豬肺炎支原體二乙烯亞胺滅活條件的研究

張智明，張鳳強(qiáng)，柴 華，劉洪斌

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

豬支原體肺炎（Mycoplasma hyopneumoniaeof Swine，MPS）是由豬肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，Mhp）感染引起的一種慢性肺炎，又稱豬喘氣病、豬地方流行性肺炎，臨床表現(xiàn)為咳嗽、氣喘、腹式呼吸及生長(zhǎng)速度緩慢，并會(huì)導(dǎo)致感染豬出欄時(shí)間延長(zhǎng)、豬只出欄體重不達(dá)標(biāo)等。豬肺炎支原體在單純感染時(shí)，死亡率較低，但豬肺炎支原體能夠侵害豬的免疫系統(tǒng)，引起免疫抑制和繼發(fā)感染，使死亡率大大增加，常給豬養(yǎng)殖企業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。有研究表明，MPS 的總體感染率可達(dá)到40%～50%，在屠宰場(chǎng)出現(xiàn)該病典型病變的豬可達(dá)到30%～80%[1]。在我國(guó)，20 世紀(jì)50—60 年代曾暴發(fā)過(guò)豬支原體肺炎的大規(guī)模流行，由此造成了豬只生產(chǎn)性能的降低，并由于額外治療費(fèi)用的支出增加了養(yǎng)殖戶的養(yǎng)殖成本[2-3]。接種疫苗是防控豬支原體肺炎的主要手段。在我國(guó)，研制和使用的國(guó)產(chǎn)疫苗主要是活疫苗，但接種方法比較煩瑣，而關(guān)于滅活疫苗的研究較少。本研究主要探討了新型的滅活劑二乙烯亞胺（BEI）對(duì)豬肺炎支原體C 株的滅活條件，從而為制備豬肺炎支原體滅活疫苗提供參考。

1 材 料

1.1 菌株

豬肺炎支原體C株，活菌含量109.34CCU·mL-1，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司分離并保管。

1.2 主要試劑

PPLO肉湯培養(yǎng)基（測(cè)定活菌含量時(shí)加入終濃度為1%的酚紅），由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司GMP 車間制備、檢驗(yàn)和提供；豬血清，Gibco 公司產(chǎn)品；酵母提取物，OXOID公司產(chǎn)品；葡萄糖（分析純），國(guó)藥集團(tuán)公司產(chǎn)品；半胱氨酸氫氯化物、2-溴乙胺氫溴酸鹽（BEA），美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方 法

2.1 豬肺炎支原體抗原的制備

將豬肺炎支原體C 株按照5%的接種量接種于2 000 mL 的錐形瓶中，在37 ℃、40 r·min-1的條件下培養(yǎng)60 h 左右，當(dāng)OD650nm值達(dá)到0.07 時(shí)停止培養(yǎng)，收獲抗原液，于2～8 ℃保存，備用。

2.2 活菌含量測(cè)定

取豬肺炎支原體菌液混勻后，吸取0.2 mL 加入到含有1.8 mL PPLO 肉湯培養(yǎng)基的DB 小管內(nèi)，充分混勻后稀釋為10-1。按照上述方法依次進(jìn)行10-2～10-10稀釋，其中10-1～10-44個(gè)稀釋度作1 個(gè)重復(fù)，10-5～10-10作6 個(gè)重復(fù)。將各個(gè)稀釋度置37 ℃、90 r·min-1條件下培養(yǎng)15 d，每天觀察各稀釋度的變色情況，第16天判定結(jié)果。

2.3 BEI滅活豬肺炎支原體

將2 mol·L-1的BEA和2 mol·L-1的NaOH溶液等體積混合，置37 ℃水浴，每隔10～15 min 搖勻1 次，1 h 后即環(huán)化產(chǎn)生BEI，終濃度為1 mol·L-1，將BEI均勻地加入到上述收獲的菌液中，至終濃度分別為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mmol·L-1，37 ℃滅活，分別于滅活后8、12、16、20、24 h取樣。在取樣的同時(shí)加入終濃度與相應(yīng)BEI 濃度相等的硫代硫酸鈉溶液，混合均勻，并在37 ℃條件下攪拌24 h，然后迅速降溫至2～8 ℃，備用。

2.4 抗原液中BEI被中和后殘留的驗(yàn)證

對(duì)硫代硫酸鈉終止滅活后的抗原液取樣，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，加入1/10 體積的5%AgNO3（w/v）溶液，觀察沉淀顏色。

2.5 豬肺炎支原體的滅活檢驗(yàn)

將滅活的菌液用PPLO 肉湯培養(yǎng)基分別進(jìn)行5倍、10倍、20倍的稀釋，并設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照，在37 ℃下、80 r·min-1搖床培養(yǎng)16～17 d，觀察有無(wú)顏色變化。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)明顯顏色變化；陰性對(duì)照液體培養(yǎng)基應(yīng)無(wú)顏色變化；滅活菌液無(wú)顏色變化判為滅活完全。

3 結(jié)果與分析

3.1 抗原液中BEI被中和后的殘留情況

抗原液離心后的上清液加入5% AgNO3溶液后，有黑色沉淀產(chǎn)生，說(shuō)明硫代硫酸鈉過(guò)量，從而說(shuō)明BEI已被完全中和。

3.2 滅活情況檢驗(yàn)

滅活試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 37 ℃水浴條件下不同濃度BEI滅活結(jié)果

由表1試驗(yàn)結(jié)果可知，1.0 mmol·L-1的BEI作用24 h不能完全滅活豬肺炎支原體C株，2.0 mmol·L-1的BEI 作用24 h 可完全滅活支原體，4.0 mmol·L-1濃度的BEI 作用20 h 即可完全滅活支原體，6.0 mmol·L-1濃度的BEI 作用16 h 即可完全滅活支原體，8.0 mmol·L-1濃度的BEI作用8 h即可完全滅活支原體。綜合BEI的用量和滅活時(shí)間考慮，選擇BEI 濃度為4.0 mmol·L-1、37 ℃水浴滅活，時(shí)間為24 h作為該疫苗的最佳滅活條件。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)豬肺炎支原體C 株菌液滅活工藝中BEI的終濃度和滅活時(shí)間進(jìn)行比較，確定用終濃度4.0 mmol·L-1的BEI 在37 ℃滅活24 h 作為豬肺炎支原體C株的滅活條件。滅活后使用等量的硫代硫酸鈉中和殘留BEI，可確保疫苗滅活徹底且無(wú)殘留。