慢性阻塞性肺疾病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)23價(jià)肺炎鏈球菌莢膜多糖疫苗的反應(yīng)

王振國(guó) 黃譯瑩 涂常力 鄭曉濱

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 珠海 519000)

多年來(lái)，對(duì)肺炎球菌感染的控制主要著眼于早期診斷及抗生素治療，這在一定程度上改善了疾病的預(yù)后，但未能減輕疾病造成的整體經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，并使得細(xì)菌耐藥性增高〔1〕。近20年來(lái)，醫(yī)學(xué)界認(rèn)識(shí)到該病的控制需要一種能對(duì)公共衛(wèi)生產(chǎn)生廣泛影響的預(yù)防策略，并為達(dá)到這個(gè)目標(biāo)而多方努力地尋找一種有效的抗肺炎鏈球菌疫苗〔2〕。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是成年人最常見(jiàn)的慢性疾病之一，與肺部對(duì)有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，致殘率和病死率很高，將成為全球第3次致死病因，并且隨著社會(huì)的老齡化及環(huán)境污染的加劇，COPD的患病率還將持續(xù)上升〔3～5〕。目前使用的 23 價(jià)肺炎球菌莢膜多糖疫苗(PPV23)是1983年批準(zhǔn)上市的，建議用于高危成人及老年人。PPV23在高齡老年人及COPD病人中的臨床有效性仍有爭(zhēng)議，盡管大多數(shù)的病例對(duì)照及非直接隊(duì)列研究均提示對(duì)侵襲性肺炎球菌病有一定的效果，前瞻性的臨床試驗(yàn)及其 meta 分析均未能證明 PPV23在普通老年人及 COPD 病人中對(duì)肺炎球菌肺炎有顯著的保護(hù)作用〔6～10〕。而循證醫(yī)學(xué)協(xié)作組報(bào)告，雖 PPV23未能減少老年病人的肺炎發(fā)病率及相關(guān)性死亡，從觀察性研究獲得的證據(jù)表明 PPV23預(yù)防成人及非免疫缺陷老年人(≥65 歲)侵襲性肺炎球菌疾病(IPD)的有效性達(dá) 53%〔11〕。因此，Ochoa-Gondar 等〔9〕認(rèn)為，接種PPV23在老年慢性肺病患者應(yīng)答較差，有效性較低，但鑒于老年慢性肺病患者侵襲性肺炎球菌感染的后果及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，又缺乏更有效的疫苗，仍建議在這個(gè)人群中使用。由于 COPD 病人對(duì)PPV23免疫應(yīng)答的現(xiàn)有研究結(jié)果不一致，本研究通過(guò)觀察不同人群外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)對(duì)肺炎鏈球菌莢膜多糖反應(yīng)，從而評(píng)估不同人群對(duì)PPV23主動(dòng)免疫應(yīng)答的真實(shí)情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 以65歲為界分為老年及成人兩個(gè)亞組。成人COPD組15例，來(lái)自中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診COPD穩(wěn)定期患者，男9例，女6例，年齡35～52歲，平均(44.5±10.7)歲，符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病協(xié)會(huì)制定的COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)；老年COPD組15例，來(lái)自中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診COPD穩(wěn)定期患者，男10例，女5例，年齡66～82歲，平均(72.3±6.2)歲，符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病協(xié)會(huì)制定的COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)；健康成人組15例，男8例，女7例，年齡23～48歲，平均(28.4±8.6)歲，為中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院體檢為健康者。健康老年組15例，男8例，女7例，年齡66～78歲，平均(68.8±5.6)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他肺部疾病，嚴(yán)重的心功能不全，慢性肝、腎疾病，惡性腫瘤，自身免疫性疾病，先天性或獲得性免疫缺陷，接受系統(tǒng)性免疫調(diào)節(jié)或免疫抑制治療(包括口服糖皮質(zhì)激素)。無(wú)脾或脾切除術(shù)后。曾經(jīng)注射過(guò)肺炎鏈球菌疫苗。近1個(gè)月內(nèi)有感染性疾病病史。

1.2主要試劑及儀器 PPV23(紐莫法)(美國(guó)默沙東公司)；小牛血清(杭州四季清公司)；RPMI-1640(Gibco公司)；4-(2-羥乙基)-1哌嗪乙磺酸(HEPES)(MD公司)；淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司)；電熱恒溫干燥箱(寧波市鄞州邱隘佳諾自動(dòng)化儀表廠)；環(huán)氧乙烷滅菌鍋(泉暉貿(mào)易國(guó)際有限公司)；XK97-2型雙向恒溫?cái)嚢杵?姜堰市新康醫(yī)療器械公司)；24孔培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)；HERA Cell CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1PBMC的分離 ①所有受試者取外周靜脈血10 ml，生理鹽水10 ml稀釋。②標(biāo)記各離心管，向10 ml離心管中加入3 ml 淋巴細(xì)胞分離液，加入稀釋后的靜脈血。1 700 r/min離心20 min以分離細(xì)胞。③吸出PBMC及部分血清，置另一潔凈離心管中。向離心管中加入6 ml NS液，混勻。1 000 r/min離心10 min 洗滌1次。倒置離心管，甩干上清，加入完全培養(yǎng)基1 ml吹打管底細(xì)胞混勻。

1.3.2PBMC的干預(yù)培養(yǎng) ①PBMC加入24孔板。設(shè)干預(yù)組及對(duì)照組，各培養(yǎng)組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔細(xì)胞懸液PBMC數(shù)為1.5×106個(gè)，體積為800 μl。②在含5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取上清液測(cè)抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性免疫球蛋白(Ig)G、IgM抗體。并于抗原刺激孔添加稀釋疫苗溶液200 μl(PPV23終濃度為0.115 μg/ml)，對(duì)照孔添加生理鹽水200 μl，總體積均為1 ml，吹打混勻細(xì)胞懸液。在含5%CO237℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再取上清液測(cè)抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性IgG、IgM抗體。

1.3.3間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)步驟〔12,13〕①包被：將11.5 μg/ml PPV23包被于聚苯乙烯ELISA板中，2孔加入不含疫苗的抗原稀釋液作為背景孔(無(wú)抗原孔)，加蓋封板膜，4℃冰箱過(guò)夜。②加實(shí)驗(yàn)室參考血清和待測(cè)樣本：加入PBMC培養(yǎng)上清液及倍比稀釋的實(shí)驗(yàn)室參考血清(8個(gè)濃度)，每孔50 μl，均設(shè)復(fù)孔,留2孔加入抗體稀釋液(無(wú)血清孔)。于溫育箱中37℃溫育60 min。③加酶標(biāo)工作液：加入稀釋至工作濃度辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記羊抗人IgG或IgM或IgA，每孔100 μl，留2孔加入抗體稀釋液(無(wú)二抗孔)。于37℃溫育箱中溫育60 min。④洗板：每次加洗滌液充分洗滌5次并充分拍板。⑤顯色：每孔先加入顯色劑 A 液(TMB) 50 μl，再加入顯色劑 B 液(H2O2)50 μl，溫育箱中溫育30 min。⑥終止：取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)(顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。⑦酶標(biāo)儀讀值：終止反應(yīng)后15 min在450和630 nm處的酶標(biāo)儀雙波長(zhǎng)上讀出反應(yīng)孔的吸光度值。⑧計(jì)算：測(cè)定OD值=復(fù)孔算術(shù)平均值-最高空白對(duì)照值，最高空白對(duì)照值應(yīng)控制在0.01以下。根據(jù)倍比稀釋的實(shí)驗(yàn)室參考血清的濃度及對(duì)應(yīng)的 OD 值，使用CURVEEXPERT軟件來(lái)計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，再根據(jù)樣本的 OD 值(取復(fù)孔平均值)，在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品血清濃度與實(shí)驗(yàn)室參考血清抗體濃度的比值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。

2 結(jié) 果

2.1PBMC體外培養(yǎng)上清液抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體濃度(相對(duì)參考血清的抗體濃度比值×10-3) 4組PMBC在體外培養(yǎng)24 h后，疫苗干預(yù)前各組間抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體IgG、IgM的產(chǎn)生無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 疫苗刺激前各組抗體濃度的比較

2.2PPV23干預(yù)培養(yǎng)48 h后各組抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體濃度的比較(相對(duì)參考血清的抗體濃度比值×10-3) 加PPV23培養(yǎng)48 h后，對(duì)比疫苗刺激前，對(duì)照組及干預(yù)組各組的抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體均較前有下降。與對(duì)照組相比，疫苗刺激后4個(gè)干預(yù)組的抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體濃度均明顯升高(P<0.05)。但是疫苗刺激后各分組間抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體IgG、IgM的產(chǎn)生無(wú)明顯差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 疫苗刺激后各組抗體濃度的比較

3 討 論

肺炎鏈球菌感染是一個(gè)世界性問(wèn)題，大于65 歲的老年人是罹病風(fēng)險(xiǎn)最高的人群之一，尤其是當(dāng)患者合并有高危因素時(shí)。COPD 也是肺炎鏈球菌感染的常見(jiàn)高危因素。肺炎球菌莢膜多糖疫苗被建議用在老年人及COPD 病人，但其有效性一直存在爭(zhēng)議。有關(guān)老年人及COPD 病人對(duì)疫苗應(yīng)答差的原因，可能與免疫老化有關(guān)，并可能與機(jī)體老化過(guò)程中出現(xiàn)的免疫系統(tǒng)改變有關(guān)。臨床上對(duì)COPD患者的常規(guī)治療主要包括抗感染及解痙平喘氧療等對(duì)癥處理，隨著肺炎鏈球菌耐藥率的不斷提高，COPD患者抗感染治療的效果也不盡理想。為了減少COPD的急性發(fā)作，推薦對(duì)COPD患者進(jìn)行常規(guī)PPV23接種〔14〕。國(guó)外報(bào)道指出，接種PPV23 COPD患者的死亡率、并發(fā)癥、住院天數(shù)、發(fā)生呼吸衰竭的危險(xiǎn)較低均較未接種者有下降〔15〕。

COPD患者多在40 歲以后出現(xiàn)癥狀。COPD 病人的主要呼吸生理改變也見(jiàn)于老年人，如小氣道阻塞、肺彈性下降及動(dòng)態(tài)過(guò)度膨脹，且COPD 的發(fā)病率隨年紀(jì)而增加，提示機(jī)體老化可能是COPD 促進(jìn)因素，或COPD 是機(jī)體加速老化的表現(xiàn)，與機(jī)體老化相關(guān)的免疫系統(tǒng)重塑在慢性炎癥性疾病的發(fā)病中起重要的作用。有學(xué)者認(rèn)為COPD 不過(guò)是外界毒性刺激物觸發(fā)的加速的機(jī)體老化的一種表型〔16,17〕。有研究表明。隨著年齡增長(zhǎng)，老年人免疫反應(yīng)有所下降。對(duì)比健康成年人，老年人對(duì)疫苗的免疫反應(yīng)有一定程度的降低〔18〕。

抗體的產(chǎn)生需要許多的信號(hào)和最適的認(rèn)知的相互作用，例如抗原提呈細(xì)胞、T細(xì)胞和B 細(xì)胞的受體參與。從外周血分離的PBMC是包含了這些細(xì)胞的。本研究結(jié)果顯示，PPV23干預(yù)培養(yǎng)48 h后各組抗肺炎鏈球菌莢膜多糖特異性抗體濃度均較前有下降，考慮是隨著體外培養(yǎng)的時(shí)間增加抗體代謝消耗所致。而經(jīng)過(guò)PPV23刺激后，結(jié)果表明，人的PBMC仍有活力，可以繼續(xù)分泌抗體。

血清的抗體水平并不能準(zhǔn)確地代表最近免疫應(yīng)答，由于以前對(duì)抗原的暴露，可產(chǎn)生可溶的抗體，血清的抗體水平包括這些累積的可溶的抗體。我們的方法取PBMC,檢測(cè)其上清液分泌的抗體，更好地代表了宿主對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答。