生物條形碼檢測技術(shù)及其研究進(jìn)展

劉 培，尹會敏，穆文靜，栗 慧，武二斌，魏 東*

1河北北方學(xué)院河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河北 張家口 075000；2河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院, 河北 張家口 075000；3河北北方學(xué)院張家口市特色農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000；4張家口市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所, 河北 張家口 075000

近年來，生物條形碼檢測(bio-bar codes assay，BCA)技術(shù)在醫(yī)學(xué)、臨床檢測、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、納米技術(shù)等領(lǐng)域都有不斷的發(fā)展和探索。這種超靈敏納米顆粒擴(kuò)增檢測系統(tǒng)最早于2003年提出，用于檢測前列腺特異性抗原(Nametal.,2003)。隨著對蛋白質(zhì)、核酸等大分子和小分子物質(zhì)的檢測分析要求越來越高，傳統(tǒng)的免疫分析方法在蛋白質(zhì)超靈敏檢測方面存在不足，其主要原因是缺乏直接擴(kuò)增技術(shù)，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)。因此，在一些檢測方法中，條形碼DNA需要通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增，或者對擴(kuò)增后的條形碼進(jìn)行電泳或聯(lián)合技術(shù)芯片檢測。目前，BCA技術(shù)已成為臨床診斷、微量分析等各個(gè)領(lǐng)域的新技術(shù)，具有靈敏度高、操作簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)可實(shí)現(xiàn)探針的間接擴(kuò)增，廣泛用于大分子或小分子物質(zhì)的高靈敏、高特異性檢測(Tangetal.,2018)。

1 生物條形碼檢測技術(shù)的原理

BCA是指將相同序列的寡核苷酸作為探針，經(jīng)化學(xué)、靜電耦合、自組裝等方式將探針固定在金納米顆粒表面，然后把探針當(dāng)作檢測對象，形成“AUNP-目標(biāo)物-MMP”的三明治結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)超高靈敏度檢測的方法。用于檢測BCA的生物探針分為納米金顆粒(gold nanoparticle，AUNP)探針和磁性微球(magnetic microparticles，MMP)探針。將該檢測技術(shù)的操作過程總結(jié)為以下幾個(gè)步驟：制作和識別AUNP探針，MMP探針的制作與識別，夾層結(jié)構(gòu)的形成，獲得條形碼DNA，檢測條形碼DNA(高璇等，2016)。BCA是基于納米金和核苷酸鏈的信號放大技術(shù)通過抗體識別檢測高靈敏度目標(biāo)化合物(Tangetal.,2010)。Nametal.(2003)發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)在檢測過程中，檢測探針和識別探針分別與不同的單抗、多抗及DNA結(jié)合，其主要是通過與目的蛋白對應(yīng)的單克隆和多克隆抗體來實(shí)現(xiàn)特異性檢測。BCA能夠?qū)崿F(xiàn)多重信號擴(kuò)增，不需要酶擴(kuò)增技術(shù)，是目前能夠?qū)崿F(xiàn)和PCR具有相同靈敏度且都不需要酶擴(kuò)增技術(shù)的檢測方法(杜鵬飛等，2016；劉軍等，2015；Aminietal.，2017; Zhangetal.,2010)。

2 生物條形碼檢測技術(shù)的應(yīng)用

BCA技術(shù)被應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物、核酸、病毒、食源性病原體、生物毒素和環(huán)境污染物的檢測。檢測蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)時(shí)，則是將AUNP表面的條形碼DNA修飾并且與目標(biāo)分子(DNA)相匹配，然后與附在磁性納米顆粒上的互補(bǔ)DNA混合，形成一個(gè)包含DNA-AUNP/目標(biāo)分子/互補(bǔ)DNA-MMP的三明治結(jié)構(gòu)，從而測定目標(biāo)分子的數(shù)量。Narmanietal.(2018)建立了一種基于MMP和AUNP的熒光DNA生物傳感器方法，用于檢測霍亂弧菌VibriocholeraeO1OmpW基因，其結(jié)果表明，在5～250 ng·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為2.34 ng·mL-1。Lietal.(2018)開發(fā)了一種基于酪酰胺信號擴(kuò)增和AUNP標(biāo)記的免疫測定方法，用電感耦合等離子質(zhì)譜對α胎兒蛋白進(jìn)行高靈敏度檢測，檢出限為1.85 pg·mL-1，線性范圍為0.005～2 ng·mL-1，該方法重復(fù)性好，可用于血清中其他大分子的檢測。雖然BCA技術(shù)提高了檢測的靈敏度和速度，但其相關(guān)實(shí)驗(yàn)參數(shù)還需進(jìn)一步優(yōu)化。

農(nóng)藥、生物毒素等小分子物質(zhì)的檢測則是將運(yùn)輸?shù)鞍椎妮d體物質(zhì)和農(nóng)藥小分子半抗原結(jié)合，并在磁性納米粒子表面形成MMP探針。把抗體與DNA鏈在納米金表面連接，相互反應(yīng)后，DNA鏈在AUNP表面又形成納米復(fù)合探針，農(nóng)藥小分子與在磁性納米粒子表面的抗原產(chǎn)生競爭，并再次結(jié)合成納米金復(fù)合探針，那么表面的抗體就會形成競爭型免疫化學(xué)反應(yīng)體系(Duetal.，2016，2018)。Hongetal.(2018)開發(fā)了一種直接競爭仿生酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，用于測定樣品中的三唑磷。該方法的線性范圍為0.001～10000 μg·L-1，回歸系數(shù)為0.977，其靈敏度和檢出限分別為428和0.001 μg·L-1，結(jié)果表明該方法更靈敏。Yuetal.(2018)建立了一種檢測黃曲霉毒素B1的BCA技術(shù)，其靈敏度約為10-8ng·mL-1，遠(yuǎn)高于ELISA的靈敏度。這也是首次將BCA技術(shù)應(yīng)用于中草藥中黃曲霉毒素B1的分析。該方法可用于花生ArachishypogaeaLinn.、腰果AnacardiumoccidentalieLinn.等堅(jiān)果類食品中黃曲霉毒素B1的微量檢測。

3 生物條形碼檢測技術(shù)與其他技術(shù)的應(yīng)用

3.1 基于生物芯片銀染的生物條形碼免疫分析

近些年，由AUNP和巰基改良組裝的寡核苷酸的研究引起了廣泛的關(guān)注。AUNP表面積比較大，故可以單獨(dú)結(jié)合許多寡核苷酸，且?guī)€基也可通過修改的寡核苷酸使Au-S鍵與納米金緊密相連，形成一個(gè)探測器，在某些情況下可以與互補(bǔ)的核苷酸序列結(jié)合，從而達(dá)到核酸檢測目的。此方法與銀染法結(jié)合在檢測斑點(diǎn)雜交和芯片等區(qū)域，選擇性高且靈敏度高。生物條形碼免疫分析已通過生物芯片的銀染法確立，如大分子物質(zhì)的檢測只能在三明治的結(jié)構(gòu)模型中找到，而小分子物質(zhì)由于只有一個(gè)組件綁定抗原結(jié)構(gòu)模型。因此，目前適用于生物條形碼免疫系統(tǒng)分析不適用于小分子物質(zhì)，如農(nóng)獸藥、生物毒素等(鄒艷輝等，2014)。杜鵬飛(2017)利用研究小分子競爭型免疫化學(xué)反應(yīng)體系，建立了基于生物芯片銀染技術(shù)的高靈敏度可視化BCA技術(shù)，使該技術(shù)在小分子檢測中得到廣泛應(yīng)用。

3.2 基于酶標(biāo)納米金探針的生物條形碼免疫分析

酶標(biāo)納米金技術(shù)最早應(yīng)用于蛋白的檢測(Liuetal.,2010b)。Liuetal.(2010a)利用生物素-親和素系統(tǒng)構(gòu)筑了新的多功能金納米復(fù)合探針，并開發(fā)出了基于納米金復(fù)合探針的免疫法。三明治免疫反應(yīng)不僅增長了與每一個(gè)免疫復(fù)合體相關(guān)聯(lián)的HRP分子的數(shù)量，同時(shí)也增強(qiáng)了信號強(qiáng)度，檢測限12 pg·mL-1，具有良好的特異性。利用生物素親和素系統(tǒng)，可以增強(qiáng)農(nóng)藥殘留與生物條形碼的敏感性和方便性，再把納米金復(fù)合探針上的復(fù)合納米金探針標(biāo)記上HRP分子，同時(shí)在磁探針結(jié)合之前，形成一個(gè)競爭系統(tǒng)的檢測。

3.3 基于生物傳感器的生物條形碼檢測

生物傳感器技術(shù)是生物活性物質(zhì)或生物本身(如酶、組織、微生物、細(xì)胞、免疫等)作為識別元件與被檢物質(zhì)發(fā)生物理化學(xué)反應(yīng)(如電、光、熱、質(zhì)量)再通過換能器轉(zhuǎn)換為可測的電化學(xué)、壓電、熱學(xué)、光學(xué)等信號，進(jìn)行信號檢測，從而獲得被檢物的數(shù)量(劉慧等，2021)。Zhengetal.(2018)開發(fā)了一種新的生物傳感器方法，用AUNP來指示不同濃度的大腸桿菌O157∶H7，并使用智能手機(jī)成像APP監(jiān)測AUNP的顏色變化，來確定細(xì)菌的數(shù)量。該生物傳感器對大腸桿菌的特異性和靈敏度很好，且檢出限低于50 CFU·mL-1。王曉飛等(2021)用基于適配體識別和BCA放大策略的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器方法研究粘蛋白和特定細(xì)胞。通過測量電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞濃度的對數(shù)相比，當(dāng)在4～800 pg·mL-1和30～5.0×10-4cells·mL-1范圍時(shí)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.5 pg·mL-1和9 cells·mL-1。該方法為高靈敏的檢測蛋白提供了新的方法。

3.4 基于PCR的生物條形碼免疫分析

PCR是生物分子擴(kuò)增的最常用手段，也是核酸檢測最敏感的方法。PCR是指在生物體外放大的一種特定的DNA序列的技術(shù)。自1985年首次提出PCR概念以來，PCR技術(shù)經(jīng)歷了三代技術(shù)革新。第一代PCR技術(shù)是瓊脂凝膠電泳，常用該方法對目的DNA進(jìn)行定性分析。第二代PCR技術(shù)是實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantification PCR, qPCR)。第三代PCR技術(shù)是數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)，該概念最初于1999年提出。其中，qPCR已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)療診斷和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。

3.4.1 常規(guī)PCR生物條形碼免疫分析 PCR技術(shù)是當(dāng)前檢測核酸最常用的方法之一。為增強(qiáng)BCA的敏感性，可采用PCR的檢驗(yàn)方法。在DNA檢測過程中，可將條形碼DNA作為模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳來測量條形碼DNA的數(shù)量。

3.4.2 基于qPCR的生物條形碼免疫分析 qPCR是熒光標(biāo)記或熒光染料結(jié)合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在此階段中，直接放大產(chǎn)物的熒光信號值和數(shù)量呈正相關(guān)的關(guān)系，此值可以實(shí)時(shí)監(jiān)控樣品中核酸的數(shù)量，并且依照樣品的吸光值，可以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，這是可以準(zhǔn)確定量核酸含量的一個(gè)示例(Yangetal.,2015)。此方法先將抗體修飾的AUNP、目標(biāo)物質(zhì)與MMP混合，形成三明治結(jié)構(gòu)，然后通過競爭反應(yīng)，將AUNP上的抗體與MMP結(jié)合，經(jīng)加熱釋放AUNP表面的信號DNA后，再通過PCR和qPCR來檢測,該方法的檢出限1 fg·mL-1，變異系數(shù)3.39%～6.84%(Yinetal.,2012)。為了降低產(chǎn)物的增加與空氣環(huán)境的干擾，在PCR擴(kuò)增的過程中，基本上不能打開玻璃管，這樣在很大程度上降低了污染的可能性。Jietal.(2018)為了讓人血病毒抗原的檢測更靈敏，應(yīng)用了基于qPCR的方法檢測。先利用基因庫中的特定植物序列與條形碼DNA對比無同源性后，然后獲得特異性條形碼DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒，此方法的靈敏度高、重現(xiàn)性好。

3.4.3 免疫PCR生物條形碼檢測技術(shù) 傳統(tǒng)的PCR、qPCR與BCA的結(jié)合改進(jìn)了BCA的特異性、敏感性及自動(dòng)化水平，但這些方法仍然離不開磁珠的磁分離過程，使檢測過程復(fù)雜化，無法達(dá)到“下一代”測序樣本的測定和計(jì)算。在超微量分析檢測中，過度的磁分離過程也會導(dǎo)致敏感性的降低和人為操作誤差的增加，但是免疫PCR和BCA的結(jié)合可以較好地處理這些問題(Caoetal.,2010; Heetal.,2013)。目前，該方法已被應(yīng)用于病毒、病原體和環(huán)境污染物的檢測。其原理是將包被在酶標(biāo)板或PCR管上的抗原抗體反應(yīng)后，生成夾層復(fù)合物。再把捕獲的抗體以及被條形碼DNA修飾的納米金復(fù)合探針固定在酶標(biāo)板或PCR管上，之后加熱使探針表面的DNA變性釋放出DNA條形碼，最后用PCR擴(kuò)增的方法來分析和檢測，實(shí)現(xiàn)測量目標(biāo)分子的目的。Guanetal.(2021)用來檢測食品中的草甘膦，草甘膦是世界上應(yīng)用最廣泛的廣譜除草劑。用基于AUNP的生物條形碼免疫PCR方法檢測，草甘膦檢測的線性范圍為61.1 pg·g-1～31.3 ng·g-1，檢出限為4.5 pg·g-1，比使用同一抗體開發(fā)的常規(guī)ELISA(70.0 μg·g-1)低7個(gè)數(shù)量級且檢測時(shí)間短，該方法具有良好的敏感性、特異性、回收率和穩(wěn)定性。

3.4.4 基于數(shù)字PCR技術(shù)的生物條形碼檢測技術(shù) dPCR的基本原理是一個(gè)樣本被無限的稀釋，從而將樣本分成數(shù)百個(gè)甚至是數(shù)百萬個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)單元，在每一個(gè)單元里，有一個(gè)、多個(gè)或者沒有目標(biāo)DNA鏈，再在每個(gè)單元格里進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后再對每個(gè)單元格內(nèi)的陽性和陰性信號進(jìn)行記錄并用泊松分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理和方法來對目標(biāo)分子的含量進(jìn)行確定(崔雪妍，2019)。微流控芯片數(shù)字PCR、微滴數(shù)字PCR和水晶數(shù)字PCR，其中微滴數(shù)字PCR是應(yīng)用最廣泛的。肖芳等(2021)用微滴數(shù)字PCR研究轉(zhuǎn)基因玉米MON87427，結(jié)果準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性均較好。Liuetal.(2019)用微滴數(shù)字PCR檢測柑橘黃靜脈清除病毒(Citrusyellowveinclearingvirus, CYVCV)，該病毒是影響檸檬CitruslimonBurm.生產(chǎn)最厲害的病原菌，在感染潛伏期和高溫條件下情況下更易被檢測出來，且在實(shí)驗(yàn)過程中未擴(kuò)增出其他相關(guān)的柑橘病毒，說明該方法的特異性、準(zhǔn)確度、靈敏度更高。

3.5 基于微孔板銀染的生物條形碼免疫分析

近年來，關(guān)于把生物素-親和素系統(tǒng)使用于BCA技術(shù)中的方法越來越普遍，首先將生物素親和素中具有強(qiáng)親和力的功能牢固地定在微孔板中，然后加入銀染增強(qiáng)液，再利用普通酶標(biāo)儀來測定放大了信號的條形碼，最后可以實(shí)現(xiàn)在同一時(shí)間內(nèi)通過肉眼就可以觀察其檢測的結(jié)果(Yangetal.,2008)。為進(jìn)一步簡化BCA檢測過程中AUNP探針的制備過程，在AUNP探針表面上只修飾一種巰基單鏈DNA，如用二硫蘇糖醇技術(shù)，而不是熱變性釋放表面的納米金DNA鏈(Hill & Mirkin, 2006)。因此，BCA通過與生物素-親和素聯(lián)接，就可以構(gòu)建一個(gè)用普通酶標(biāo)儀就能達(dá)到檢驗(yàn)農(nóng)藥殘留的高敏捷的新方法，并且能夠正確地評價(jià)此方法。

4 問題與展望

BCA技術(shù)與現(xiàn)代標(biāo)記免疫分析的首選標(biāo)準(zhǔn)ELISA相比，靈敏度高5～6個(gè)數(shù)量級,檢測時(shí)間至少節(jié)省3 h(Wangetal.2019),這表明BCA測定技術(shù)取得了很大的進(jìn)步。但這種方法本身有缺點(diǎn)，主要出現(xiàn)在條形碼DNA分析中。在芯片測試中，因?yàn)殂y染料本身的缺陷，假陽性反應(yīng)的可能性更高，且會隨著時(shí)間、環(huán)境等因素變化，與其余的核酸檢測法相對比，靈敏度沒有優(yōu)勢。綜合優(yōu)化反應(yīng)條件，不僅減少了反應(yīng)的時(shí)間增強(qiáng)檢測的靈敏度，而且降低試驗(yàn)成本，更有利于實(shí)用和推廣。因此，提高此方法的利用率是近年來重要的研究方向。李德雪等(2008)用qPCR替代了傳統(tǒng)的PCR和芯片檢測方法，建立了熒光定量BCA系統(tǒng)，改進(jìn)了BCA技術(shù)的不足。

經(jīng)過十幾年的發(fā)展和探索，BCA技術(shù)已經(jīng)建立了簡單可靠的高效體系，可用于蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)和小分子物質(zhì)的檢測。與其他檢測技術(shù)相比，其優(yōu)勢：一是用于BCA技術(shù)的納米材料安全且不易與目標(biāo)分子結(jié)合變性；二是高特異性和高靈敏度使其具有廣闊的應(yīng)用前景；三是該方法在小分子物質(zhì)檢測中性價(jià)比高、速度快、操作簡單。但是BCA技術(shù)尚未完全成熟，方法的每一個(gè)組成部分都可能影響其靈敏度和特異性。因此，探索最佳反應(yīng)條件、降低檢測成本、進(jìn)一步簡化操作步驟、提高檢測靈敏度、縮短制備和檢測時(shí)間、實(shí)現(xiàn)同一反應(yīng)體系中多種物質(zhì)的檢測、制備免疫生物條形碼試劑盒是未來BCA標(biāo)準(zhǔn)化和商業(yè)化的重要研究方向。