納豆激酶液體混菌發(fā)酵工藝研究

李珊珊， 周伏忠， 刁文濤， 王雪妍， 馮 菲， 陳曉飛

（河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450008）

溶栓是預(yù)防和治療血栓疾病的主要方法，但目前治療該類疾病的藥物均存在很多缺點(diǎn)，通過細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)的納豆激酶（NK），能很好地彌補(bǔ)傳統(tǒng)溶栓藥物的不足，有望成為臨床上的第三代溶栓藥物［1-4］. 以NK作為輔助溶栓的保健食品，已在歐美和日本盛行20多年，且在抗菌、抗線蟲、防止骨質(zhì)疏松、阿爾茨海默病治療和臨床手術(shù)中，同樣具有不可估量的潛在應(yīng)用價值［5-8］.

目前國內(nèi)關(guān)于NK的報道，大多集中在固體發(fā)酵制備納豆、納豆膠囊、納豆粉等保健食品方面，但固體發(fā)酵培養(yǎng)基成分復(fù)雜，不利于提純等操作；而液體發(fā)酵工藝簡單，易控制，規(guī)模易擴(kuò)大，更適合工業(yè)化生產(chǎn)，且最重要的是有利于后期的純化處理［9-10］. 目前關(guān)于我國NK的相關(guān)報道中，NK液體發(fā)酵酶活相對較低（大多在900～1300 IU/mL）［11-13］，不能滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求，因此獲得高產(chǎn)NK的生產(chǎn)菌株和液體發(fā)酵工藝是其產(chǎn)業(yè)化的必經(jīng)之路.

本研究用實驗室復(fù)合誘變選育的5株NK高產(chǎn)突變菌株，通過隨機(jī)組合的方法，篩選混菌發(fā)酵的菌株組合，隨后通過單因素試驗和正交試驗確定最佳發(fā)酵工藝. 這種方法是通過兩種或多種微生物的協(xié)同作用，共同完成發(fā)酵過程的混菌發(fā)酵技術(shù)，不需要進(jìn)行復(fù)雜的DNA體外重組，卻可以取得純種培養(yǎng)無法達(dá)到的效果，如提高產(chǎn)品產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)及獲得特殊代謝產(chǎn)物等［14］.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本實驗所用NK生產(chǎn)菌株CBL-2-7-10-6、PXDBJ-13-9-7-18、DNS-17-3-15-7、LJJ-1-13-12-4和L-5-8-15，分別為本院實驗室保藏的CBL-2、PCDBJ-13、DNS-17、LJJ-1和L經(jīng)復(fù)合誘變后選育的NK正向突變株，CBL-2為解淀粉芽孢桿菌，LJJ-1為多黏芽孢桿菌，其余3株均為枯草芽孢桿菌［15］.

1.1.2 主要試劑 牛纖維蛋白原、凝血酶和標(biāo)準(zhǔn)尿激酶購自中國藥品生物制品檢定所，其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.1.3 培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，加水定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min.

液體發(fā)酵培養(yǎng)基［16］：大豆蛋白胨25 g，葡萄糖20 g，MgSO40.5 g，CaCl20.2 g，K2HPO42 g，KH2PO41 g，加水800 mL溶解后調(diào)pH7.0，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min.

1.2 研究方法

1.2.1 不同發(fā)酵時間對NK 活性的影響 采用液體發(fā)酵培養(yǎng)基，35 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 h取樣測定NK活性，繪制實驗用的5個菌株不同發(fā)酵時間產(chǎn)NK活性曲線，在此基礎(chǔ)上，確定液體發(fā)酵時間.

1.2.2 混菌發(fā)酵最佳組合的篩選 對5個菌株隨機(jī)組合，進(jìn)行混菌發(fā)酵（混菌發(fā)酵不超過3個菌株，發(fā)酵時間依據(jù)NK活性的試驗結(jié)果而定）. 然后測定發(fā)酵液的NK活性，確定混菌發(fā)酵的最佳組合.

1.2.3 混菌發(fā)酵工藝研究 參考張琳等［12］和王艷艷等［17］的方法略加修改，通過單因素試驗和正交試驗，確定混菌發(fā)酵工藝（培養(yǎng)基、pH、發(fā)酵溫度及各菌株接種量等）.

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)酵時間對NK活性的影響

實驗用的5個菌株（CBL-2-7-10-6、PXDBJ-13-9-7-18、DNS-17-3-15-7、LJJ-1-13-12-4和L-5-8-15）液體發(fā)酵產(chǎn)NK活性隨發(fā)酵時間的變化曲線見圖1.

圖1 NK活性隨發(fā)酵時間的變化曲線Fig.1 The variation curve of NK activity with fermentation time

由圖1可以看出，這5個菌株隨發(fā)酵時間的變化曲線基本相似，在接種15 h時發(fā)酵液均基本無法檢測到NK活性；20 h后，各菌株開始逐漸進(jìn)入NK生產(chǎn)階段；接種20～35 h時，發(fā)酵液NK活性隨發(fā)酵時間的延長呈指數(shù)級增長；至接種35～45 h時間段內(nèi)，隨發(fā)酵時間的延長，NK活性增長速度逐漸放緩；發(fā)酵45～50 h時相對穩(wěn)定；50 h時達(dá)到最大，此后NK活性開始逐漸下降. 因此，確定NK液體發(fā)酵時間為50 h.

2.2 混菌發(fā)酵最佳組合的篩選

將5個突變菌株通過隨機(jī)組合的方法，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，發(fā)酵50 h后，通過血纖維平板法測定發(fā)酵液的NK活性，確定最佳組合. 隨機(jī)組合方案及發(fā)酵液產(chǎn)NK活性結(jié)果見表1.

表1 5突變株隨機(jī)組合及其發(fā)酵液NK活性Tab.1 Random combination of 5 mutants and NK activity of their fermentation broths

從表1可以看出，25個組合中，只有5個組合（3、5、8、12、17組合）發(fā)酵產(chǎn)NK活性，顯著高于組合中任何菌株單獨(dú)發(fā)酵的NK活性，說明這5個組合在發(fā)酵過程中，不同菌株之間可能具有相互協(xié)同作用，而其余組合液體發(fā)酵產(chǎn)NK活性均不比組合中產(chǎn)NK活性高的菌株單獨(dú)發(fā)酵效果好；其中組合5液體發(fā)酵產(chǎn)NK 活性最高，達(dá)3 092.35 IU/mL，較單菌株發(fā)酵最高酶活（第23組合發(fā)酵的NK活性2 096.57 IU/mL）提高了47.5%. 因此，確定混菌發(fā)酵的最佳組合為組合5的3個突變菌株.

2.3 發(fā)酵工藝研究

2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基中碳氮源及其添加量對發(fā)酵液NK活性的影響 通過正交試驗，對發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、氮源、碳氮源添加量進(jìn)行了正交試驗研究，正交試驗因素水平設(shè)計見表2.

按照330 μL/100 mL 的量接種CBL-2-7-10-6、DNS-17-3-15-7 和L-5-8-15（第5組合）種子液，在pH7.0、35 ℃及搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min 的條件下，發(fā)酵50 h后測定發(fā)酵液NK活性，結(jié)果見表3.

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源配方正交試驗因素水平Tab.2 Factors and levels of the orthogonal test for the optimization of carbon and nitrogen formula in the medium

表3 發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源配方正交試驗結(jié)果Tab.3 The orthogonal test results of the carbon and nitrogen source formula of fermentation medium

由發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮源配方正交試驗結(jié)果（表3）可知，影響以上3個菌株液體混合發(fā)酵產(chǎn)NK活性的主次因素依次為氮源＞碳源＞碳氮源添加量，最佳碳氮源配方為表2中培養(yǎng)基的碳氮源分別為葡萄糖和大豆蛋白胨，且二者的添加量在培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為4%.

2.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基中無機(jī)離子添加量對NK活性的影響 在前面研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過正交試驗，對液體培養(yǎng)基中MgSO4、CaCl2、K2HPO4和KH2PO4等無機(jī)鹽的添加量進(jìn)行了正交試驗研究，即在培養(yǎng)基中葡萄糖和大豆蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為4%的基礎(chǔ)上，將上述無機(jī)鹽分別加入不同培養(yǎng)基中（表4）. 按照前面接種和發(fā)酵條件發(fā)酵后，測定發(fā)酵液NK活性，結(jié)果見表5.

表4 發(fā)酵培養(yǎng)基中無機(jī)鹽添加量正交試驗因素水平Tab.4 Factors and levels of the orthogonal test for the optimization of inorganic salt addition formula in the medium

由表5可以看出，表1中組合5的菌株混合發(fā)酵液體培養(yǎng)基中，無機(jī)離子的含量對發(fā)酵液NK活性影響的主次因素依次為MgSO4＞CaCl2＞（K2HPO4+KH2PO4）. 經(jīng)正交試驗分析，最佳組合為A2B3C1，即發(fā)酵液中無機(jī)鹽MgSO4、CaCl2和K2HPO4+KH2PO4的添加量分別為0.04%、0.06%和0.2%+0.1%.

因此，結(jié)合兩個正交實驗的結(jié)果，確定表1中組合5（CBL-2-7-10-6、DNS-17-3-15-7、L-5-8-15）的3個突變菌株液體混合發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖4%、大豆蛋白胨4%、MgSO40.04%、CaCl20.06%、K2HPO40.2%、KH2PO40.1%.

表5 發(fā)酵培養(yǎng)基中無機(jī)鹽添加量正交試驗結(jié)果Tab.5 Orthogonal test results of the amount of inorganic salt added in fermentation medium

2.3.3 初始pH 和發(fā)酵溫度的影響 本試驗研究了初始pH 和發(fā)酵溫度對CBL-2-7-10-6、DNS-17-3-15-7和L-5-8-15（表1中組合5的3個突變菌株）混菌發(fā)酵的影響. 即在最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，設(shè)置不同初始pH（pH 4、5、6、7、8、9、10）進(jìn)行發(fā)酵，確定最適pH；隨后，在最適pH 下，設(shè)置不同發(fā)酵溫度（25、28、31、34、37、40 ℃），確定最適發(fā)酵溫度，結(jié)果見圖2和圖3.

圖2 pH對產(chǎn)NK活性的影響Fig.2 Effects of fermentation pH on NK activity

圖3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)NK活性的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on NK activity

由圖2可以看出，初始發(fā)酵pH對上面3個菌株混菌產(chǎn)NK活性的影響顯著. 當(dāng)初始發(fā)酵pH為7時，混合發(fā)酵產(chǎn)NK活性最強(qiáng)，可達(dá)到4200 IU/mL以上，且在初始pH為6～8時，發(fā)酵液產(chǎn)NK活性相對穩(wěn)定，但當(dāng)初始pH＜6或＞8時，隨著pH偏離7越遠(yuǎn)，發(fā)酵液產(chǎn)NK活性下降越快，這與大多數(shù)報道的結(jié)果一致，因此，確定這3個菌株混合發(fā)酵的最適初始pH為7.

從圖3可以發(fā)現(xiàn)，CBL-2-7-10-6、DNS-17-3-15-7和L-5-8-15這3個突變株混菌發(fā)酵產(chǎn)NK活性受發(fā)酵溫度影響的曲線與受pH影響的曲線有些相似，均為兩邊低中間高的半圓形弧線. 根據(jù)圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為28～34 ℃時，其變化對NK活性的影響較小，尤其溫度在31～34 ℃之間變化時，對NK活性幾乎沒有影響. 但當(dāng)發(fā)酵溫度低于28 ℃時，隨發(fā)酵溫度的降低，NK活性顯著下降. 同樣，當(dāng)發(fā)酵溫度高于37 ℃時，NK活性隨著的升高急劇下降. 從節(jié)約成本的角度考慮，確定發(fā)酵溫度為31 ℃.

2.3.4 各菌株接種量對混菌發(fā)酵產(chǎn)NK 活性的影響 在上述試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過正交試驗，測定了CBL-2-7-10-6、DNS-17-3-15-7和L-5-8-15突變菌株接種量對混菌發(fā)酵產(chǎn)NK活性的影響，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表6和表7.

表6 混菌發(fā)酵不同菌株接種量正交試驗因素水平Tab.6 Factors and levels of the orthogonal test for the inoculation amounts of different strains in mixed fermentation單位：μL·100 mL-1

表7 混菌發(fā)酵不同菌株接種量正交試驗結(jié)果Tab.7 Orthogonal test results of the inoculation amounts of different strains in mixed fermentation

由表7 可以看出，混菌發(fā)酵中，突變菌株的接種量對NK 活性影響的主次因素依次為：CBL-2-7-10-6＞L-5-8-15＞DNS-17-3-15-7. 經(jīng)正交試驗分析，最佳接種量組合為A2B2C3，即CBL-2-7-10-6、L-5-8-15 和DNS-17-3-15-7 的接種量分別為670、670 和1000 μL/100 mL，在此條件下，混菌發(fā)酵的NK 活性可以達(dá)到4 952.33 IU/mL.

3 討論

在多菌株混合發(fā)酵中，不同菌株之間可以通過相同功能、但不同特性的酶之間的聯(lián)合作用，而提高其活力［14，18-19］. 本研究用實驗室誘變選育的5 個突變株，通過隨機(jī)組合的方法，篩選混菌發(fā)酵的最佳組合，最終確定了CBL-2-7-10-6、DNS-17-3-15-7、L-5-8-15 組合. 按照接種量均為330 μL/100 mL 的混合發(fā)酵組合，這3 個突變菌株混合發(fā)酵后NK 活性可以達(dá)到3 092.35 IU/mL，較這3 個菌株單獨(dú)發(fā)酵的最大酶活（2 096.57 IU/mL）提高了47.5%，說明不同菌株之間協(xié)同作用效果顯著，這與劉軍［14］等在淀粉酶研究中報道的結(jié)果相似. 隨后，通過一系列正交試驗和單因素試驗，確定了這3個突變菌株混菌發(fā)酵的培養(yǎng)基和最佳發(fā)酵工藝：①發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%、大豆蛋白胨4%、MgSO40.04%、CaCl20.06%、K2HPO40.2%、KH2PO40.1%，初始pH7.0. ②突變菌株CBL-2-7-10-6、DNS-17-3-15-7和L-5-8-15的接種量分別為670、670、1000 μL/100 mL，發(fā)酵溫度31 ℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min，發(fā)酵時間50 h. 在此條件下，發(fā)酵液酶活可以達(dá)到4 952.33 IU/mL，是本研究單菌株發(fā)酵最高酶活（DNS-17-3-15-7發(fā)酵的NK活性2 096.57 IU/mL）的2.36倍，與現(xiàn)有報道［12，20-21］相比，本研究確定的這3個突變菌株混合發(fā)酵工藝，產(chǎn)NK能力的優(yōu)勢非常突出，從而為液體發(fā)酵產(chǎn)NK的工業(yè)化奠定了堅實的基礎(chǔ).