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    豬肺炎支原體二乙烯亞胺滅活條件的研究

    2021-01-19 09:02:18張智明張鳳強(qiáng)劉洪斌
    飼料博覽 2020年12期
    關(guān)鍵詞:硫代硫酸鈉菌液支原體

    張智明,張鳳強(qiáng),柴 華,劉洪斌

    (哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司,哈爾濱 150069)

    豬支原體肺炎(Mycoplasma hyopneumoniaeof Swine,MPS)是由豬肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae,Mhp)感染引起的一種慢性肺炎,又稱豬喘氣病、豬地方流行性肺炎,臨床表現(xiàn)為咳嗽、氣喘、腹式呼吸及生長(zhǎng)速度緩慢,并會(huì)導(dǎo)致感染豬出欄時(shí)間延長(zhǎng)、豬只出欄體重不達(dá)標(biāo)等。豬肺炎支原體在單純感染時(shí),死亡率較低,但豬肺炎支原體能夠侵害豬的免疫系統(tǒng),引起免疫抑制和繼發(fā)感染,使死亡率大大增加,常給豬養(yǎng)殖企業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。有研究表明,MPS 的總體感染率可達(dá)到40%~50%,在屠宰場(chǎng)出現(xiàn)該病典型病變的豬可達(dá)到30%~80%[1]。在我國(guó),20 世紀(jì)50—60 年代曾暴發(fā)過(guò)豬支原體肺炎的大規(guī)模流行,由此造成了豬只生產(chǎn)性能的降低,并由于額外治療費(fèi)用的支出增加了養(yǎng)殖戶的養(yǎng)殖成本[2-3]。接種疫苗是防控豬支原體肺炎的主要手段。在我國(guó),研制和使用的國(guó)產(chǎn)疫苗主要是活疫苗,但接種方法比較煩瑣,而關(guān)于滅活疫苗的研究較少。本研究主要探討了新型的滅活劑二乙烯亞胺(BEI)對(duì)豬肺炎支原體C 株的滅活條件,從而為制備豬肺炎支原體滅活疫苗提供參考。

    1 材 料

    1.1 菌株

    豬肺炎支原體C株,活菌含量109.34CCU·mL-1,由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司分離并保管。

    1.2 主要試劑

    PPLO肉湯培養(yǎng)基(測(cè)定活菌含量時(shí)加入終濃度為1%的酚紅),由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司GMP 車間制備、檢驗(yàn)和提供;豬血清,Gibco 公司產(chǎn)品;酵母提取物,OXOID公司產(chǎn)品;葡萄糖(分析純),國(guó)藥集團(tuán)公司產(chǎn)品;半胱氨酸氫氯化物、2-溴乙胺氫溴酸鹽(BEA),美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    2 方 法

    2.1 豬肺炎支原體抗原的制備

    將豬肺炎支原體C 株按照5%的接種量接種于2 000 mL 的錐形瓶中,在37 ℃、40 r·min-1的條件下培養(yǎng)60 h 左右,當(dāng)OD650nm值達(dá)到0.07 時(shí)停止培養(yǎng),收獲抗原液,于2~8 ℃保存,備用。

    2.2 活菌含量測(cè)定

    取豬肺炎支原體菌液混勻后,吸取0.2 mL 加入到含有1.8 mL PPLO 肉湯培養(yǎng)基的DB 小管內(nèi),充分混勻后稀釋為10-1。按照上述方法依次進(jìn)行10-2~10-10稀釋,其中10-1~10-44個(gè)稀釋度作1 個(gè)重復(fù),10-5~10-10作6 個(gè)重復(fù)。將各個(gè)稀釋度置37 ℃、90 r·min-1條件下培養(yǎng)15 d,每天觀察各稀釋度的變色情況,第16天判定結(jié)果。

    2.3 BEI滅活豬肺炎支原體

    將2 mol·L-1的BEA和2 mol·L-1的NaOH溶液等體積混合,置37 ℃水浴,每隔10~15 min 搖勻1 次,1 h 后即環(huán)化產(chǎn)生BEI,終濃度為1 mol·L-1,將BEI均勻地加入到上述收獲的菌液中,至終濃度分別為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mmol·L-1,37 ℃滅活,分別于滅活后8、12、16、20、24 h取樣。在取樣的同時(shí)加入終濃度與相應(yīng)BEI 濃度相等的硫代硫酸鈉溶液,混合均勻,并在37 ℃條件下攪拌24 h,然后迅速降溫至2~8 ℃,備用。

    2.4 抗原液中BEI被中和后殘留的驗(yàn)證

    對(duì)硫代硫酸鈉終止滅活后的抗原液取樣,4 000 r·min-1離心10 min,取上清液,加入1/10 體積的5%AgNO3(w/v)溶液,觀察沉淀顏色。

    2.5 豬肺炎支原體的滅活檢驗(yàn)

    將滅活的菌液用PPLO 肉湯培養(yǎng)基分別進(jìn)行5倍、10倍、20倍的稀釋,并設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照,在37 ℃下、80 r·min-1搖床培養(yǎng)16~17 d,觀察有無(wú)顏色變化。陽(yáng)性對(duì)照應(yīng)出現(xiàn)明顯顏色變化;陰性對(duì)照液體培養(yǎng)基應(yīng)無(wú)顏色變化;滅活菌液無(wú)顏色變化判為滅活完全。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 抗原液中BEI被中和后的殘留情況

    抗原液離心后的上清液加入5% AgNO3溶液后,有黑色沉淀產(chǎn)生,說(shuō)明硫代硫酸鈉過(guò)量,從而說(shuō)明BEI已被完全中和。

    3.2 滅活情況檢驗(yàn)

    滅活試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

    表1 37 ℃水浴條件下不同濃度BEI滅活結(jié)果

    由表1試驗(yàn)結(jié)果可知,1.0 mmol·L-1的BEI作用24 h不能完全滅活豬肺炎支原體C株,2.0 mmol·L-1的BEI 作用24 h 可完全滅活支原體,4.0 mmol·L-1濃度的BEI 作用20 h 即可完全滅活支原體,6.0 mmol·L-1濃度的BEI 作用16 h 即可完全滅活支原體,8.0 mmol·L-1濃度的BEI作用8 h即可完全滅活支原體。綜合BEI的用量和滅活時(shí)間考慮,選擇BEI 濃度為4.0 mmol·L-1、37 ℃水浴滅活,時(shí)間為24 h作為該疫苗的最佳滅活條件。

    4 結(jié) 論

    通過(guò)對(duì)豬肺炎支原體C 株菌液滅活工藝中BEI的終濃度和滅活時(shí)間進(jìn)行比較,確定用終濃度4.0 mmol·L-1的BEI 在37 ℃滅活24 h 作為豬肺炎支原體C株的滅活條件。滅活后使用等量的硫代硫酸鈉中和殘留BEI,可確保疫苗滅活徹底且無(wú)殘留。

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