基于網(wǎng)絡(luò)藥理探究糖尿病腎病進(jìn)展相關(guān)代謝物靶標(biāo)的分子機(jī)制

戈娜 林韋翰 黃靜婷 古秀芬 吳瑕

摘要 目的：應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理技術(shù)，分析糖尿病腎病進(jìn)展相關(guān)代謝物及其分子靶標(biāo)和作用機(jī)制。方法：基于前期代謝組學(xué)篩選出的與糖尿病腎病進(jìn)展高度相關(guān)的代謝物，使用京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）、Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索提取與代謝物有關(guān)的有效靶標(biāo)基因，并進(jìn)行通路分析;采用Cytoscape3.2.1軟件Cluego進(jìn)行代謝物基因靶標(biāo)的通路、生物過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能進(jìn)行富集分析，并繪制網(wǎng)絡(luò)圖。結(jié)果：本研究共分析了31個(gè)與糖尿病腎病進(jìn)展相關(guān)的代謝物;應(yīng)用KEGG和Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)，共提取了31個(gè)代謝物，涉及代謝通路82條，涉及基因靶標(biāo)252個(gè);代謝物的基因靶標(biāo)共涉及157條通路。代謝物基因靶標(biāo)主要集中在谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等代謝物?；诖x物-基因靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖核心節(jié)點(diǎn)進(jìn)行解析，提示谷氨酸是連線最多的節(jié)點(diǎn)，其次是酪氨酸、谷氨酰胺、色氪酸等;連線最多的通路包括糖酵解/糖異生，脂肪酸降解、基酸合成等;最集中的基因靶標(biāo)為NOS2、NOS3、ALDH7A1等?；虬袠?biāo)的富集分析結(jié)果表明，代謝物基因靶標(biāo)主要集中在氨基酸代謝、脂肪酸、氪代謝等。基因靶標(biāo)涉及的細(xì)胞組分分析提示糖尿病腎病進(jìn)展主要與線粒體、突觸膜、突觸前膜等細(xì)胞部位異常有關(guān)。疾病進(jìn)展涉及的分子功能包括氨基酸、羧酸、維生素拼接等。結(jié)論：通過(guò)對(duì)代謝物基因靶標(biāo)進(jìn)行深入的網(wǎng)絡(luò)分析提示，氨基酸代謝異常在糖尿病腎病進(jìn)展中至關(guān)重要，是參與機(jī)體免疫代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 糖尿病腎臟病;氨基酸代謝;分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制;靶標(biāo)

中圖分類(lèi)號(hào)：R285

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/[J].isn.1673-7202.2021.21.009

全球糖尿病及糖尿病腎病的發(fā)病率連年上升加重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。慢性腎臟?。–hronic Kidney Disease，CKD）是糖尿病的最主要并發(fā)癥之一，隨著糖尿病發(fā)病的不斷增加，CKD在成年糖尿病人群的發(fā)病率，20002007年逐年增加，并且中國(guó)糖尿病患者的CKD發(fā)病率（10.9%）顯著高于全球平均發(fā)病率。美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)（American Diabetes Association，ADA）指出，20%～40%的糖尿病患者將進(jìn)展為CKD2。中國(guó)CKD患者的發(fā)病率從2010年的19.5%攀升至2015年的24.3%。CKD還是心血管疾病及過(guò)早死亡的危險(xiǎn)因素。而2型糖尿病合并CKD患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是單純2型糖尿病或者單純CKD患者的2倍多。糖尿病是重要的代謝性疾病，疾病進(jìn)展過(guò)程中存在明顯糖、脂、氨基酸、核酸代謝異常。腎臟是機(jī)體排泄代謝產(chǎn)物的重要器官，對(duì)機(jī)體的代謝調(diào)節(jié)有重要作用。機(jī)體代謝異常在糖尿病腎臟損傷過(guò)程中的作用機(jī)制尚不十分清楚。異常變化的代謝物是評(píng)估疾病的標(biāo)志物，抑或是參與疾病進(jìn)展的致病因素，尚不明確。我們前期應(yīng)用代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在疾病進(jìn)展過(guò)程中一系列氨基酸、脂肪酸、核酸代謝產(chǎn)物，隨疾病進(jìn)展顯著異常。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是隨系統(tǒng)生物學(xué)發(fā)展而漸興之技術(shù)，其通過(guò)分析現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)的信息資料，結(jié)合實(shí)驗(yàn)中獲取的數(shù)據(jù)，利用算法，系統(tǒng)、整體地揭示疾病疾病、疾病表型靶點(diǎn)蛋白、靶點(diǎn)蛋白-藥物、藥物-藥物之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，從網(wǎng)絡(luò)層面解析分子靶標(biāo)在疾病中的作用機(jī)制。

本研究擬應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，對(duì)前期篩選出的與糖尿病腎病進(jìn)展相關(guān)的代謝物進(jìn)行基因靶標(biāo)的提取，并基于京都基因與基因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因靶標(biāo)涉及的通路及生物功能進(jìn)行富集分析，以期進(jìn)一步闡釋疾病進(jìn)展過(guò)程中代謝物參與疾病進(jìn)展的分子機(jī)制。

1資料與方法

1.1疾病進(jìn)展相關(guān)代謝物基因靶標(biāo)的提取及整理提取基因靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)包括：KEGG Compound Database（https：//www.kegg.jp/kegg/ccompound/）

Pubchem（https：//pubchnem.ncbl.nim.n將篩選出的與疾病進(jìn)展相關(guān)代謝物以化合物名字和Inchikey為檢索詞，在Pubchem、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中搜集與人類(lèi)有關(guān)聯(lián)的糖尿病腎病代謝物基因靶標(biāo)。應(yīng)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索與所有代謝產(chǎn)物相關(guān)的靶標(biāo)基因，在檢索不到代謝產(chǎn)物的記錄時(shí)，參考Puchen內(nèi)該代謝產(chǎn)物所有同義詞，并在KEGG Compound Database內(nèi)進(jìn)行檢索;所有檢索結(jié)果需要校對(duì)代謝產(chǎn)物的化學(xué)式，以確保代謝產(chǎn)物正確。依據(jù)Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)檢索所有疾病代謝產(chǎn)物，并收錄“Bioactivities'”選項(xiàng)下有效結(jié)果的靶標(biāo)基因;將檢索KEGGCompoundDatabase與Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)所得結(jié)果匯總，刪除相同靶標(biāo)基因。

1.2基于Cytoscape構(gòu)建代謝物、通路、基因靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖將代謝物、基因靶標(biāo)導(dǎo)入Cytoscape繪制代謝物-基因靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖，分析基因靶標(biāo)聚集情況。將代謝物輸人KEGG PATHWAY Database（htps：//ww.keg.jp/kegg/pathway.html），獲取代謝物參與通路情況。應(yīng)用Cytocape繪制代謝物-通路網(wǎng)絡(luò)圖，明確代謝物參與通路情況。將代謝物、涉及通路、基因靶標(biāo)統(tǒng)一導(dǎo)人Cytoscape，繪制代謝物通路-基因靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3疾病進(jìn)展相關(guān)代謝物基因靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及富集分析將基因靶標(biāo)導(dǎo)人Cytosacape3.7.2軟件，應(yīng)用CLUEGO插件，選擇Homo Sapiens限定范圍，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用基因本體（Gene Ontology，GO）生物過(guò)程（Bilogical Process，BP）或KEGG pathway進(jìn)行通路分析及生物功能分析，獲取通路及生物功能可視化網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中，P值越小，圓圈越大，圓圈節(jié)點(diǎn)代表代謝物相關(guān)的基因靶標(biāo)，邊代表靶標(biāo)之間的聯(lián)系。

2結(jié)果

2.1疾病進(jìn)展相關(guān)代謝物的篩選基于課題組前期代謝組學(xué)結(jié)果，選取糖尿病腎病進(jìn)展過(guò)程中與腎小球?yàn)V過(guò)率（Glomerular FiltrationRate，GFR）緊密相關(guān)的31種代謝物，分別為色氨酸、肉毒堿、葡萄糖、酪氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、硫酸脫氫表雄酮、甜菜堿羥丁酸、尿酸、γ丁酰甜菜堿、膽堿、苯丙氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、辛酰基肉毒堿、鳥(niǎo)氨酸、叫哚乙酸、馬尿酸、瓜氨酸、N.乙酰肌肽、犬尿氨酸、吲哚乳酸、硫酸吲哚酚、犬尿喹啉等。見(jiàn)表1。

2.2疾病進(jìn)展相關(guān)代謝物基因靶標(biāo)的提取及整理

31種代謝物中，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中共提取到269個(gè)基因靶標(biāo)，在Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)中共提取69個(gè)，去掉代謝物之間重復(fù)及數(shù)據(jù)間重復(fù)的靶標(biāo)，共計(jì)252個(gè)代謝物基因靶標(biāo)。繪制代謝物與基因靶標(biāo)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，提示基因靶標(biāo)主要集中在谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、膽堿、尿苷、肌苷、甲硫氨酸氨酸等代謝物。見(jiàn)圖1。

2.3疾病進(jìn)展相關(guān)代謝物涉及的通路將31種代謝物輸人KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取代謝物涉及通路情況，發(fā)現(xiàn)31種代謝物共參與82條通路。繪制代謝物與通路間關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，提示谷氨酸涉及的通路最豐富，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺次之。見(jiàn)圖2。

2.4疾病進(jìn)展相關(guān)代謝物、基因靶標(biāo)及靶標(biāo)通路情況將31種代謝物的252種基因靶標(biāo)輸入KEGG Pathway數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取代謝物基因靶標(biāo)涉及通路情況，共獲取基因靶標(biāo)通路157條。應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建代謝物-基因靶標(biāo)-通路圖?；诰W(wǎng)絡(luò)圖的連線Degree對(duì)圖中的核心節(jié)點(diǎn)解析提示，谷氨酸是連線最多的節(jié)點(diǎn)，其次是酪氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸;連線最大的通路為糖酵解/糖異生脂肪酸降解、氨基酸合成、煙酰胺代謝、視黃醇代謝tRNA生物合成、丙酮酸代謝;最集中的基因靶標(biāo)為NOS2、NOS3、ALDH7A1、PLD1、GOT2、ALDH9A1等。

見(jiàn)圖3。

2.5疾病進(jìn)展相關(guān)代謝物基因靶標(biāo)富集分析

2.5.1基因靶標(biāo)涉及通路富集分析使用Cytoscape的插件Cluego對(duì)基因靶標(biāo)進(jìn)行富集分析，通路的富集結(jié)果表明，與腎病進(jìn)展相關(guān)代謝物的基因靶標(biāo)主要集中在氨基酸代謝、脂肪酸、氮代謝、核酸代謝方面，其中色氨酸代謝、脂肪酸降解、嘧啶代謝、酪氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝靶標(biāo)最為豐富。見(jiàn)圖4。

2.5.2基因靶標(biāo)涉及BP富集分析BP富集結(jié)果

表明，與腎病進(jìn)展相關(guān)的代謝物基因靶標(biāo)主要集中在細(xì)胞的氨基酸代謝、小分子代謝、有機(jī)酸代謝、有機(jī)氮復(fù)合物代謝等。見(jiàn)表2，圖5。

2.5.3基因靶標(biāo)涉及細(xì)胞組分富集分析細(xì)胞組分（Cellular Component，CC）的富集結(jié)果表明，疾病進(jìn)展代謝物基因靶標(biāo)涉及的細(xì)胞部位包括：線粒體突觸膜、突觸前膜、突觸、軸突末端、終扣、樹(shù)突胞質(zhì)、過(guò)氧化物酶體、質(zhì)膜、外側(cè)瞄蛋白成分等細(xì)胞部位。見(jiàn)圖6，表3。

2.5.4基因靶標(biāo)涉及分子功能富集分析分子功能（Molecular Function，MF）富集分析結(jié)果提示氨基酸、羧酸、維生素拼接，轉(zhuǎn)移酶活性、配體活性、谷氨酸受體活性、NAD活性、氧化還原酶活性、肉毒堿乙?；D(zhuǎn)移酶活性變化均與糖尿病腎病進(jìn)展過(guò)程相關(guān)。見(jiàn)表4，圖7。

3討論

本研究在前期研究基礎(chǔ)上，篩選出31種與糖尿病腎病患者GFR下降密切相關(guān)的代謝物，基于KEGG、Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)，提取代謝物的活性基因靶標(biāo)。采用KEGG通路分析及Cytoscape插件CLUEGO進(jìn)行基因靶標(biāo)的分析。

本研究發(fā)現(xiàn)，提取的糖尿病腎病進(jìn)展相關(guān)代謝物基因靶標(biāo)主要集中在谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、膽堿、尿苷、肌苷、甲硫氨酸氨酸等代謝物?；诖x物-基因靶標(biāo)-網(wǎng)絡(luò)圖的關(guān)聯(lián)度對(duì)圖中的核心節(jié)點(diǎn)進(jìn)行解析，提示谷氨酸是連線最多的節(jié)點(diǎn)，其次是酪氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸;連線最多的通路為糖酵解/糖異生，脂肪酸降解、氨基酸合成、煙酰胺代謝、視黃醇代謝、RNA生物合成、丙酮酸代謝;最集中的基因靶標(biāo)為NOS2、NOS3、ALDH7A1、PLD1、GOT2、ALDH9A1等。

基因靶標(biāo)的富集分析結(jié)果表明，與腎病進(jìn)展相關(guān)代謝物的基因靶標(biāo)主要集中在氨基酸代謝、脂肪酸、氮代謝、核酸代謝方面，其中色氨酸代謝、脂肪酸降解、嘧啶代謝、酪氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝靶標(biāo)最為豐富。BP方面，與腎病進(jìn)展相關(guān)的代謝物基因靶標(biāo)主要集中在細(xì)胞的氨基酸代謝小分子代謝、有機(jī)酸代謝、有機(jī)氮復(fù)合物代謝等。基因靶標(biāo)涉及的CC分析提示糖尿病腎病進(jìn)展主要與線粒體、突觸膜、突觸前膜、突觸、軸突末端、終扣、樹(shù)突胞質(zhì)、過(guò)氧化物酶體、質(zhì)膜、外側(cè)瞄蛋白成分等細(xì)胞部位異常有關(guān)。疾病進(jìn)展涉及的MF包括氨基酸、羧酸、維生素拼接，轉(zhuǎn)移酶活性、配體活性、谷氨酸受體活性、NAD活性、氧化還原酶活性、肉毒堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶活性變化均與糖尿病腎病進(jìn)展過(guò)程相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)異常的氨基酸代謝參與糖尿病腎病的進(jìn)展過(guò)程，該結(jié)果與近年來(lái)報(bào)道的氨基酸具有調(diào)節(jié)中樞能量代謝、氧化還原平衡、表觀遺傳修飾的作用相一致。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體循環(huán)氨基酸可以作為2型糖尿病患者大血管、微血管、全因死亡的危險(xiǎn)因素。低濃度的酪氨酸是獨(dú)立于腎功能損傷以外的預(yù)測(cè)2型糖尿病患者微血管并發(fā)癥的標(biāo)志物。氨基酸參與機(jī)體細(xì)胞功能的發(fā)揮，促進(jìn)機(jī)體ATP生成核苷酸合成及氧化還原平衡的維持。氨基酸同時(shí)參與機(jī)體免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，參與癌癥、感染以及代謝性疾病的發(fā)生。氨基酸代謝促進(jìn)糖酵解和TCA循環(huán)，以及線粒體脂肪酸氧化（FAO），進(jìn)一步推動(dòng)線粒體代謝和ATP的產(chǎn)生，谷氨酰胺支持代謝重構(gòu)，參與Th1和Th17細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)”。此外，支鏈氨基酸可通過(guò)刺激葡萄糖攝取促進(jìn)糖酵解以支持免疫細(xì)胞的代謝重編程）。絲氨酸也促進(jìn)線粒體代謝。氨基酸調(diào)控機(jī)體氧化還原代謝，對(duì)維持氧化還原平衡至關(guān)重要。代謝物基因靶標(biāo)CC分析的結(jié)果提示線粒體、突觸、軸突、終扣、樹(shù)突等細(xì)胞部位富集顯著，提示糖尿病腎病進(jìn)展過(guò)程中，突觸傳遞、樹(shù)突、軸突等神經(jīng)遞質(zhì)信號(hào)傳遞起重要作用。近年發(fā)現(xiàn)，氨基酸及其代謝物除了參與機(jī)體免疫代謝調(diào)節(jié)，其下游代謝物多為神經(jīng)遞質(zhì)，參與神經(jīng)傳導(dǎo)，是免疫介導(dǎo)的重要物質(zhì)，參與機(jī)體的免疫代謝。諸如色氨酸下游的血清素、褪黑素、犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、喹啉酸，酪氨酸下游的多巴胺、去甲腎上腺素、腎上腺素，組氨酸下游的組胺，谷氨酸下游的GABA等均可由免疫細(xì)胞分泌，調(diào)節(jié)機(jī)體的炎癥狀態(tài)，參與免疫相關(guān)疾病的發(fā)生綜上所述，通過(guò)對(duì)代謝物基因靶標(biāo)進(jìn)行深入的網(wǎng)絡(luò)分析提示，氨基酸代謝異常在糖尿病腎病進(jìn)展中至關(guān)重要，是參與機(jī)體免疫代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

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