基于網(wǎng)絡藥理學探討星萎承氣湯治療急性腦梗死的作用機制

陳琛 李偉 耿花蕾 王雅惠 吳康 王月 陳天竹 鄒憶懷

摘要目的：基于網(wǎng)絡藥理學探討星簍承氣湯治療急性腦梗死的作用機制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）結(jié)合文獻檢索獲取星荽承氣湯有效藥物成分;在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預測藥物成分相關(guān)靶點;利用在線人類孟德爾遺傳（OMIM）數(shù)據(jù)庫、Gene Cards數(shù)據(jù)庫獲取急性腦梗死疾病相關(guān)靶點;繪制韋思圖得到星荽承氣湯治療急性腦梗死的潛在作用靶點;采用String數(shù)據(jù)庫、Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建潛在作用點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡、藥物-成分-疾病靶點網(wǎng)絡;使用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫對潛在作用靶點進行基因本體（GO）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。結(jié)果：通過TCMSP結(jié)合相關(guān)文獻檢索共獲得星承氣湯藥物有效成分47個，包括芹菜素、香葉木素、膽酸等;得到星葵承氣湯治療急性腦梗死潛在作用靶點85個，包括STAT3、ESRI、CCNBI等;共獲得CO富集分析功能條目225條，包括生物過程（BP）132條，細胞組分（CC）34條，分子功能（MF）59條;KEGG信號通路共20條，主要包括花生四烯酸代謝、膽汁分泌、CAMP信號通路等。結(jié)論：基于網(wǎng)絡藥理學，從分子層面闡釋了星萎承氣湯治療急性腦梗死的機制可能為抑制氧化應激、抗芡、調(diào)節(jié)能量代謝、抗凋亡等，為后續(xù)實驗研究、新藥研發(fā)提供了線索和依據(jù)。

關(guān)鍵詞急性腦梗死;星蔞承氣湯;網(wǎng)絡藥理學;作用機制

中圖分類號：R285

文獻標識碼：A

doi：10.3969/[J].is.1673-7202.2021.21.010

腦梗死是指腦組織部分區(qū)域血流供給障礙，弓起缺血缺氧性壞死，進而產(chǎn)生相應神經(jīng)功能缺損的疾病，是影響我國居民壽命的主要疾病之一山。急性腦梗死在我國十分常見，占腦梗死的69.6%～70.8%2，一般指發(fā)病后2周內(nèi)，輕型1周內(nèi)，重型1個月內(nèi)。靜脈溶栓是當前臨床上治療急性腦梗死公認最有效的方式，但受時間窗和禁忌證的限制，可以接受溶栓的患者十分有限，而抗凝、抗血小板治療有不同程度的出血風險。中醫(yī)藥不拘泥于患者的發(fā)病時間和基礎疾病，依據(jù)不同個體辨證施治，臨床上有確切的療效，為診治急性腦梗死提供了新的思路和方法，逐漸被臨床所重視。

急性腦梗死在中醫(yī)學中為“中風”。20世紀80年代，王永炎院士通過對急性中風病患者的臨床觀察，發(fā)現(xiàn)“痰火”常為中風始發(fā)態(tài)的關(guān)鍵病機，患者腑實便秘伴痰火、風火諸癥，且腑氣通否的征象與患者病勢的順逆密切相關(guān)，遂在古人通腑法治療中風的基礎上提出化痰通腑法，以星承氣湯為代表方劑的。后經(jīng)過大量的臨床研究和實踐，星蔞承氣湯對于改善患者意識、扭轉(zhuǎn)病情加重的趨勢和減輕半身不遂的病損程度具有較好效果。中藥復方成分多樣，作用于人體靶點復雜，而網(wǎng)絡藥理學可以闡明藥物、靶點基因和疾病之間的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡，是探討藥物對疾病治療潛在分子機制的新手段，且其對生物系統(tǒng)整體的分析，也契合于中醫(yī)整體觀的思想。本文基于網(wǎng)絡藥理學，探討星萎承氣湯治療急性腦梗死的作用機制，以期為臨床及實驗提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1獲取星蔞承氣湯有效藥物成分在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Plat-formTcmsp）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php），e王永炎院士提出星蔞承氣湯經(jīng)典組成”：“瓜蔞”膽南星”“大黃”“芒硝”“羌活”為關(guān)鍵詞，設置口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.188為篩選條件，獲取藥物有效成分?？紤]芒硝作用成分為硫酸鈉，其硫酸根離子不易被機體吸收，在腸內(nèi)造成高滲環(huán)境，物理刺激而產(chǎn)生瀉下作用，故暫無法基于藥物作用于人體靶點的整合藥理學進行分析。由査閱文獻補充未檢索到的膽南星成分，盡可能還原星萎承氣湯藥物成分，提高預測可信度。

1.2預測星菱承氣湯藥物成分相關(guān)靶點將藥物有效成分輸入Pubchem數(shù)據(jù)庫（htts：//pubchemncbi.nlm.mih.gov/），得到相應的SMILE號，在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（htp：//www.swisstargetprediction.ch/），限定物種為人，由成分的SMILE號預測藥物成分相關(guān)靶點，設定可能性≥0.15篩選出相關(guān)性較高的靶點。

1.3獲取急性腦梗死相關(guān)靶點以“Acute Ischemic Stroke'“Acute Cerebral Infarction”為關(guān)鍵詞，在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù)據(jù)庫（https：！/omim.org/）、Gene Cards（https：/www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫進行檢索，去除重復基因，得到疾病相關(guān)靶點。

1.4獲取星萎承氣湯治療急性腦梗死的潛在作用靶點將上述所得星萎承氣湯靶點與急性腦梗死相關(guān)靶點輸入Veny2.1在線作圖平臺，繪制韋恩圖，獲得二者交集靶點，即為星萎承氣湯治療急性腦梗死的潛在作用靶點。

1.5構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病網(wǎng)絡圖在Cytoscape3.8.0軟件中上傳潛在靶點及其所關(guān)聯(lián)的藥物成分，構(gòu)建藥物-成分-靶點-疾病靶點相互作用的網(wǎng)絡圖。使用NetworkAnalyzer對藥物有效成分進行分析，根據(jù)Degree值從大到小排列，篩選出前10位的藥物成分。

1.6構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡將星菱承氣湯治療急性腦梗死的潛在靶點導入String數(shù)據(jù)庫（https：/string-db.org/）中，限定物種為人，最低相互作用閾值設為中等“Medium Confidence（0.4）得到星萎承氣湯作用于急性腦梗死的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein Protein Interaction，PI）網(wǎng)絡，保存為TSV格式文件。將其導入Cytoscape3.8.0軟件繪制Pl圖進行可視化展示。使用Cytoscape 3.8.0軟件中的cytohubba插件，通過馬修斯相關(guān)系數(shù)（Matthews Correlation Coefficient，MCC）算法，得到交互作用分值在前10的核心靶點，繪制核心靶點之一。

間的PP圖。

1.7基因本體及京都基因與基因組百科全書富集分析使用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫（https：//davic.ncifcrf.gov/）對星蔞承氣湯治療急性腦梗死的潛在靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，設定物種和背景為人，在結(jié)果中獲取生物過程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、細胞組分（Cellular Component，CC）及KEGG信號通路，以P值表示蛋白質(zhì)相關(guān)功能的顯著性，借助Imagegp在線作圖平臺繪制氣泡圖。

2結(jié)果

2.1星承氣湯有效藥物成分及成分靶點預測在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索星萎承氣湯藥物的有效成分，設置OB≥30%，DL≥0.18，最終得到有效成分瓜11個，大黃16個，羌活15個。經(jīng)查閱文獻，膽南星由牛、羊或豬膽汁與天南星共同炮制而成，主要成分有所差異。本文以牛膽汁炮制的膽南星為例，其主要由膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸、芹菜素、夏佛塔苷、異夏佛塔苷構(gòu)成，共獲得47個有效藥物成分。在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫檢索藥物有效成分，去除重復靶點，得到603個靶點，篩選出可能性≥0.15的靶點114個。

2.2星蔞承氣湯治療急性腦梗死的潛在靶點獲取

在OMIM數(shù)據(jù)庫、Genecards數(shù)據(jù)庫檢索急性腦梗死，去除重復基因，獲取相關(guān)發(fā)病靶點3040個。將上述所得藥物靶點與疾病靶點輸入Venny2.1在線作圖平臺，繪制韋恩圖。獲得二者交集靶點85個，即為星菱承氣湯治療急性腦梗死的澘在作用靶點，包括NRIH4、NOX4、AKRIBI、CDK5、CDK5R1 XDH、FLT3、CYP19A1、ESRI、CDK1、CCNBI等。見圖1。

2.3藥物-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡圖構(gòu)建與分析將星蔞承氣湯治療急性腦梗死的有效成分與潛在作用靶點導入Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點疾病相互作用網(wǎng)絡圖。根據(jù)Cytoscape3.8.0軟件Network Analyzer分析工具算出有效成分Degree1值，Degree值越大表示節(jié)點的重要性越大。藥物有效成分Degree值位于前5位的分別是芹菜素（Apigenin）為44，香葉木素（Diosmetin）為35，羥基芫花素（Hydroxygenkwanin）為19，膽酸（CholicAcid）為16，菠菜甾醇（Spinasterol）為15。見圖2，表1

2.4PPI網(wǎng)絡構(gòu)建與分析將星萎承氣湯治療急性

腦梗死的85個潛在作用靶點導入String數(shù)據(jù)庫，選擇置信度score≥0.400，下載TSV數(shù)據(jù)文件，導入Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡圖。共獲得85個節(jié)點，356條邊，平均節(jié)點度值為8.38。使用cyto Huba插件的MCC算法找出PPI網(wǎng)絡的核心靶點，包括STAT3、ESRI、CCNBI、EGFR、AR等。圖中節(jié)點顏色越深表示其MCC分值越高，即此節(jié)點在PPI網(wǎng)絡中越重要。見圖3～4。

2.5GO富集分析采用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫對星蔞承氣湯潛在靶點治療急性腦梗死澘在作用靶點進行GO生物功能富集分析，共獲得P值小于0.05的GO功能條目225條，其中BPI32條，C34條，MFS59條。BP主要富集在細胞內(nèi)受體信號轉(zhuǎn)導、對藥物的反應、凋亡過程負調(diào)控、炎癥反應負調(diào)節(jié)、從RNA聚合酶Ⅱ啟動子開始轉(zhuǎn)錄等;CC主要富集在胞質(zhì)、質(zhì)膜、核漿、肌鈣蛋白復合物等;MF主要富集在RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、鋅離子結(jié)合等。選取P值排名前20的富集結(jié)果在Imagegp在線作圖平臺繪制氣泡圖。見圖5～7。

2.6KEG富集分析將星菱承氣湯治療急性腦梗死潛在作用靶點輸人David6.8數(shù)據(jù)庫進行KEEG富集分析，限定P《0.05，結(jié)果顯示共有20條信號通路，繪制氣泡圖。由P值從小到大排列，排除癌相關(guān)通路，排名前10的通路主要涉及花生四烯酸（Arachidonic Acid，AA）代謝、膽汁分泌、5-羥色胺能突觸、卵巢甾體生成、雌激素信號通路、cAMP信號通路、PPAR信號通路、催乳素信號通路、神經(jīng)活性配體受體相互作用通路等。見圖8，表2。

3討論

王永炎院士在長期臨床實踐中，發(fā)現(xiàn)急性中風患者除中風主癥外，常伴便干便秘、舌苔黃膩、脈弦滑三大特征，為痰熱腑實證，認為急性期雖為本虛，但偏重標實;中焦痰熱互結(jié)，熱灼津液故大便干腑氣不暢，濁邪上犯腦絡，機體失于升清降濁，氣血逆亂，故意識障礙、半身不遂;強調(diào)把握瀉下的時機，予以星萎承氣湯以通腑化濁，使氣血正常敷布，是逆轉(zhuǎn)病情的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。方中全瓜蔞、膽南星以清化痰熱，寬中散結(jié)，熄風定驚;生大黃、芒硝通腑瀉下以滌蕩胃腸;佐以羌活不單祛風，而重在升發(fā)陽氣、通竅宣郁疏經(jīng)活絡。

在星蔞承氣湯治療急性腦梗死的主要成分中，芹菜素、香葉木素、膽酸、菠菜甾醇β-谷甾醇都對急性腦梗死后受損的神經(jīng)細胞有良好的保護作用。芹菜素為膽南星主要成分，研究發(fā)現(xiàn)芹菜素通過減輕細胞凋亡和自噬，促進人腦微血管內(nèi)皮細胞增殖，減輕缺血后的腦損傷。香葉木素為羌活、瓜蔞共有成分，張楠等2研究表明香葉木素可以減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，作用機制可能為抗氧化、抑制凋亡以及抗炎癥。膽酸為膽南星主要成分，是構(gòu)成膽汁酸的基本單位。Yanguas-Casas等研究發(fā)現(xiàn)膽汁酸結(jié)合物?；切苋パ跄懰幔═UDCA）通過降低神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化，降低小膠質(zhì)細胞遷移能力，繼而降低由腦梗死等促炎性刺激引起的膠質(zhì)細胞持續(xù)活化損壞神經(jīng)元。菠蘿甾醇為瓜萎主要成分，據(jù)報道菠菜甾醇通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）途徑依賴的血紅素加氧酶（HO-1）表達，增加了海馬HI22細胞對氧化損傷的細胞抗性，此外還抑制了促炎酶和炎癥介質(zhì)的表達，可減輕急性腦梗死引起的氧化應激和神經(jīng)炎癥損傷。B-谷畄醇為大黃、羌活的主要成分，通過抑制脂多糖誘導的p38、ERK和NF-kxB

通路的激活，抑制了小膠質(zhì)細胞中炎癥介質(zhì)（L6、iNOS、COX-2和TNF-c）的釋放，繼而保護神經(jīng)細胞。以上可能是星蔞承氣湯治療急性腦梗死潛在的藥效基礎，但都以單一成分為切入點進行研究，而中藥復方藥物作用機制多樣，急性腦梗死病理情況復雜，不能體現(xiàn)星萎承氣湯在不同環(huán)節(jié)多機制對急性腦梗死產(chǎn)生的作用。

網(wǎng)絡藥理學實現(xiàn)了從單一成分、單一靶點研究到多成分、多靶點、多通路研究的跨越，系統(tǒng)地闡明了中藥復方醫(yī)治疾病的分子機制。本研究基于網(wǎng)絡藥理學對星蔞承氣湯治療急性腦梗死潛在作用靶點進行PI網(wǎng)絡構(gòu)建與分析，結(jié)合相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)星蔞承氣湯治療急性腦梗死的核心靶點為STAT3、ESR1、CCNB1、EGFR、AR、MMP等。信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）廣泛分布在大腦神經(jīng)系統(tǒng)，可以被許多細胞因子、生長因子所激活，在抗炎、抗調(diào)亡、細胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。

研究表明STAT3可以通過白細胞介素6（L-6）的激活介導錳超氧化物歧化酶（MN-SOD）的表達，保護神經(jīng)細胞免受氧化應激，減少梗死面積1。此外，急性腦梗死影響全身免疫應答，通過調(diào)節(jié)STAT3激活狀態(tài)，經(jīng)JAK-STAT3通路能夠恢復NK細胞功能，改善腦缺血后的免疫防御。ESRI為雌激素作用受體，有研究指出在腦微血管內(nèi)皮上表達的ESRI可啟動多項生物學效應，能增加血管舒張功能，減少血管炎癥，增強線粒體功能，在腦血管系統(tǒng)中發(fā)揮多種保護作用。研究表明ESRI可以促進沉默交配型信息調(diào)節(jié)2同系物1（SIRT1）的表達，從而促進AMP依賴的蛋白激酶AMPK的激活，進一步調(diào)節(jié)能量消耗，抵御腦梗死造成的神經(jīng)細胞能量耗竭，促進神經(jīng)元在缺血應激下成活CCNBI（Cyclin B1）為有絲分裂的調(diào)控蛋白Veas-Perezde Tudela等發(fā)現(xiàn)在腦梗死受損腦區(qū)CCNB1異常積累，導致有絲分裂后的神經(jīng)元凋亡。研究表明，保持

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81873257）;國家“十二五”科技支撐計劃項目（2013BAI13B022）

作者簡介：陳琛（1995.07-），女，博士研究生在讀，研究方向：中醫(yī)藥治療神經(jīng)內(nèi)科疾病，E-mail：clench99@126.com

通信作者：鄒憶懷（1965.10-），男，博士，教授，博土研究生導師，研究方向：中醫(yī)藥防治神經(jīng)內(nèi)科疾病及腦功能重塑，E-mail：zouyihuai.2004@163.com