節(jié)肢動(dòng)物胞內(nèi)共生菌Wolbachia抗蟲媒病毒感染的分子機(jī)制概述

陳思琦

（江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院檢驗(yàn)教研室，江西上饒 334000）

蚊媒傳染病是危害人類健康的重要疾病之一，是全球面臨的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。作為主要的媒介生物，伊蚊和按蚊通過(guò)叮咬吸血，可傳播包括流行性乙型腦炎、登革熱和瘧疾在內(nèi)的多種疾病[2]。由于一直缺乏有效的特異性疫苗，過(guò)去針對(duì)蚊媒傳染病的防控多以化學(xué)殺蟲劑為主。近年來(lái)，殺蟲劑大量長(zhǎng)期的使用導(dǎo)致蚊蟲耐藥性增強(qiáng)，殘留的化學(xué)藥物還造成了生態(tài)環(huán)境的污染，生物防治蚊蟲手段開始受到人們關(guān)注。沃爾巴克氏體（Wolbachia）是一種廣泛分布于節(jié)肢動(dòng)物體內(nèi)的共生菌，已證實(shí)其可以一定程度上調(diào)控宿主的生長(zhǎng)與繁殖，還能通過(guò)激活多種免疫相關(guān)基因和天然免疫通路抑制或阻斷宿主對(duì)登革病毒（DENV）、寨卡病毒（ZIKV）、西尼羅病毒（WNV）、瘧原蟲等多種病原體的感染[3-5]。Wolbachia作為一種新型的區(qū)域性蚊媒傳染病防控方式，逐漸成為生物防治蚊媒傳染病的研究熱點(diǎn)。

1 Wolbachia激活經(jīng)典免疫途徑抗病毒感染

1.1 Wolbachia調(diào)控NF-κB（Toll和IMD）通路

存在于昆蟲內(nèi)的Toll和IMD天然免疫通路，是與哺乳動(dòng)物NF-κB信號(hào)通路非常相似的兩條通路。與哺乳動(dòng)物的類Toll受體不同，節(jié)肢動(dòng)物的Toll受體不是模式識(shí)別受體（PAMPs）介導(dǎo)，而是由細(xì)胞外可溶性模式識(shí)別受體介導(dǎo)的[6]。Toll通路最早在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，被證實(shí)能有效抵御革蘭陽(yáng)性菌、真菌和病毒侵襲，而IMD通路常在革蘭陰性菌感染時(shí)被激活，兩條通路均能介導(dǎo)抗微生物多肽（AMPs）的產(chǎn)生[7-8]。

對(duì)于不同的微生物，AMPs的殺滅模式通常是特定的。比如，防御素（Defensins，Def）通過(guò)破壞膜通透性屏障，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和寄生蟲產(chǎn)生高度毒性，導(dǎo)致其活性降低[9]；而帶正電荷的抗菌肽（Cecropins，Cec）通過(guò)與帶負(fù)電荷的膜脂質(zhì)結(jié)合，進(jìn)而改變膜的生物結(jié)構(gòu)，其起作用的模式可能包括抑制核酸和蛋白質(zhì)合成以及抑制酶活性[10]。

已有文章證實(shí)，wAlbB型Wolbachia感染埃及伊蚊后，會(huì)誘導(dǎo)NADPH氧化酶和活性氧簇（ROS）的升高，導(dǎo)致Toll通路組分如GNBPB1、Spaetzle 3（SPZ3）、髓樣分化原發(fā)反應(yīng)基因88（MYD88）和REL1A的激活，而IMD通路的標(biāo)記基因IMD、肽聚糖識(shí)別蛋白LB（PGP-LB）和LE（PGRP LEP）則下調(diào)[11]。

TOLL通路的激活介導(dǎo)了AMPs的抗氧化作用，同時(shí)產(chǎn)生Cec和Def[12]。其中，在WB1型埃及伊蚊的中腸中，Cec B和Def C的表達(dá)水平都上調(diào)了2.5倍以上。wAlbB型菌株抑制了登革病毒在蚊子中腸中的復(fù)制及其在蚊體胸腔和頭部中的傳播，顯著降低了蚊子傳播病毒的可能性[13]。

1.2 Wolbachia激活RNAi

在昆蟲體內(nèi)，RNAi途徑在抗病毒防御中起著關(guān)鍵作用，尤其是外源siRNA途徑[14]。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，dsRNA特異性RNA酶（Dicer2）通過(guò)識(shí)別并將病毒dsRNA切割為siRNA片段，siRNA與Dicer酶和Argonaute蛋白等多種生物大分子裝配成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），破壞并切割其互補(bǔ)的mRNA靶點(diǎn)，最終降解病毒的RNA[15]。果蠅體內(nèi)siRNA通路功能喪失或某些成分的突變，被證明會(huì)增加其對(duì)RNA病毒感染的易感性。

盡管基孔肯雅病毒、登革病毒等黃病毒為正鏈ssRNA病毒，但也可檢測(cè)到dsRNA作為復(fù)制中間產(chǎn)物產(chǎn)生[16]，從而激活RNAi途徑，參與昆蟲對(duì)蟲媒病毒的免疫應(yīng)答[17]。同時(shí)，有文章證實(shí)，除了RNA病毒，大腸桿菌等細(xì)菌體內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生dsRNA[18]，結(jié)合Wolbachia是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌的生物本質(zhì)，其是否也能產(chǎn)生dsRNA從而激活RNAi途徑增強(qiáng)抗病毒功能，是亟待研究的課題。

現(xiàn)階段的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在Wolbachia感染的埃及伊蚊體內(nèi)，RNAi途徑關(guān)鍵因子AGO2的水平明顯增高，與之相對(duì)應(yīng)的，通過(guò)siRNA技術(shù)敲低AGO2之后，其抗病毒能力有所下降[19]。但是，對(duì)于Wolbachia的天然宿主果蠅來(lái)說(shuō)，雖然攜帶Wolbachia使其對(duì)RNA病毒（如果蠅C病毒）的抵抗增強(qiáng)，其抗病毒過(guò)程并不依賴RNAi通路[20]。

1.3 Wolbachia調(diào)控ERK-MAPK途徑

絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinases，MAPKs）是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，在生物進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性，不論在低等原核細(xì)胞或高等哺乳類細(xì)胞內(nèi)，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等過(guò)程都具有至關(guān)重要的作用[20]。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）是MAPKs信號(hào)通路家族中的一個(gè)重要信號(hào)通路，其在病毒感染致病以及宿主防御過(guò)程中具有重要作用。果蠅體內(nèi)ROS水平的增加與其對(duì)病毒感染的耐受性和Wolbachia介導(dǎo)的抗病毒保護(hù)有關(guān)，Wolbachia感染后，果蠅體內(nèi)ROS表達(dá)明顯高于野生組，同時(shí)導(dǎo)致ERK通路的磷酸化水平也增加了2倍以上。通過(guò)構(gòu)建ERK通路功能喪失的果蠅突變體，研究者發(fā)現(xiàn)，在果蠅細(xì)胞和成蟲的腸道上皮細(xì)胞抵抗果蠅C病毒（Drosophila C Virus，DCV）復(fù)制和侵襲的過(guò)程中，ERK-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮了重要作用[21]，同時(shí)，當(dāng)ERK通路激活受損，也在一定程度上影響了其他上皮抗病毒免疫通路（如IMD通路）的激活。

2 Wolbachia抗蟲媒病毒感染的其他機(jī)制

2.1 Wolbachia抑制胰島素受體（InR）

胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑在調(diào)節(jié)真核生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、變態(tài)、雌性生殖能力和壽命方面都發(fā)揮著重要作用，并且該途徑從酵母到哺乳動(dòng)物都是保守的[22]。最早發(fā)現(xiàn)并克隆的類胰島素樣多肽（ILP）來(lái)自家蠶的Bombyxmori基因，目前已陸續(xù)鑒定出了32個(gè)家蠶素（Bombyxin）家族基因，共可分為7個(gè)亞家族（A-G subfamiliy）[23]。通過(guò)同源進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，果蠅體內(nèi)有7種胰島素樣肽（DILPs），類似于人類胰島素多肽[24]。同時(shí)，在埃及伊蚊、岡比亞按蚊體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了多種類胰島素樣多肽，這些多肽與蚊子的吸血、發(fā)育、繁殖等行為關(guān)系緊密[25-26]。但每種昆蟲體內(nèi)證實(shí)的胰島素受體（InR）只有一種，ILPs中是否只有幾種或都與InR結(jié)合還未闡明清楚[27]。由于Wolbachia對(duì)蚊體的生長(zhǎng)生殖都有顯著的影響，其是否能通過(guò)影響胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)通路，增強(qiáng)其抗病毒功能，是研究者很感興趣的問(wèn)題。

Kinexus抗體微陣列結(jié)果顯示，在Wolbachia感染后，蚊體內(nèi)117種細(xì)胞因子的表達(dá)或磷酸化水平產(chǎn)生了顯著差異，其中28種磷酸化特異性識(shí)別位點(diǎn)信號(hào)上調(diào)、64種下調(diào)，Wolbachia陽(yáng)性的細(xì)胞中InR豐度和磷酸化水平都有明顯降低。同時(shí)，有文章已經(jīng)證實(shí)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中登革病毒的復(fù)制需要InR的幫助[28]，InR基因的敲減能明顯降低哺乳動(dòng)物中DENV的復(fù)制?；谇捌诶碚摶A(chǔ)，研究人員利用siRNA基因敲減技術(shù)和藥物阻斷方法對(duì)InR在ZIKV和DENV復(fù)制中的作用進(jìn)行了表型驗(yàn)證，證實(shí)通過(guò)Wolbachia介導(dǎo)的胰島素受體激酶活性下調(diào)是埃及伊蚊阻斷蟲媒病毒感染的機(jī)制之一[29]。

2.2 Wolbachia調(diào)控非編碼RNA（Non-coding RNA）

非編碼RNA廣義上指的是不編碼蛋白質(zhì)的RNA，而昆蟲體內(nèi)比較常見的是長(zhǎng)度小于50 nt的非編碼小RNA主要有3種：siRNA、miRNA和piRNA[30]。以miRNA為例，闡述Wolbachia調(diào)控的相關(guān)研究進(jìn)展。

miRNA靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)可以通過(guò)生物信息學(xué)的方法進(jìn)行，并且常常會(huì)產(chǎn)生數(shù)百個(gè)潛在的靶基因，使得功能性特征復(fù)雜化。另外，一個(gè)miRNA可以靶向多個(gè)基因，一個(gè)基因可以被多個(gè)miRNA調(diào)控，增加了研究的難度。在蚊子體內(nèi)，miRNA被證明可以調(diào)節(jié)發(fā)育、消化和繁殖等多種生理過(guò)程。迄今，也有不少研究證實(shí)在病毒感染昆蟲的反應(yīng)中，miRNA起到了轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用[31-32]。

在新近感染W(wǎng)olbachia的埃及伊蚊體內(nèi)，研究者通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)一種名為aae-miR-2940的miRNA只在感染沃爾菌的蚊子中大量表達(dá)，同時(shí)下調(diào)一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（AaDnmt2）的表達(dá)。AaDnmt2屬于胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶家族2，是昆蟲中保存最古老、分布最廣的基因，也是雙翅目生物中發(fā)現(xiàn)的唯一一種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶[33]。胞嘧啶甲基化有非常重要的生物學(xué)功能，包括宿主防御、基因組穩(wěn)定性、促進(jìn)器官發(fā)育和壽命調(diào)控等[34]。更值得關(guān)注的是，在蚊子體內(nèi)引入Wolbachia，會(huì)抑制AaDnmt2的表達(dá)，而登革病毒則誘導(dǎo)AaDnmt2的表達(dá)升高。相反，在蚊細(xì)胞中過(guò)表達(dá)AaDnmt2能顯著促進(jìn)登革病毒的復(fù)制，表明aae-miR-2940與Wolbachia阻斷蚊子體內(nèi)登革病毒復(fù)制之間存在因果關(guān)系。

而作為Wolbachia的自然宿主，果蠅在抵御DCV的過(guò)程中雖然產(chǎn)生了大量的miRNA，但其中17種黑色素菌相關(guān)的miRNA豐度均不受Wolbachia感染的影響，也不受Wolbachia和DCV雙重感染的影響。同時(shí)，單獨(dú)感染W(wǎng)olbachia與Semliki森林病毒（SFV）共感染的果蠅細(xì)胞miRNA表達(dá)譜也沒(méi)有差異，表明miRNA不參與果蠅體內(nèi)Wolbachia抗病毒的機(jī)制。

3 討論和展望

昆蟲在遭遇病原體的侵襲過(guò)程中，體內(nèi)存在的天然免疫系統(tǒng)發(fā)揮了重要的防御和抵抗作用。通過(guò)誘導(dǎo)一系列免疫信號(hào)級(jí)聯(lián)通路磷酸化，如Toll、IMD、JAK/Stat通路等，激活抗菌肽或其他免疫因子的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮抗病原體侵襲效應(yīng)。

作為一種蚊蟲體內(nèi)寄生最廣泛的胞內(nèi)共生菌，Wolbachia具有強(qiáng)大的抗病毒效應(yīng)，基于其生物特性開展的一系列地區(qū)性生物防治蚊媒傳染病實(shí)驗(yàn)也得到了令人滿意的效果，但其具體的抗病毒機(jī)制還有待進(jìn)一步研究和明確。

現(xiàn)階段的研究表明，在Wolbachia新近感染蚊蟲后，其體內(nèi)的免疫激活狀態(tài)會(huì)發(fā)生顯著改變，對(duì)許多經(jīng)典抗病毒通路都有一定的激活，也產(chǎn)生了一系列抗菌肽或防御素來(lái)對(duì)抗病毒，但相比未感染的蚊蟲，這些通路發(fā)揮的抗病毒功能并不顯著，可能并不是Wolbachia抗病毒過(guò)程中所必需的。

盡管Wolbachia介導(dǎo)的病原體阻斷機(jī)制還未闡明，但已有多項(xiàng)研究表明其與宿主的免疫反應(yīng)有關(guān)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的分析，人們對(duì)Wolbachia在昆蟲病原體防御中發(fā)揮的作用有了更深的了解。在病毒-Wolbachia-宿主三者之間一定有特別的關(guān)聯(lián)，是調(diào)節(jié)Wolbachia感染宿主與宿主抗病毒效應(yīng)之間的機(jī)制的核心。而今后的研究重點(diǎn)不應(yīng)該局限于蚊蟲體內(nèi)原有的經(jīng)典天然免疫通路，更多地將目光放在Wolbahcia自身基因組與代謝組學(xué)上，探究其在感染蚊蟲以及遭遇病毒侵襲后，生物特性和分泌能力發(fā)生的變化，或許會(huì)帶來(lái)新的觀點(diǎn)和發(fā)現(xiàn)。