組學(xué)技術(shù)在針灸研究領(lǐng)域中的應(yīng)用現(xiàn)狀

白樺 孫珂 徐森磊 吳嘉宏 顧一煌

(南京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院養(yǎng)生康復(fù)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

針灸療法是中醫(yī)治病的主要方法之一，其利用針刺和艾灸等刺激人體體表穴位，并通過經(jīng)絡(luò)傳導(dǎo)，以達(dá)到調(diào)和臟腑、扶正祛邪、治病保健的目的。由于針灸療法具有適應(yīng)證廣、療效顯著、應(yīng)用方便等優(yōu)點(diǎn)，普遍為大眾所接受，且逐漸成為許多國家的補(bǔ)充和替代療法〔1〕。隨著針灸臨床的國際化和現(xiàn)代化發(fā)展，用現(xiàn)代技術(shù)手段來闡明和完善針灸傳統(tǒng)理論已成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。系統(tǒng)生物學(xué)是21世紀(jì)一門新興的學(xué)科，被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究中，組學(xué)技術(shù)作為系統(tǒng)生物學(xué)中的一部分，從人體是一個(gè)有機(jī)的統(tǒng)一體的角度出發(fā)，把基因、mRNA、蛋白質(zhì)、代謝小分子等這些構(gòu)成生物體的不同組分整合在一起進(jìn)行研究，以揭示在某種或某些因素?cái)_動(dòng)下系統(tǒng)內(nèi)部各組分的相互作用和動(dòng)態(tài)變化，這與針灸療法的整體調(diào)節(jié)作用不謀而合〔2〕，因此將組學(xué)技術(shù)引入針灸研究，可以全面系統(tǒng)地揭示針灸治療時(shí)所產(chǎn)生的整體效應(yīng)，促進(jìn)針灸學(xué)的現(xiàn)代化進(jìn)程。本文就當(dāng)下針灸研究領(lǐng)域中組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行概述，以期為針灸組學(xué)研究提供參考。

1 組學(xué)技術(shù)概述

隨著高通量測序技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，單組學(xué)技術(shù)日漸完善和成熟，不同組學(xué)如基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等可從不同層面揭示生物體的動(dòng)態(tài)變化過程。

1.1基因組學(xué) 基因組學(xué)技術(shù)是研究生物體內(nèi)全部基因的一項(xiàng)技術(shù)〔3〕，其可利用基因組信息指導(dǎo)醫(yī)療決策，并為每個(gè)病人量身定制治療策略。隨著2006年5月人類基因組計(jì)劃的完成，對每個(gè)人進(jìn)行基因檢測正迅速成為現(xiàn)實(shí)。研究人員認(rèn)為，基因組學(xué)有潛力徹底改革針灸醫(yī)學(xué)的實(shí)踐，即在遺傳信息指導(dǎo)下，針灸可優(yōu)化其治療效果，為臨床提供有效的治療手段。

1.2蛋白組學(xué) 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是基于現(xiàn)代質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對蛋白質(zhì)/肽段進(jìn)行鑒定和定量分析，可反映機(jī)體內(nèi)全部蛋白質(zhì)的信息，已被廣泛用于從動(dòng)態(tài)角度研究蛋白質(zhì)在分子水平上的表達(dá)〔4〕。在針灸研究方面，利用蛋白組學(xué)研究針灸治療帕金森病、急性脊髓損傷、缺血性腦血管病、神經(jīng)痛等疾病的機(jī)制，已經(jīng)取得一定的成果。蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展為針灸與現(xiàn)代技術(shù)和系統(tǒng)生物學(xué)的融合提供了一系列新的工具，有望推動(dòng)針灸的現(xiàn)代化和國際化進(jìn)程。

1.3代謝組學(xué) 代謝組學(xué)又稱為代謝輪廓分析，可系統(tǒng)反映生物體內(nèi)代謝物的構(gòu)成及變化。由于代謝物是生物調(diào)節(jié)過程中的最終產(chǎn)物，因此，與其他組學(xué)相比，代謝組學(xué)可直觀反映機(jī)體表型及其變化〔5〕，有助于生物體代謝特征的識別，可為發(fā)現(xiàn)與健康和疾病狀態(tài)相關(guān)的生物標(biāo)志物提供理想的技術(shù)平臺(tái)。尤其是隨著磁共振技術(shù)(NMR)，超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)等代謝組學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展和成熟，代謝組學(xué)在藥物開發(fā)、分子醫(yī)學(xué)和其他生物技術(shù)領(lǐng)域中變得越來越流行。代謝組學(xué)和針灸學(xué)均具有整體性、全面性和動(dòng)態(tài)變化的特征，可為針灸機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)。

2 組學(xué)技術(shù)在針灸研究中的應(yīng)用進(jìn)展

雖然針灸療法逐漸成為許多國家的補(bǔ)充和替代療法〔1〕，但是不少海外學(xué)者對針灸保持著中立甚至是懷疑的態(tài)度，并堅(jiān)持用現(xiàn)代方法驗(yàn)證其科學(xué)性。目前，雖然已有研究報(bào)告證實(shí)針灸對包括疼痛在內(nèi)的許多疾病療效顯著，但同時(shí)也揭示了一些令人困惑的現(xiàn)象，甚至對其提出質(zhì)疑，例如：針刺療效是否只有安慰效果〔6〕？為什么針刺非穴位點(diǎn)同樣可以產(chǎn)生療效〔7〕？針灸的臨床適應(yīng)證到底有哪些？代表個(gè)體差異及針刺敏感性的生物指標(biāo)和臨床意義是什么？這些問題在一定程度上阻礙了針灸現(xiàn)代化的進(jìn)程。近年來，已有針灸領(lǐng)域的研究開始應(yīng)用組學(xué)技術(shù)來探索上述問題。

2.1經(jīng)穴特異性 經(jīng)穴是針灸學(xué)的一個(gè)重要概念，其原始含義為“氣穴”、“脈氣所發(fā)”，是針灸療法發(fā)揮其治療作用的基礎(chǔ)。而目前國外的一些文獻(xiàn)報(bào)道〔8〕，經(jīng)穴和非經(jīng)穴刺激在臨床療效上并無差異。由于臨床試驗(yàn)的結(jié)果相互矛盾，針灸療法的療效一直存在激烈爭論。在2007年舉行的針灸研究學(xué)會(huì)國際研討會(huì)上，經(jīng)穴特異性被認(rèn)為是針灸實(shí)踐的核心科學(xué)問題之一〔9〕。

不少研究學(xué)者將組學(xué)技術(shù)納入經(jīng)穴特異性的研究，并做了相關(guān)報(bào)道。為了尋找陽明經(jīng)經(jīng)穴特異性的生物信息學(xué)依據(jù)，吳巧鳳等〔10〕采用代謝組學(xué)技術(shù)，觀察分別針刺健康男性陽明經(jīng)穴(足三里、梁門、巨髎)與其他經(jīng)穴(陽陵泉、委中)后，其尿液中代謝產(chǎn)物的改變情況，發(fā)現(xiàn)針刺陽明經(jīng)上各穴位，機(jī)體尿液代謝物的改變情況基本一致，均可升高尿液中馬尿酸和氧化三甲胺的含量，降低甘氨酸含量；而針刺委中后尿液中代謝物改變情況與針刺陽明經(jīng)穴有明顯不同，其尿液代謝物中肌酐明顯升高，提示陽明經(jīng)穴具有一定的共性和特異性。另外，Lin等〔11〕也對經(jīng)穴特異性進(jìn)行了研究，分別對健康大鼠的足陽明胃經(jīng)和足少陽膽經(jīng)上的穴位進(jìn)行電針干預(yù)，采用基于NMR代謝組學(xué)技術(shù)，探討由電針干預(yù)不同經(jīng)穴引起的代謝產(chǎn)物差異，發(fā)現(xiàn)無論是電針足陽明胃經(jīng)的穴位還是電針足少陰膽經(jīng)的穴位均能引起代謝產(chǎn)物的變化，且兩者的代謝變化差異顯著，為經(jīng)穴特異性理論提供了證據(jù)支持。

2.2經(jīng)穴-臟腑相關(guān) 經(jīng)絡(luò)和臟腑是中醫(yī)基礎(chǔ)理論的兩大系統(tǒng)。“內(nèi)屬臟腑，外絡(luò)肢節(jié)”，經(jīng)穴臟腑相關(guān)理論把人體上下內(nèi)外聯(lián)系成為一個(gè)整體，是經(jīng)絡(luò)學(xué)說的核心內(nèi)容〔12〕。但國外一些研究表明〔13〕，不遵循針灸理論，不選用特定經(jīng)穴，甚至不用進(jìn)行相應(yīng)的手法操作，也能達(dá)到與針灸相當(dāng)?shù)呐R床效應(yīng)。而經(jīng)絡(luò)和內(nèi)臟相關(guān)研究顯示〔14〕，針灸實(shí)時(shí)效應(yīng)與神經(jīng)節(jié)段有著復(fù)雜的聯(lián)系，除了表現(xiàn)出經(jīng)絡(luò)特異性外，還表現(xiàn)出多經(jīng)絡(luò)可調(diào)節(jié)同一內(nèi)臟功能。這些結(jié)果對傳統(tǒng)針灸理論提出挑戰(zhàn)，嚴(yán)重影響了針灸學(xué)科的發(fā)展。目前也有研究初步證實(shí)，經(jīng)穴與臟腑在基因、蛋白、代謝層面存在相關(guān)性和特異性，并認(rèn)為隨著臟腑功能變化，經(jīng)穴狀態(tài)可由靜息態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顟B(tài)〔15,16〕。

“心胸內(nèi)關(guān)謀”是經(jīng)穴-臟腑相關(guān)理論的具體表現(xiàn)，因此內(nèi)關(guān)穴-心臟疾病則是該理論的經(jīng)典研究模式。Fu等〔15〕采用急性心肌梗死大鼠模型，以電針內(nèi)關(guān)穴為治療手段，并采用轉(zhuǎn)錄蛋白組的染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP-assay)，探討針刺內(nèi)關(guān)穴效應(yīng)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)針刺心肌缺血大鼠內(nèi)關(guān)穴可以誘導(dǎo)H3K9ace調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號級聯(lián)促進(jìn)血管新生介導(dǎo)心肌保護(hù)；并驚奇地發(fā)現(xiàn)，對于正常大鼠，針刺內(nèi)關(guān)穴同樣也引起心肌組織中H3K9ace的高表達(dá)，提示經(jīng)穴狀態(tài)與臟腑功能變化是有交互作用的。另外陳以國等〔16〕基于“五臟有疾也，當(dāng)取之十二原”的理論，以太溪穴-腎臟為研究載體，電針雙側(cè)太溪穴干預(yù)7 d后分析其腎臟組織中蛋白質(zhì)組的變化情況，發(fā)現(xiàn)針刺太溪穴后腎臟蛋白質(zhì)組與非針刺組腎臟蛋白質(zhì)組相比有9個(gè)上調(diào)的差異蛋白，并且鑒定出其中兩個(gè)蛋白分別為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依賴型異檸檬酸脫氫酶和醌氧化還原酶，提示針刺太溪穴可增強(qiáng)腎臟能量和物質(zhì)代謝功能，太溪穴與腎具有相關(guān)性。

2.3針灸療效作用機(jī)制 針灸臨床適宜病種廣泛，療效顯著，據(jù)統(tǒng)計(jì)針灸臨床所涉及的病癥數(shù)達(dá)972種，也有人總結(jié)為16個(gè)系統(tǒng)的461種病癥。同時(shí)針灸療法呈現(xiàn)多樣化，如平衡針灸療法、頭皮針療法、靳三針療法、賀氏針灸三通法、腕踝針療法和筋針療法等。且針灸療法也越來越得到國際的認(rèn)可，1996年世界衛(wèi)生組織(NIH)米蘭會(huì)議提出了3類64種針灸適應(yīng)病癥。隨著針灸全球化的傳播，其也吸收了其他國家文化的精華，進(jìn)而蓬勃發(fā)展，在基礎(chǔ)理論、針刺方法、刺激部位和穴位組合方面都得到了銳意創(chuàng)新。例如，反映點(diǎn)針灸、泛穴針灸、經(jīng)絡(luò)逆向刺激療法、針灸瘢痕松解術(shù)、動(dòng)筋針法、糖針-舒適化針灸、針靈、激痛點(diǎn)針灸、本神針灸和精準(zhǔn)針灸等〔17〕，使得針灸領(lǐng)域百花齊放。但是目前針灸面臨的一大問題是“技術(shù)在不斷進(jìn)步，理論在原地踏步”，也就是說目前傳統(tǒng)的針灸理論不能明確地解釋其治療機(jī)制。

針灸治療作為一種刺激手段，可通過刺激生物體不同組織結(jié)構(gòu)如皮膚、肌肉、血管、神經(jīng)等誘發(fā)信息傳導(dǎo)及生化調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的變化，具有多途徑、多層次、網(wǎng)絡(luò)化的整體特點(diǎn)。而以往的針灸機(jī)制研究多針對單條或多條通路、單個(gè)或多個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行研究，往往難以全面解釋其作用機(jī)制，因此將組學(xué)技術(shù)引入針灸機(jī)制研究中，可使研究者在同一時(shí)間段內(nèi)獲得更多的棘突物質(zhì)變化情況，為針灸機(jī)制的整體化研究提供新的契機(jī)。

心腦血管疾病為針灸治療的優(yōu)勢病種，Yang等〔18〕對血管性癡呆大鼠進(jìn)行足三里和百會(huì)針刺治療，并于治療2 w后取Wistar大鼠腦組織進(jìn)行iTRAQ相對定量蛋白質(zhì)組學(xué)篩選出了31種差異表達(dá)蛋白，并通過生信分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白與氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、突觸功能相關(guān)，提出針刺可從調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡或突觸功能等多個(gè)方面治療血管性癡呆。足三里是針灸臨床上常用的穴位之一，Zhang等〔19〕對健康人群進(jìn)行2 w的電針足三里干預(yù)，并于干預(yù)前后抽血制備血清，并采用iTRAQ和UPLC/ESI-Q-TOF/MS技術(shù)進(jìn)行蛋白組學(xué)與代謝組學(xué)聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)針刺足三里可影響機(jī)體免疫、細(xì)胞凋亡、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝等多個(gè)生物過程，并對甘油磷脂代謝、醚脂代謝、脂肪酸代謝、甘油酯代謝、卟啉代謝、鞘脂代謝和原發(fā)性脂肪酸生物合成代謝等多方面綜合調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮其相應(yīng)的治療作用。

綜上，組學(xué)技術(shù)是一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域，可以為針灸領(lǐng)域的研究提供更為符合針灸作用規(guī)律的證據(jù)，能夠較為全面和系統(tǒng)地揭示針灸作用機(jī)制，完善針灸理論基礎(chǔ)，促進(jìn)針灸的發(fā)展。然而目前針灸的基礎(chǔ)理論研究和針灸效應(yīng)研究中由于經(jīng)穴和經(jīng)絡(luò)概念的理解上的歧義，不同學(xué)科、不同實(shí)驗(yàn)室、不同國家采用的不同研究方法使得各種實(shí)驗(yàn)室結(jié)果無法重復(fù)，證據(jù)不足，難以突破，使針灸學(xué)面臨前所未有的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，問題就在于經(jīng)絡(luò)基礎(chǔ)的研究成果無法顯示可觀、可測的經(jīng)脈客體。因此，在后續(xù)的研究中，建立一個(gè)公認(rèn)的針灸研究規(guī)范是十分必要的，同時(shí)還需注意實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)量控制，避免研究設(shè)計(jì)、方法中出現(xiàn)的不足。