一種黃曲霉毒素M1 快速檢測試紙條檢測性能的評估

周剛剛，邢 凱，王楚端

（1.國家知識產(chǎn)權局，北京 100088；2.北京農(nóng)學院動物科學技術學院，北京 102206；3.中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，北京 100193）

黃曲霉毒素（Aflatoxins）是天然產(chǎn)生的真菌毒素，是黃曲霉、寄生曲霉和特曲霉等真菌的次級代謝產(chǎn)物[1]，主要有黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2等20 多種，其中以黃曲霉毒素B1（AFB1）為主，是目前已知的致癌性最強的化學物質。黃曲霉毒素主要污染谷物（如玉米、大豆、小麥等）。根據(jù)FAO 調(diào)查，全球每年谷物的25%會受到不同程度的霉菌毒素污染[2]。黃曲霉毒素污染谷物后，會繼續(xù)存在于谷物加工的食品、飼料及各類副產(chǎn)品中，其經(jīng)動物體代謝后主要產(chǎn)物為黃曲霉毒素M1（AFM1）。以奶牛為例，其采食被污染的飼料后很容易在乳汁中殘留AFM1，對人體健康造成嚴重危害。目前國內(nèi)外均對AFM1的污染做出嚴格的殘留限量（MRL）要求，其中尤以歐盟最為嚴格，其規(guī)定牛乳中AFM1的MRL 為50 ng/L[3]。

目前檢測AFM1的主要方法有酶聯(lián)免疫法[4]、液相色譜質譜聯(lián)用法[5]、膠體金免疫層析法[6]等，其中以膠體金層析法最為方便，是奶站、牧場和基層檢測中應用較為廣泛的手段之一。由于AFM1限量要求高，對檢測試劑性能要求也高，因此非常有必要對其性能進行充分驗證，以確保滿足實際生產(chǎn)檢測需求。本研究即根據(jù)歐盟參考實驗室方案CRL Guidelines 2010[6]對自制的AFM1檢測試紙條的檢測精密度、特異性、假陽性率和假陰性率、重復性、穩(wěn)定性、樣本差異影響、批間差異及試劑盒穩(wěn)定性分別檢測，并通過膠體金讀數(shù)儀對檢測數(shù)據(jù)分析，為相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 膠體金讀數(shù)儀（TSR100，杭州奧盛儀器有限公司），孵育器（mini 型，杭州奧盛儀器有限公司），移液器（200 μL，大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)有限公司），牛乳分析儀（保加利亞LactoScan）；AFB1、AFM1及玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、赭曲霉毒素和伏馬毒素標準品來自于Sigma，抗生素標準品來自于中監(jiān)所和上海阿拉丁公司。

AFM1檢測試劑盒（德國R-biopharM），AFM1檢測試紙條由本單位自制（檢測限為50 ng/L，批號為RB190101、RB190111 和RB190201）。

1.2 樣本檢測 牛奶樣本由本單位收集，UHT 奶和巴氏殺菌奶采購自本地超市。牛奶樣品不需要前處理。室溫下，將AFM1檢測試紙條放入奶樣中5 Min 取出。結果可以通過膠體金讀數(shù)儀定量讀取和顯色定性2 種方法讀取。

1.3 精密度檢測 將經(jīng)過確認沒有AFM1污染的牛奶樣本（AFM1＜5 ng/L，以下簡稱空白奶樣）用AFM1標準品添加5 個不同濃度（0、25、50、75、100 ng/L），每個濃度做20 個重復，用AFM1膠體金檢測試紙條檢測；50 ng/L 做60 個重復用膠體金試紙條檢測，并用膠體金讀數(shù)儀做定量分析，計算不同濃度檢測結果。

1.4 特異性檢測 根據(jù)歐盟對不同藥物的MRL 要求，如表1 所示，將不同濃度的交叉反應物質添加至空白奶樣中，然后用AFM1膠體金檢測試紙條檢測，并定量分析檢測結果。

表1 特異性檢測物質及添加濃度

1.5 假陽性率和假陰性率檢測 將采集自不同牛場的101 份奶樣和100 份奶站收集的奶樣用自制的AFM1膠體金檢測試紙條檢測，并用AFM1ELISA 檢測試劑盒對樣本結果進行復核，計算試紙條檢測的假陽性率和假陰性率。同時，用SPSS 22.0 計算2 種結果的相關性。

1.6 重復性檢測 將空白奶樣用AFM1標準品添加0、25、75、100 ng/L，然后用不同試紙條各檢測10 次，計算不同測定間的變化來判定試紙條檢測的重復性；同時將同一試紙條多次檢測，以檢測結果來評價試紙條讀數(shù)儀的重復性。

1.7 穩(wěn)健性檢測 為了進一步確認試紙條的檢測性能，通過變化樣本來檢測添加濃度為50 ng/L AFM1標準品的空白奶樣，具體如下：對加樣體積做適當調(diào)整（±10%），即由200 μL 調(diào)整至180、220 μL；對奶樣的溫度做出變化，測定冷藏后的4℃以及室溫20℃；將牛奶離心脫脂后繼續(xù)檢測。通過3 種調(diào)整對比試紙條對樣本條件變化的適應性。

1.8 樣本差異影響 牛奶由于牛個體差異呈現(xiàn)出脂肪、蛋白、體細胞數(shù)等的差異，并且隨著泌乳階段的不同，其乳成分含量也會不同。通過乳成分分析儀對收集的奶樣本分類，對比檢測脂肪含量（＜2 g/100mL，＞6 g/100 mL），蛋白含量（＜3 g/100 mL，＞4 g/100 mL），pH（pH 6.0，pH 7.5）對檢測結果的影響，將上述不同樣本添加50 ng/L AFM1標準品，以膠體金試紙條檢測，分析檢測結果。

1.9 試劑穩(wěn)定性 將檢測試紙條保存于37℃加速老化，分別于第1、2、3、5、7、15、30、60 天抽取檢測添加濃度為50 ng/L AFM1標準品的空白奶樣，根據(jù)結果判定試紙條的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 檢測性能 由表2 可知，奶樣添加濃度小于歐盟MRL 50 ng/L 時，檢測結果均小于50 ng/L，即試紙條可在歐盟MRL 水平準確檢測奶樣中的AFM1是否超標；添加AFM1濃度為50 ng/L 時，檢測結果范圍為36.3～68.2 ng/L，即定量檢測時，超過36.3 ng/L 即可認為是陽性，需要進一步用儀器法確認。

對不同濃度的檢測數(shù)據(jù)進一步分析可知，試紙條檢測空白奶樣（0 ng/L）AFM1時，平均值為5.969 ng/L，標準差為5.205 ng/L，根據(jù)CRL 2010 要求計算其定性檢出限（Mean +3×SD）為21.58 ng/L，定量檢出限（Mean+10×SD）為58.01 ng/L。

表2 不同添加濃度檢測結果

2.2 特異性 如圖1 所示，黃曲霉毒素M2添加濃度為50 ng/L 時，檢出為平均值為43.1 ng/L，交叉反應為0.86%，其他藥物交叉反應均小于0.5%。

圖1 AFM1 試紙條特異性檢測結果

2.3 假陽性率和假陰性率 以試紙條方法檢出限（21.58 ng/L）為判定標準，對101 份奶樣檢測出陽性2 份，試劑盒檢測為全部陰性，假陽性率為1.98%；100 份奶站收集的樣本經(jīng)檢測其中有2 份陽性值大于檢出限，試劑盒檢測為全部陰性，假陽性率為2%；綜合考慮試紙條的假陽性率為2%，假陰性率為0。同時發(fā)現(xiàn)，2 種方法的檢測結果呈高度的正相關（R2=0.95，P＜0.05）。

2.4 重復性 由表3 可知，檢出濃度為1～100 ng/L 時，檢測結果變異系數(shù)為6.18%～16.81%。

表3 膠體金試紙條重復性的檢測結果

如表4 所示，膠體金讀數(shù)儀的重復性CV 在1.327%～11.556%。

表4 膠體金讀數(shù)儀的重復性檢測結果

綜合判定，試紙條檢測結果的CV 小于20%，可滿足實際檢測需求。

2.5 穩(wěn)健性 對加樣體積做±10%調(diào)整后的檢測結果如表5 所示，加樣量變化對空白樣本的檢測結果影響不大，對添加AFM150 ng/L 的樣本，當加樣量較大（超過220 μL）時，檢測結果由部分樣本變化較大，由此可推測過大加樣量可能會影響檢測結果。

表5 不同加樣體積的檢測結果

如表6 所示，其中4℃的奶樣檢測結果稍微偏低，20℃結果正常，表明試紙條試劑檢測的奶樣溫度最好控制在20℃左右。

表6 不同奶樣溫度的檢測結果

添加50 ng/L AFM1的全脂牛奶經(jīng)2 600 g× 4℃離心10 min 前后檢測，結果如表7 所示，脫脂前檢測結果正常，而脫脂后檢測結果偏高，表明脂肪含量變化對檢測結果有一定影響。

表7 奶樣脫脂處理的檢測結果

2.6 樣本差異影響 由圖2 和圖3 可知，不同類型的樣本，空白樣本檢出值均小試紙條的理論檢出限（21.58 ng/L），均為陰性；添加50 ng/L AFM1的樣本，不同樣本檢出結果平均值也接近于50 ng/L，樣本間差異較小，即試紙條的樣本適應性良好。

2.7 試劑穩(wěn)定性 檢測試劑盒于37℃加速老化，分別于第1、2、3、5、7、15、30、60 天抽取檢測添加濃度為50 ng/L AFM1標準品的空白奶樣結果如圖4 所示，隨保存期限的增加試紙條檢測值逐漸降低。在第15 天時，檢測平均值降低至48.235 ng/L；保存至第30 天時，檢測值為39.43 ng/L；以50 ng/L 的定性檢出限來判定，試紙條在37℃至少可保存15 d。

圖2 不同類型的空白樣本檢測結果匯總

圖3 添加50 ng/L 的不同樣本檢測結果匯總

圖4 37℃保存期檢測結果匯總

3 討 論

膠體金是一種具有一定尺寸，可以保持穩(wěn)定膠體狀態(tài)的貴金屬納米粒子[7]。膠體金試紙條方法是一種以膠體金為示蹤物的快速免疫分析技術，具有簡便、快速等優(yōu)勢，能滿足現(xiàn)場檢測的要求[8]。膠體金試紙條檢測方法作為目前牧場、奶站及乳品加工企業(yè)應用最為廣泛的檢測手段，因其成本低、操作方便備受歡迎。歐盟、美國均對檢測試紙條的標準及應用做出相應的規(guī)定。以歐盟為例，CRL Guidelines 2010[6]標題全稱為“獸藥殘留快速篩選方法驗證指南”，其主要是針對快速篩選方法的性能指標的評定和驗證做出全面的規(guī)定，而具有ISO/IEC17025 資質的實驗室可以進一步據(jù)此指南對方法做出評價，如法國標準協(xié)會AFNOR 就依此推出了NF Validation，聯(lián)合其成員實驗室對快速檢測方法評價。本研究中，采用歐盟標準下的標準驗證本試紙條的可靠性，檢測能力滿足歐盟MRL（50 ng/L）要求。

AFM1含量是奶制品檢測中重要的檢測項目，其結果直接關系到奶制品的質量安全。目前，酶聯(lián)免疫吸附法（ELLSA）、液相色譜質譜聯(lián)用法等方法是檢測AFM1的主要方法[9]。ELLSA 方法是將抗體抗原反應的特異性和酶與底物顯色反應的高效催化作用有機結合而成的分析技術，其檢測成功的關鍵是獲得特異性較高的高活性抗體。但是目前報道抗體在其特異性、敏感性以及穩(wěn)定性上都有一定缺陷[10]。同時，由于牛奶中的組成比較復雜，包括糖類、脂肪、蛋白質等，容易影響ELLSA 方法中酶和抗體的活性。因此在使用不同來源ELLSA 試劑盒時候要進行科學的評價。高效液相色譜法（HPLC）法是目前國內(nèi)外檢測AFM1的重要方法，具有高效、靈敏、快速、準確、特異性強等優(yōu)點[11]。但是該方法在樣品前處理過程中方法較為復雜，不適合大批量樣品的檢測。同時檢測過程中用到較多的有機溶劑，其對環(huán)境及操作者有一定的傷害可能性。鑒于膠體金試紙條方法具有操作簡單、不添加任何其他試劑、檢測時間短、結果可靠等優(yōu)點，十分適合牧場、奶站等地方奶樣的快速檢測，為AFM1檢測提供了新的方法。

4 結 論

通過對自制的AFM1快速檢測試紙條檢測性能、試劑穩(wěn)定性及樣本適應性等方面的研究，結果表明該試紙條檢測性能良好，可對牛奶中的AFM1檢測。本研究初步確定了試紙條滿足了牛奶測定的基本要求，同時可也為相關研究提供一定參考。