徑合成。真核生物中含有線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，有助于關(guān)鍵酶(細(xì)胞色素P450酶、異源蛋白酶等)的表達(dá)，因此選擇真核生物如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等為底盤細(xì)胞進(jìn)行甾醇產(chǎn)量的優(yōu)化調(diào)控更為高效[16]。MVA途徑以乙酰輔酶A(acetyl coenzyme A，acetyl-CoA)為催化底物，經(jīng)多步酶作用合成FPP[17]。MVA途徑是麥角固醇與7-DHC合成的共同代謝途徑，調(diào)控MVA代謝途徑，提高FPP代謝通量是最終實(shí)現(xiàn)甾醇的高效合成的首要方法。HMGR (3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶，encoding the catalytic domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase)和IDI1都是MVA途徑代謝的主要限速酶，增加HMGR與IDI1的表達(dá)量能夠顯著提高FPP的產(chǎn)量[18]。KEASLING等在S.cerevisiae中過表達(dá)截短的HMGR(tHMGR)，減少了HMG-CoA的積累，進(jìn)而提高了甲羥戊酸的產(chǎn)量[19]。JIANG等在S.cerevisiae中過表達(dá)tHMGR和IDI1，異戊二烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)和二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)的合成產(chǎn)量明顯提高[20]。本課題組前期在枯草芽孢桿菌中通過異源表達(dá)kdpG基因，引入外源ED途徑，同時(shí)替換組成型強(qiáng)啟動(dòng)子的方式強(qiáng)化MEP途徑中的關(guān)鍵酶基因dxs、dxr、fni的表達(dá)，增強(qiáng)維生素K2前體異戊二烯焦磷酸IPP的含量，最終使維生素K2的產(chǎn)量提高到32 mg/L[21]。

FPP在角鯊烯合成酶的催化下合成角鯊烯，角鯊烯在酶催化作用下代謝合成麥角固醇。麥角固醇是細(xì)胞膜的重要組成成分，決定著結(jié)構(gòu)膜的流動(dòng)性和滲透性。強(qiáng)化ERG1、ERG4、ERG11等基因的表達(dá)最終都會(huì)提高麥角固醇的發(fā)酵產(chǎn)量[22]。POLAKOWSKI等[23]提高細(xì)胞的酯化能力，進(jìn)而增加了酵母胞內(nèi)的甾醇濃度。Are2基因編碼甾醇-?；D(zhuǎn)移酶，HE等在S.cerevisiae內(nèi)同時(shí)強(qiáng)化表達(dá)了ERG4和Are2p基因，麥角固醇的產(chǎn)量最終達(dá)到1 707 mg/L[24]。

麥角固醇的合成途徑天然存在于S.cerevisiae內(nèi)[25]，而7-DHC的合成途徑需引入外源基因3β-羥基甾醇-D24還原酶(24-dehydrocholesterol reductase, DHCR24)[26]。麥角固醇代謝途徑是合成7-DHC的最大競爭途徑，抑制或敲除ERG5、ERG6基因可以阻斷內(nèi)源性麥角固醇合成途徑[27]，促進(jìn)酵母甾醇的積累，從而有利于7-DHC的高效合成。GUO等在家雞中分離鑒定出Gg_DHCR24蛋白，異源表達(dá)后7-DHC的產(chǎn)量達(dá)到64.1 mg/L，之后組合工程技術(shù)優(yōu)化代謝途徑7-DHC的產(chǎn)量達(dá)到了1.07 g/L[28]。

1.2 代謝工程調(diào)控甾醇合成途徑

1.2.1 “推-拉-抑制”技術(shù)

Acetyl-CoA是碳代謝的關(guān)鍵中間體，其供給水平是決定MVA途徑代謝通量的首要因素。增加acetyl-CoA在MVA途徑中的供給效率，是近年來代謝工程的研究熱點(diǎn)。胞質(zhì)內(nèi)的acetyl-CoA是由丙酮酸脫羧化酶(pyruvate decarboxylase，PDC)、乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase, ALD)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)和acetyl-CoA合成酶(Acetyl-CoA synthase, ACS)等多種酶共同催化作用[29]。乙酰CoA推拉抑制策略是通過代謝工程改造天然MVA途徑和乙酰CoA途徑的常用手段。該策略包括將代謝通量“推”向乙酰CoA的有效產(chǎn)生,即過表達(dá)ACS、乙酰乙酰輔酶A硫解酶(acetoacetyl-CoA thiolase, AACT)或者重構(gòu)非天然代謝途徑[30]，使得碳代謝通量更多地流向乙酰CoA合成途徑；“拉”動(dòng)乙酰CoA的有效消耗，即過表達(dá)tHMGR、IDI1以及異戊二烯合酶(isoprene synthase, ispS)[31-32]。此外，抑制丙酮酸脫氫酶旁路(pyruvate dehydrogenase，PDH)以及乙醇降解途徑同樣可以顯著提高胞質(zhì)內(nèi)acetyl-CoA含量[33]。LIAN等[34]在S.cerevisiae中過表達(dá)ADH2、ALD6、ACS等基因，使得碳代謝通量最大化地流向acetyl-CoA合成途徑，并在此基礎(chǔ)上過表達(dá)ACL基因，催化檸檬酸生成acetyl-CoA，最終胞內(nèi)acetyl-CoA的濃度提高了3倍。SU等[35]基于模塊化途徑工程技術(shù)在S.cerevisiae內(nèi)調(diào)控優(yōu)化acetyl-CoA 的供給水平，最終7-DHC的產(chǎn)量增加了85.44%。

1.2.2 動(dòng)態(tài)調(diào)控策略技術(shù)

傳統(tǒng)的靜態(tài)調(diào)控雖然可以提高目標(biāo)代謝物的產(chǎn)量，但蛋白表達(dá)量的急劇增加會(huì)導(dǎo)致部分蛋白無法正確表達(dá)其功能，且會(huì)引起代謝失衡、有毒中間代謝物積累及細(xì)胞生長受損等問題。動(dòng)態(tài)調(diào)控是近年來新興的一種代謝工程改造策略。相比于靜態(tài)調(diào)控，動(dòng)態(tài)調(diào)控能夠響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的變化，可以在提高產(chǎn)物合成能力的同時(shí)動(dòng)態(tài)協(xié)調(diào)相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)的流量分布，從而避免靜態(tài)調(diào)控帶來的問題，因此其在近年來受到了人們的廣泛關(guān)注。

生物傳感器是構(gòu)建動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)的關(guān)鍵。轉(zhuǎn)錄因子是最具代表性的生物傳感器之一，轉(zhuǎn)錄因子是能夠結(jié)合DNA上游特異核苷酸序列并且調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄水平的一類蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)錄因子由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、鋅指結(jié)構(gòu)域等多個(gè)功能域構(gòu)成，每個(gè)區(qū)域在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄受到大量轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子對(duì)代謝途徑優(yōu)化是動(dòng)態(tài)調(diào)控策略的經(jīng)典思路。轉(zhuǎn)錄因子Upc2包含一個(gè)N末端鋅指結(jié)構(gòu)域和一個(gè)C末端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可以直接結(jié)合麥角固醇以響應(yīng)胞內(nèi)的麥角固醇濃度，進(jìn)而調(diào)控麥角固醇的生物合成。當(dāng)胞內(nèi)的麥角固醇濃度較高時(shí)，Upc2與其結(jié)合從而停留在細(xì)胞核外；當(dāng)麥角固醇濃度降低時(shí)，Upc2與麥角固醇上解離，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中以激活麥角固醇相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[36]。

天然的生物傳感器由于其內(nèi)源性的特點(diǎn)，在進(jìn)行表達(dá)時(shí)會(huì)有更好的兼容性。但天然的生物傳感器在后續(xù)應(yīng)用中存在著明顯的局限性，許多代謝物尚未發(fā)現(xiàn)與之對(duì)應(yīng)的天然生物傳感器，這極大地限制了動(dòng)態(tài)調(diào)控策略的普適性?；诖?，研究者們通過結(jié)合蛋白質(zhì)工程和生物傳感器技術(shù)，創(chuàng)造了一個(gè)全新可編程的化學(xué)誘導(dǎo)二聚體系統(tǒng)(chemically induced dimerization systems, CIDs)。不同于在已知結(jié)構(gòu)位點(diǎn)的改造，CIDs在蛋白質(zhì)異二聚體復(fù)合物的連接處構(gòu)建小分子結(jié)合位點(diǎn)，并在該聚合體上連接3～4個(gè)殘基用于與目標(biāo)配體進(jìn)行相互作用；之后借助于計(jì)算機(jī)算法篩選優(yōu)化相容的蛋白質(zhì)支架。FPP是MVA代謝合成途徑中的重要關(guān)鍵體， 篩選構(gòu)建FPP生物傳感器將具有良好應(yīng)用性。ANUM等[37]選擇FPP作為目標(biāo)配體，借助于CIDs系統(tǒng)對(duì)已有的配體-蛋白結(jié)合進(jìn)行篩選改造，最終得到了響應(yīng)FPP的生物傳感器。

群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum-sensing, QS)是動(dòng)態(tài)調(diào)控策略中另一經(jīng)典思路，該系統(tǒng)能夠較好地平衡細(xì)胞生長與代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系[38]。不同于傳統(tǒng)的人工誘導(dǎo)調(diào)節(jié)，QS能夠通過調(diào)控代謝產(chǎn)物來響應(yīng)細(xì)胞濃度的變化，即細(xì)胞濃度達(dá)到一定的閥值范圍時(shí)，控制代謝途徑的開關(guān)才會(huì)響應(yīng)表達(dá)[39]。圖3形象展示了QS系統(tǒng)在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)用。THOMAS等[40]在S.cerevisiae內(nèi)首先以響應(yīng)芳香氨基酸的啟動(dòng)子ARO9控制表達(dá)α信息素基因，使得細(xì)胞濃度與α信息素濃度相關(guān)聯(lián)；啟動(dòng)子FUS1可以響應(yīng)α信息素，因此外源基因的表達(dá)由啟動(dòng)子FUS1控制，最終構(gòu)建出適用于S.cerevisiae的QS系統(tǒng)。WILLIAMS等[41]基于QS系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)開發(fā)了雙向動(dòng)態(tài)調(diào)控系統(tǒng)。在釀酒酵母細(xì)胞中導(dǎo)入AGO1和DCR1基因，當(dāng)目標(biāo)代謝產(chǎn)物途徑響應(yīng)α信息素進(jìn)行高效表達(dá)時(shí)，雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA(dsRNA)可以靶向任何mRNA，并對(duì)其進(jìn)行降解，使目標(biāo)基因沉默。因此通過RNAi干擾對(duì)競爭代謝支路進(jìn)行抑制作用，進(jìn)而更加高效地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)代謝物的合成?；谌后w響應(yīng)具有不依賴代謝途徑，不需額外添加誘導(dǎo)劑等優(yōu)勢(shì)，本課題組前期在枯草芽孢桿菌中利用群體響應(yīng)系統(tǒng)Phr60-Rap60-Spo0A動(dòng)態(tài)調(diào)控脂溶性維生素K2的合成，使細(xì)胞的生長、有毒代謝物的積累與維生素K2的高效合成形成相對(duì)平衡的狀態(tài)，使維生素K2的產(chǎn)量相較于野生菌株產(chǎn)量提高40倍，在15 L生物反應(yīng)器中，第3天的產(chǎn)量達(dá)到200 mg/L[21]。

圖3 動(dòng)態(tài)調(diào)控Fig.3 Dynamic regulation

1.2.3 亞細(xì)胞工程

與原核生物相比，真核生物胞內(nèi)具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器。這些細(xì)胞器在微生物生長代謝過程中發(fā)揮著重要作用。亞細(xì)胞工程就是對(duì)某些特定細(xì)胞器進(jìn)行理性改造，使其能夠更加有利于目的產(chǎn)物的代謝合成。代謝區(qū)室化可以為生物合成途徑提供合適的物理化學(xué)環(huán)境、充足的前體物質(zhì)和相應(yīng)的酶。正如圖4所示的乙酰CoA，其不僅可以在胞質(zhì)內(nèi)生成，還可以在線粒體、過氧化物酶體等多個(gè)細(xì)胞器中合成[29]。這類細(xì)胞器中并沒有天然的MVA途徑存在，因此在其中重構(gòu)MVA途徑可避免其他支路途徑的競爭，提高代謝合成效率，增加FPP合成來源。線粒體基質(zhì)中氧化還原電位較高，ATP含量豐富，有利于各種生化反應(yīng)。此外線粒體內(nèi)的A乙酰CoA濃度是胞質(zhì)濃度的20～30倍，可以極大地提高M(jìn)VA途徑的代謝通量[42]。DANIELLE等[43]在MVA途徑基因N端添加特定的定位氨基酸序列，成功在線粒體內(nèi)重構(gòu)完整的MVA途徑。LV等[32]以S.cerevisiae為出發(fā)菌株，同時(shí)調(diào)控優(yōu)化胞質(zhì)產(chǎn)乙酰CoA途徑和線粒體產(chǎn)乙酰CoA途徑，促進(jìn)了細(xì)胞生長并且提高了發(fā)酵產(chǎn)率。LIU等[44]在S.cerevisiae中發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體是儲(chǔ)存角鯊烯的動(dòng)態(tài)倉庫。利用過氧酶體作為亞細(xì)胞間室進(jìn)行角鯊烯合成，使角鯊烯的發(fā)酵產(chǎn)量(1 312.82 mg/L)相對(duì)于親本菌株提高了138倍。通過細(xì)胞質(zhì)和過氧化物酶體工程的雙重調(diào)控，角鯊烯發(fā)酵產(chǎn)量進(jìn)一步提高到1 698.02 mg/L。這表明過氧化物酶體同樣具有成為甾醇類生物合成亞細(xì)胞工廠的潛能。

圖4 代謝區(qū)室化Fig.4 Metabolic compartment

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是蛋白質(zhì)合成和折疊的場(chǎng)所，當(dāng)?shù)鞍妆磉_(dá)量急劇增加時(shí)，ER無法平衡其蛋白合成與折疊修飾能力，蛋白質(zhì)的合成效率降低，部分蛋白合成后無法折疊修飾，此時(shí)需擴(kuò)張ER的尺寸進(jìn)而來恢復(fù)ER的正常生理功能。ER的尺寸調(diào)節(jié)是通過誘導(dǎo)磷脂合成實(shí)現(xiàn)的[45]，ER的擴(kuò)張不僅為細(xì)胞提供了額外的空間來容納結(jié)合蛋白，而且還提高了蛋白質(zhì)合成的能力。細(xì)胞色素P450是典型定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白酶，強(qiáng)化基因INO2的表達(dá)時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)尺寸會(huì)明顯擴(kuò)張，該類蛋白酶的活性也會(huì)因此顯著提高。因此對(duì)于含有細(xì)胞色素P450酶的代謝途徑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是理想的改造目標(biāo)。

1.2.4 無細(xì)胞系統(tǒng)

通過微生物代謝工程做到生物制品的可持續(xù)、低成本的生產(chǎn)是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的必然趨勢(shì)。而當(dāng)前技術(shù)存在的常見問題包括有毒中間體或產(chǎn)物的積累、關(guān)鍵前體在競爭途徑中的損失、最終產(chǎn)品的回收昂貴等[46]。為了克服這些局限性，無細(xì)胞代謝工程應(yīng)運(yùn)而生，其無需使用完整的細(xì)胞即可進(jìn)行精確的復(fù)雜生物分子合成。通過使用體外純化的酶或粗裂解物制備的催化蛋白集合體來擴(kuò)展傳統(tǒng)生物工程模型的范圍，以生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物[47]。圖5簡單介紹了傳統(tǒng)代謝工程和無細(xì)脆代謝工程之間的差別。由于已知每種酶組分的濃度和活性，此系統(tǒng)可以精確控制反應(yīng)條件和途徑通量。研究表明，通過無細(xì)胞系統(tǒng)可提高M(jìn)VA途徑中間體和目的產(chǎn)物的合成。RODRIGUEZ等[48]利用無細(xì)胞代謝工程對(duì)MVA途徑進(jìn)行改造，同時(shí)對(duì)酶底物和產(chǎn)物進(jìn)行及時(shí)回收，能夠生產(chǎn)40 g/L的DMAPP和IPP。

圖5 無細(xì)胞系統(tǒng)Fig.5 Cell-free system

從生物制造的角度來看，無細(xì)胞系統(tǒng)將細(xì)胞生長與代謝產(chǎn)物生產(chǎn)分開，并將所有碳通量轉(zhuǎn)移到產(chǎn)物上，可以實(shí)現(xiàn)更高的產(chǎn)率和回收率，并且更容易控制反應(yīng)條件。但是，對(duì)于一個(gè)需要大量酶參與反應(yīng)的途徑來說，利用無細(xì)胞系統(tǒng)成本較高，輔因子和酶的再生也是一個(gè)不可忽視的挑戰(zhàn)。另外，目前體外系統(tǒng)的成本遠(yuǎn)超體內(nèi)方法的成本，限制了規(guī)模的擴(kuò)大，因此大多數(shù)無細(xì)胞系統(tǒng)尚未應(yīng)用在工業(yè)化生產(chǎn)上。

1.2.5 定向進(jìn)化

定向進(jìn)化是改善微生物性能的有效方法之一，旨在篩選符合預(yù)期的正向突變體。定向進(jìn)化首先需建立基因突變庫，之后結(jié)合與高通量篩選方法快速提升蛋白的特定性質(zhì)，是目前最為常用的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)改造策略[49]?；蛲蛔儙斓臉?gòu)建手段主要包含隨機(jī)突變、半理性設(shè)計(jì)和DNA改組等。易錯(cuò)PCR是目前最常用的隨機(jī)突變方法之一，其通過改變PCR反應(yīng)條件，降低DNA聚合酶的保真性，從而提高PCR反應(yīng)的突變率，使錯(cuò)誤的堿基以一定的頻率隨機(jī)地?fù)饺氲綌U(kuò)增的基因產(chǎn)物中，得到DNA突變文庫；隨后結(jié)合高通量篩選方法篩選出符合預(yù)期目標(biāo)的突變基因[50]。IDI是甾醇代謝途徑中的關(guān)鍵限速酶之一，天然的IDI酶活性低，半衰期短，底物親和力弱。CHEN等[51]通過易錯(cuò)PCR以及組合位點(diǎn)特異性飽和誘變，篩選得到正向突變體，突變體IDI的Km比親本IDI的Km降低了10%，Kcat比原IDI提高了28%。

相比于易錯(cuò)PCR的體外建庫，ICE(Invivocontinuous evolution)是一種應(yīng)用于真核生物體內(nèi)的定向進(jìn)化策略。該策略利用酵母細(xì)胞中天然存在的Ty1轉(zhuǎn)座子，擴(kuò)展酵母體內(nèi)的誘變系統(tǒng)。將需進(jìn)化的目標(biāo)基因克隆至可誘導(dǎo)的Ty1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的基因組中，之后逆轉(zhuǎn)錄酶將Ty1基因組以非高保真形式逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后重新整合至基因組中。CROOK等[52]以S.cerevisiaeBY4741(Δrrm3)為出發(fā)菌株，基于ICE技術(shù)以木糖代謝途徑作為進(jìn)化目標(biāo)，發(fā)現(xiàn)全局代謝途徑進(jìn)化的最適突變體并非該途徑中單個(gè)酶最佳突變體的簡單疊加。

隨機(jī)突變的局限性在于所需的突變文庫較大，并且產(chǎn)生的絕大多數(shù)突變體不符合預(yù)期性能或性能不佳。而半理性設(shè)計(jì)可以在人工選擇的特定位置或區(qū)域內(nèi)進(jìn)行隨機(jī)突變，可以大大縮小突變文庫的容量，更易于篩選。FISCHER等[53]對(duì)ERG20進(jìn)行同源模建，發(fā)現(xiàn)第197位的賴氨酸(Lys)是關(guān)鍵活性位點(diǎn)，之后以代謝物香葉醇產(chǎn)量作為酶活的間接表征方法，對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行了一系列的定點(diǎn)突變，最終香葉醇的發(fā)酵產(chǎn)量提高約10～20倍，間接證明了突變后的ERG20酶活的顯著提高。

與ICE策略類似，EvolvR系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)的定點(diǎn)突變[54]。該系統(tǒng)包含一個(gè)含有導(dǎo)向序列(gRNA)的質(zhì)粒，改造后的enCas9蛋白(改造后其與非特異性DNA的親和力降低)，以及與enCas9蛋白融合表達(dá)的非高保真DNA聚合酶。當(dāng)gRNA引導(dǎo)enCas9-DNA聚合酶融合蛋白至基因組上的靶向位點(diǎn)時(shí)，enCas9蛋白與靶基因結(jié)合使DNA雙鏈斷裂，然后非高保真DNA聚合酶對(duì)切口進(jìn)行靶向突變。EvolvR可以同時(shí)對(duì)多個(gè)靶向基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，且在酵母細(xì)胞中具有傳代時(shí)間短、細(xì)胞生長繁殖快速等優(yōu)勢(shì)。EvolvR技術(shù)為高等真核生物體內(nèi)定向突變提供了一個(gè)高效的平臺(tái)，但該技術(shù)目前仍存在一定的缺陷性，即胞內(nèi)會(huì)存在游離的非高保真DNA聚合酶對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行低概率的突變，因此距離實(shí)現(xiàn)完全定向的突變?nèi)跃哂幸欢ǖ木嚯x。

定向進(jìn)化是當(dāng)前備受矚目的研究熱點(diǎn)領(lǐng)域。通過對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行多輪突變、表達(dá)和篩選，引導(dǎo)蛋白質(zhì)的性能朝著預(yù)期方向進(jìn)化，進(jìn)而大幅縮短蛋白質(zhì)進(jìn)化的過程[55]。但定向進(jìn)化存在的最大挑戰(zhàn)即是如何建立適宜高效的篩選方法，目前較為普遍的篩選方法是選擇適合的生物傳感器， 并以熒光基因表征突變結(jié)果。但如前文所述，許多代謝物目前仍未有與之響應(yīng)的生物傳感器，無法結(jié)合高通量篩選技術(shù)，這也成為定向進(jìn)化技術(shù)提高應(yīng)用普適性的難題之一。

2 光化學(xué)合成VD

VD是由關(guān)鍵前體甾醇經(jīng)過光化學(xué)開環(huán)反應(yīng)產(chǎn)生的。VD的光合作用是一個(gè)由多條異構(gòu)化反應(yīng)組成的復(fù)雜分支網(wǎng)絡(luò)。

麥角固醇轉(zhuǎn)化為VD2的過程中，影響VD2的轉(zhuǎn)化率關(guān)鍵在于光源的選擇和光轉(zhuǎn)化器構(gòu)造。目前國內(nèi)光源的選擇一般選用低壓和高壓汞燈兩種。在VD2的光化學(xué)反應(yīng)中波長的選擇很重要。275～300 nm波長范圍內(nèi)，280～284 nm的紫外光有利于生成VD2，短于280 nm的光易于生成速甾醇，而長于284 nm的光容易生成光甾醇，VD2過度照射，過度輻射還會(huì)生成毒甾醇等物質(zhì)[56]，因此VD2的光轉(zhuǎn)化中熒光燈的波長范圍要求極其嚴(yán)格。圖6展示了VD在光照條件下的像話轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)，波長為283 nm的低壓汞蒸氣紫外熒光燈照射麥角固醇，轉(zhuǎn)化效果最佳，麥角固醇轉(zhuǎn)化率50%以上，VD2收率在70%以上[57]。

圖6 VD的光化學(xué)反應(yīng)Fig.6 Photochemical reaction of VD

7-DHC則會(huì)被290～315 nm波長的光子異構(gòu)化為VD3，這與紫外線B (UVB)的電磁波譜范圍相對(duì)應(yīng)。FUSEO等提出利用連續(xù)微流系統(tǒng)合成VD3[58]，與傳統(tǒng)的兩步法合成VD3不同，該方法在微反應(yīng)器中可以同時(shí)進(jìn)行光反應(yīng)和熱反應(yīng)。7-DHC在反應(yīng)器中光異構(gòu)化后轉(zhuǎn)化為維生素原D3，維生素原D3繼續(xù)熱異構(gòu)化轉(zhuǎn)化為VD3。相比于傳統(tǒng)光合成法，該方法收率高(HPLC-UV:60%，分離率:32%)，操作簡便且無需純化中間產(chǎn)物維生素原D3，具有良好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

3 展望

隨著人們逐漸意識(shí)到VD對(duì)于維持機(jī)體健康的重要意義，其全球年市場(chǎng)需求量也因此持續(xù)增加，但關(guān)鍵前體甾醇的供給不足卻成為限制VD產(chǎn)能擴(kuò)大的主要因素之一[59-60]。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控重構(gòu)甾醇代謝途徑，利用微生物發(fā)酵的方式制備甾醇成為解決甾醇可持續(xù)平穩(wěn)供給的有效技術(shù)之一。

本文著重從推-拉-抑制、動(dòng)態(tài)調(diào)控、亞細(xì)胞工程、無細(xì)胞系統(tǒng)、定向進(jìn)化等方面闡述了代謝工程技術(shù)在甾醇代謝調(diào)控領(lǐng)域的研究應(yīng)用。然而這些方法雖能夠顯著地提高甾醇代謝途徑的催化效率與產(chǎn)量，但仍有些許方面值得進(jìn)一步研究與探索：

(1)如何高效實(shí)現(xiàn)酶的催化活性？

酶的豐度和活性共同決定了酶的催化效率，過表達(dá)基因增加酶的豐度雖然在一定程度上可以提高酶的催化效率，但當(dāng)豐度達(dá)到一定閾值后，酶的催化活性卻無法繼續(xù)提高，其主要因素之一就是忽視了輔因子在代謝途徑中的關(guān)鍵作用[61]。MVA途徑代謝過程中需要NADPH、ATP等輔因子的參與[62]，因此在提高酶豐度的同時(shí)需增加NADPH、ATP等輔因子的供給。調(diào)控NADH激酶、NADP+依賴型脫氫酶增強(qiáng)NADPH合成途徑，重構(gòu)、替換消耗NADPH的支路代謝途徑，使得NADPH等輔因子最大化地流向MVA代謝途徑。輔因子的相對(duì)平衡是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要條件之一，而胞內(nèi)全局的輔因子調(diào)控則需要對(duì)輔因子的合成、分布、運(yùn)輸和調(diào)節(jié)機(jī)制完全了解。

(2)如何實(shí)現(xiàn)甾醇代謝途徑的整體定向進(jìn)化？

定向進(jìn)化可以改善細(xì)胞魯棒性，優(yōu)化細(xì)胞性能。然而目前定向進(jìn)化主要集中于 “點(diǎn)”的進(jìn)化，即對(duì)某一特定酶的改造。但代謝途徑的催化效率并非是各種酶的簡單疊加，每個(gè)“點(diǎn)”在整個(gè)代謝途徑中需要的是最適的催化效率而非最高的催化效率。甾醇合成途徑包含MVA途徑、后角鯊烯途徑等，涉及到多種蛋白酶，且許多中間代謝物沒有與之特異響應(yīng)的生物傳感器，無法建立合適的高通量篩選方法。ICE與CIDs策略的交叉結(jié)合將成為解決這一難題的突破口，ICE策略有望實(shí)現(xiàn)甾醇代謝途徑的全局性進(jìn)化，而CIDs策略則可以計(jì)算、模擬、構(gòu)建出非天然的生物傳感器，建立高效、簡便的高通量篩選方案。

(3)如何真正實(shí)現(xiàn)從頭合成VD？

目前工業(yè)化制備VD的方法是以甾醇為前體，再經(jīng)過化學(xué)合成得到VD。如何在細(xì)胞內(nèi)真正實(shí)現(xiàn)從頭合成VD將會(huì)是未來研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)，其關(guān)鍵在于是否能夠鑒定或人工設(shè)計(jì)出特定的酶來實(shí)現(xiàn)光化學(xué)合成這一步驟的功能[63]。酶工程是一種具有針對(duì)性的策略，借助蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和計(jì)算機(jī)模擬，酶工程可以提高酶的特異性和效率，甚至為特定的反應(yīng)創(chuàng)造非天然的酶[64]。隨著結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的催化酶晶體結(jié)構(gòu)得到了解析，這為鑒定未知酶、構(gòu)建非天然酶提供了可行性基礎(chǔ)。