梯度平衡法改善豬卵巢組織玻璃化保存效果

畢星宇，蘇丹，朱鵬飛，張棟棟，武學(xué)清

(山西省婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，太原 030013)

人類生育力是人類繁衍生息、社會(huì)文明得以延續(xù)的基本推動(dòng)力，是推動(dòng)人類社會(huì)進(jìn)步和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的基礎(chǔ)保障。隨著惡性腫瘤發(fā)病率逐年增加、發(fā)病年齡逐漸降低以及生育年齡推遲等原因，對(duì)生育力保存的需求急劇增加[1]。生育力保存將是未來幾年面臨的重大挑戰(zhàn)。女性生育力保存的主要方法有胚胎冷凍、卵子冷凍及卵巢組織冷凍。胚胎冷凍及卵子冷凍技術(shù)已經(jīng)成熟，應(yīng)用也已經(jīng)非常廣泛。卵巢組織冷凍技術(shù)也在近幾年迅速發(fā)展，越來越多的研究者關(guān)注這項(xiàng)技術(shù)[2-3]，并不斷改進(jìn)方法，減少凍融操作對(duì)卵巢組織的損傷[4-8]。本研究觀察了梯度平衡法對(duì)卵巢組織玻璃化保存效果的影響。

材料與方法

一、動(dòng)物及試劑

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)用豬品系為大白×長白雜交F1代，7月齡，雌性，飼養(yǎng)條件清潔級(jí)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批號(hào)：IRB-KYYN-2020-001。實(shí)驗(yàn)所用卵巢取自同一品系同月齡的3只豬，取到新鮮豬卵巢后迅速運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。將卵巢沖洗干凈，小心將卵巢皮質(zhì)切成2 cm×2 cm×1 mm 大小的組織片備用。

2.主要試劑：平衡液(ES，7.5%乙二醇+7.5%二甲基亞砜)、玻璃化冷凍液(VS，15%乙二醇+15%二甲基亞砜+0.5 mol/L蔗糖)、解凍液(TS，1 mol/L蔗糖)、稀釋液(DS，0.5 mol/L蔗糖)、沖洗液(WS，0.25 mol/L蔗糖)。乙二醇、二甲基亞砜、蔗糖(Sigma，美國)，GB培養(yǎng)液(COOK，美國)，TUNEL檢測(cè)試劑盒(Roche，瑞士)。

二、研究方法

1.實(shí)驗(yàn)分組：根據(jù)樣品處理方法不同分為對(duì)照組、梯度平衡組和直接平衡組。對(duì)照組為新鮮豬卵巢，梯度平衡組采用梯度平衡法冷凍豬卵巢，直接平衡組采用直接平衡法冷凍豬卵巢。對(duì)照組和解凍后的梯度平衡組、直接平衡組卵巢組織均進(jìn)行切片，HE染色和TUNEL檢測(cè)。

2.卵巢組織玻璃化冷凍：(1)直接平衡法：將組織切片洗干凈后置于ES平衡液里25 min。將組織切片轉(zhuǎn)移到VS中放置15 min，期間可觀察到組織切片沉至培養(yǎng)皿底部。將組織切片放置到載桿上迅速投到液氮中保存。(2)梯度平衡法：梯度平衡法是對(duì)玻璃化冷凍的第一步平衡條件進(jìn)行優(yōu)化。具體操作步驟為：組織片置于GB培養(yǎng)液中，先加入等體積ES平衡液，10 min后再加入等體積ES平衡液，10 min后將組織片置于純ES平衡液中。其他步驟與直接平衡法一致。

3.卵巢組織玻璃化解凍：將載桿從液氮中取出并快速投到37℃預(yù)熱的TS液中，將組織片輕輕剝離下來，靜置1 min。將組織片轉(zhuǎn)移到DS液中，靜置3 min。轉(zhuǎn)移到WS液中，靜置5 min。再將組織片轉(zhuǎn)移到新WS液中，靜置5 min。然后將組織置于4%多聚甲醛中備用。

4.卵巢組織切片、HE染色及形態(tài)學(xué)觀察：將組織置于4%多聚甲醛中固定，酒精梯度脫水，石蠟包埋，切片，切片厚度5 μm，連續(xù)切片，每10張切片選1張做HE染色；每張切片選取5個(gè)視野，共選取60個(gè)視野，根據(jù)Gouge on標(biāo)準(zhǔn)[9]對(duì)卵泡形態(tài)進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野中原始卵泡、初級(jí)卵泡正常個(gè)數(shù)及總個(gè)數(shù)。

5.卵巢組織原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)技術(shù)檢測(cè)卵泡凋亡情況：組織切片脫蠟復(fù)水后，蛋白酶K室溫孵育30 min，然后使用TUNEL試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。TUNEL陽性凋亡細(xì)胞可以觀察到綠色熒光，正常細(xì)胞只能觀察到細(xì)胞核DAPI藍(lán)色熒光。組織切片每隔10張切片選取1張進(jìn)行染色，染色后每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，共選取60個(gè)視野進(jìn)行拍照、計(jì)數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行分析。兩組形態(tài)學(xué)正常卵泡的百分率和凋亡百分率采用χ2檢驗(yàn)分析；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組卵巢切片組織形態(tài)學(xué)比較

3組卵巢切片HE染色后鏡下觀察卵泡形態(tài)，對(duì)照組卵母細(xì)胞胞質(zhì)及細(xì)胞核形態(tài)正常，顆粒細(xì)胞整齊排列在卵母細(xì)胞周圍，梯度平衡組和直接平衡組的卵母細(xì)胞胞質(zhì)或細(xì)胞核皺縮，顆粒細(xì)胞排列松散雜亂甚至缺失(圖1)。

與對(duì)照組相比，梯度平衡組和直接平衡組的卵泡正常率均有所下降(均P<0.05)，但是這兩組相比沒有顯著差異(P>0.05)(表1)。

A：對(duì)照組；B：梯度平衡組；C：直接平衡組；黑色箭頭示異常卵泡圖1 各組卵巢組織形態(tài)(HE染色 ×200)

表1 各組卵巢組織中卵泡形態(tài)正常率比較(%)

二、各組卵巢細(xì)胞凋亡率比較

3組卵巢組織切片TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，各組均有不同程度的細(xì)胞凋亡(圖2)。以梯度平衡組為例，對(duì)不同類型的細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、顆粒細(xì)胞均發(fā)生了凋亡(圖3)。

分別統(tǒng)計(jì)3組卵巢基質(zhì)細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞的凋亡率，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，梯度平衡組與直接平衡組的細(xì)胞凋亡率均有顯著增加(P<0.05)，但梯度平衡組相對(duì)于直接平衡組卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞凋亡率(分別為14.8% vs. 17.6%、13.8% vs. 15.2%和15.7% vs. 18.5%)均顯著降低(P<0.05)(表2)。

DAPI：藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核；TUNEL：綠色熒光標(biāo)記凋亡細(xì)胞；Merge：兩種熒光疊加；scale bar=50 μm圖2 各組卵巢組織TUNEL檢測(cè)(×200)

A：基質(zhì)細(xì)胞；B：顆粒細(xì)胞；C、D：卵母細(xì)胞；黃色箭頭示凋亡細(xì)胞，白色箭頭示正常細(xì)胞；scale bar=50 μm圖3 梯度平衡組中不同類型細(xì)胞凋亡觀察(TUNEL染色 ×400)

組 別卵母細(xì)胞凋亡率顆粒細(xì)胞凋亡率基質(zhì)細(xì)胞凋亡率對(duì)照組 9.3(18/194)8.5(226/2 659)10.6(355/3 361)梯度平衡組14.8(25/169)*13.8(319/2 312)*15.7(480/3 059)*直接平衡組17.6(30/170)*#15.2(328/2 158)*#18.5(640/3 472)*#

討 論

近年來的生育年齡后延、環(huán)境污染、惡性疾病年輕化等因素，導(dǎo)致人類生育力正在面臨前所未有的威脅。因此，制定生育力保護(hù)策略顯得尤為重要。隨著人們的生活質(zhì)量提高和生活方式的改變，腫瘤疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，腫瘤患者保存生殖能力的需求也越來越迫切。

卵母細(xì)胞凍存、胚胎凍存、卵巢組織凍存等技術(shù)的發(fā)展為女性生育力保護(hù)提供了可行性。卵母細(xì)胞凍存及胚胎凍存技術(shù)已經(jīng)成熟，并得到了廣泛應(yīng)用，解凍后存活率及移植妊娠率均在較高水平。但是卵母細(xì)胞凍存和胚胎凍存受配偶及性成熟的限制，采用的促排卵治療方案也可能延誤腫瘤患者最佳治療時(shí)機(jī)。相對(duì)于卵母細(xì)胞及胚胎冷凍而言，卵巢組織冷凍不受性成熟年齡、生理周期及配偶限制，而且生育力儲(chǔ)備大，不需要刺激卵巢、不耽誤腫瘤治療、不存在誘發(fā)腫瘤惡變的可能[10-11]，所以玻璃化冷凍卵巢組織在腫瘤患者放化療之前的生育力保存[12-14]及卵巢早衰患者的體外激活[15]等方面有廣泛的應(yīng)用前景，適用于無法進(jìn)行促排卵治療和青春期前的年輕女性患者。目前，已經(jīng)有很多女性通過卵巢組織冷凍保存生育力，解凍移植后成功受孕[16-17]。卵巢組織冷凍雖然可以保存大量的卵泡(主要是原始及初級(jí)卵泡)以備患者將來使用[18]，但卵巢中數(shù)以萬計(jì)的原始及初級(jí)卵泡在經(jīng)過冷凍解凍的過程中會(huì)受到損傷，如何減少這一過程中對(duì)卵泡造成的損傷，改善凍融效果是目前需要解決的問題。

卵巢組織玻璃化冷凍作為一個(gè)新興的技術(shù)，越來越多的受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注，已經(jīng)有研究者從冷凍載體類型、復(fù)溫時(shí)間等角度研究優(yōu)化玻璃化凍融效果[4-8]，但是利用梯度平衡法優(yōu)化卵巢組織冷凍效果尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究首次提出利用梯度平衡法優(yōu)化卵巢組織凍融效果，并在組織形態(tài)學(xué)及細(xì)胞凋亡水平對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。在玻璃化冷凍中，平衡是非常關(guān)鍵的一步。平衡液中的冷凍保護(hù)劑對(duì)于細(xì)胞而言是一種高滲溶液，卵巢中顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞接觸到冷凍保護(hù)劑的瞬間會(huì)迅速脫水收縮，但隨著冷凍保護(hù)劑進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓逐漸一致，顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞會(huì)恢復(fù)原狀。此過程中，高濃度的冷凍保護(hù)劑可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，從而引起細(xì)胞凋亡。本文提出一種梯度平衡法，先讓細(xì)胞接觸低濃度的冷凍保護(hù)劑然后逐漸提高冷凍保護(hù)劑的濃度，最終達(dá)到細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。這樣就可以減緩高濃度冷凍保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞的瞬間沖擊，減少細(xì)胞凋亡率。卵巢組織冷凍的目的主要是保存卵巢中的原始及初級(jí)卵泡，原始及初級(jí)卵泡中未成熟的卵母細(xì)胞對(duì)于環(huán)境的變化極其敏感，我們采用梯度平衡法減少冷凍過程對(duì)于細(xì)胞的損傷，使凍融的效果更好。

卵巢組織切片HE染色實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，玻璃化凍融會(huì)影響卵巢組織形態(tài)，降低卵泡正常率，但是未發(fā)現(xiàn)梯度平衡法對(duì)于卵巢組織玻璃化凍融后形態(tài)學(xué)有改善效果。TUNEL檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組，梯度平衡組和直接平衡組卵母細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、顆粒細(xì)胞的凋亡率均顯著增加，說明玻璃化冷凍對(duì)卵巢組織不同類型細(xì)胞均會(huì)造成一定損傷。但是與直接平衡組相比，梯度平衡組卵母細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、顆粒細(xì)胞的凋亡率顯著降低，說明梯度平衡法可以降低卵巢組織冷凍過程中造成的細(xì)胞凋亡，改善玻璃化凍融的效果。玻璃化凍融對(duì)細(xì)胞凋亡的影響可能比對(duì)卵巢形態(tài)的影響更直接，所以在形態(tài)學(xué)上未反映出梯度平衡法的優(yōu)勢(shì)，而在細(xì)胞凋亡方面梯度平衡法效果比較顯著。利用梯度平衡法可以有效減少卵巢卵母細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、顆粒細(xì)胞的凋亡率，如果應(yīng)用于人類卵巢組織冷凍中，就可以減少復(fù)蘇后的卵巢組織細(xì)胞的凋亡。從而使重新移植回患者體內(nèi)的卵巢組織更好的發(fā)育，提高患者獲卵率及卵母細(xì)胞質(zhì)量。

我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中初步探討了梯度平衡法對(duì)于豬卵巢玻璃化凍融后組織形態(tài)學(xué)及卵泡凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)梯度平衡法可以降低豬卵巢凍融后卵泡的凋亡率。此技術(shù)是否可以運(yùn)用到人類卵巢玻璃化冷凍，對(duì)于后續(xù)卵子成熟、受精是否有影響，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。卵巢組織玻璃化凍融技術(shù)的不斷優(yōu)化，將會(huì)使卵巢組織凍融在女性生育力保存方面有更廣泛的臨床應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步深入研究。