青少年肥胖非酒精性脂肪肝患者血清外泌體源性miRNA表達(dá)譜的初步研究*

章建偉，吳若雅，潘海滔

浙江省紹興市婦幼保健院兒?？?，浙江紹興 312000

非酒精性脂肪肝(NAFLD)為除飲酒和其他病理因素外引起過多脂肪在肝臟堆積導(dǎo)致的慢性疾病，是常見的慢性肝病[1]，容易發(fā)生在肥胖患者中，可增加心血管病的發(fā)生率[2]。據(jù)報(bào)道，65%～85%的肥胖患者易發(fā)生NAFLD[3]，其機(jī)制尚未完全了解。近年來，研究發(fā)現(xiàn)外泌體微小RNA(miRNA)在NAFLD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[4]。外泌體是一種運(yùn)載miRNAs 等重要分子的微小囊泡，發(fā)揮細(xì)胞間聯(lián)絡(luò)作用。肝臟細(xì)胞，尤其是肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，既可釋放外泌體，又是肝臟內(nèi)源性外泌體和其他器官細(xì)胞來源的外泌體作用的靶細(xì)胞。miRNAs為非編碼單鏈RNA分子，參與脂肪細(xì)胞分化、肝臟脂肪酸和膽固醇代謝、胰島素抵抗、線粒體損傷等過程的調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞的外泌體miRNAs可以增加胰島素抵抗[5]。另一項(xiàng)研究也表明外泌體miRNAs可作為病毒性肝炎、酒精性脂肪肝、NAFLD和肝細(xì)胞癌的潛在生物標(biāo)記物，外泌體miRNAs或蛋白的表達(dá)隨著NAFLD的進(jìn)展改變[6]。因此監(jiān)測外泌體miRNAs對(duì)探索NAFLD的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 經(jīng)紹興市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，收集2019年7-12月來本院兒童內(nèi)分泌科就診并收住入院的NAFLD患者5例(男3例，女2例)作為NAFLD組，根據(jù)性別、年齡配對(duì)5例單純肥胖患者作為對(duì)照組。本研究獲得受試者家屬知情同意并簽署知情同意書。10例研究對(duì)象年齡10～13歲。青少年NAFLD的診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)內(nèi)分泌學(xué)組于2018年發(fā)布的專家共識(shí)[7]中彩色超聲診斷標(biāo)準(zhǔn)。肥胖判斷體質(zhì)量指數(shù)(BMI)標(biāo)準(zhǔn)基于中國兒童的生長發(fā)育標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.2方法 所有患者均為住院患者，均于上午7點(diǎn)采集外周血5 mL，提取血清。采用外泌體提取試劑盒提取法提取外泌體，試劑盒由SBI公司提供。對(duì)提取的外泌體使用總RNA提取法提取總RNA，用微量核酸蛋白濃度測定儀(美國Thermo公司)測定標(biāo)本總RNA濃度和純度。miRNA表達(dá)譜測序在每個(gè)標(biāo)本總RNA的3′端和5′端添加RNA 接頭，PCR富集8% PAGE膠片段分選，根據(jù)Qubit定量結(jié)果，按數(shù)據(jù)比例混合文庫，進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增，簇生長，在Illumina測序平臺(tái)(美國Illumina公司)進(jìn)行 2×150 bp測序。計(jì)算兩組樣品間各miRNA 的差異倍數(shù)，把當(dāng)倍值設(shè)定1.5倍作為區(qū)別兩組間差異表達(dá)閾值，篩選當(dāng)倍比值>2.0且P<0.05的差異性miRNA。測序過程由上海英拜生物科技有限公司完成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)顯著差異表達(dá)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證。通過TargetScan、miRDB、miRanda靶基因預(yù)測軟件，對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測。應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)預(yù)測的靶基因進(jìn)行GO功能富集分析。利用超幾何分布方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算出最為顯著的功能，并以P<0.05作為顯著富集基因的閾值。

2 結(jié) 果

2.1miRNA 表達(dá)譜結(jié)果通過高通量測序 成功構(gòu)建NAFLD組和對(duì)照組血清外泌體源性miRNA 表達(dá)譜，共篩選出表達(dá)差異較高(>1.5倍)的已知miRNA30種，見表1。其中5種miRNA(miR-122-5p，miR-3591-3p，miR-335-5p，let-7g-3p和miR-27a-5p)較對(duì)照組差異表達(dá)且顯著升高2.0倍以上，4種miRNA(miR-6753-3p，miR-129-2-3p，miR-6760-5p，miR-6516)較對(duì)照組差異表達(dá)且顯著降低2.0倍以上，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

2.2顯著差異表達(dá)miRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證 為驗(yàn)證高通量測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取3個(gè)miRNA(miR-122-5p、miR-335-5p、miR-27a-5p)在兩組標(biāo)本中進(jìn)行驗(yàn)證，兩組標(biāo)本中miRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果與高通量測序結(jié)果一致，見圖1。

2.3預(yù)測的靶基因及其GO功能富集分析 預(yù)測的差異表達(dá)miRNA的靶基因的生物學(xué)功能比較廣泛，包括葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、肝臟發(fā)育。大多數(shù)顯著富集的GO過程集中于調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、肝臟發(fā)育等病理生理功能，見表3。以P<0.05為顯著富集基因的閾值。

表1 30種差異表達(dá)的miRNA

表2 NAFLD組較對(duì)照組顯著差異表達(dá)的miRNA

圖1 miR-122-5p、miR-335-5p、miR-27a-5p在不同組別的表達(dá)驗(yàn)證

表3 差異表達(dá)的miRNA預(yù)測的靶基因GO功能富集分析

3 討 論

青少年NAFLD發(fā)病率較高，達(dá)3%～10%，成年后并發(fā)癥較多，如肝硬化、2型糖尿病、代謝綜合征和心血管疾病等。青少年NAFLD發(fā)生機(jī)制尚不明確，“多次打擊”學(xué)說被大多數(shù)學(xué)者推薦[9]，包括高胰島素血癥和胰島素抵抗引起單純肝臟細(xì)胞脂肪變性，游離脂肪酸脂毒性作用、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等激活相關(guān)炎性細(xì)胞因子致肝細(xì)胞壞死，引起非酒精性脂肪性肝炎，激活肝星狀細(xì)胞合成大量細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)一步發(fā)生肝纖維化。miRNAs作為一種基因表達(dá)的調(diào)控因子，在肥胖、NAFLD、動(dòng)脈粥樣硬化和糖尿病等代謝疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，在肝臟疾病中作用更為明顯。已有眾多研究提示miRNAs 參與NAFLD病理生理的調(diào)控[10-11]，主要表現(xiàn)在脂肪細(xì)胞分化、肝臟脂肪酸和膽固醇代謝、胰島素抵抗、線粒體損傷等過程的調(diào)控。外泌體是一種細(xì)胞特殊小分子如miRNA的運(yùn)輸載體，肝臟細(xì)胞既可釋放外泌體，又是肝臟內(nèi)源性外泌體和其他器官細(xì)胞來源的外泌體作用的靶細(xì)胞。

miR-122是肝臟中表達(dá)量最豐富的miRNA，參與三酰甘油、膽固醇、游離脂肪酸的代謝。普遍認(rèn)為，miR-122與脂肪肝發(fā)病密切相關(guān)。本項(xiàng)目中筆者發(fā)現(xiàn)NAFLD患者血清外泌體源性miR-122-5p表達(dá)顯著增加。SALVOZA等[12]也發(fā)現(xiàn)NAFLD 患者的血清miR-122水平明顯高于健康對(duì)照組，而CSAK等[13]在飲食誘導(dǎo)的脂肪性肝炎大鼠中發(fā)現(xiàn)肝臟組織miR-122降低。因此，本研究推測肝臟組織miR-122表達(dá)降低參與了非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)肝纖維化的發(fā)生，其他組織分泌miR-122，并由外泌體攜帶至肝臟代償以保護(hù)肝臟。

miR-27是一種與脂質(zhì)代謝相關(guān)性最高的miRNA。有研究表明在人類和嚙齒類動(dòng)物脂肪細(xì)胞脂質(zhì)代謝中miR-27a過度表達(dá)可以加速脂肪釋放、三酰甘油水解，釋放出更多的游離脂肪酸，肝臟游離脂肪酸的超負(fù)荷是導(dǎo)致脂肪肝變性的重要原因[14]。研究證實(shí)miR-27基因家族在成脂分化過程中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-27會(huì)特異性抑制脂肪細(xì)胞的形成，而不影響肌源性分化[15]。此外，還發(fā)現(xiàn)miR-27可與過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)結(jié)合并影響其表達(dá)，調(diào)節(jié)脂質(zhì)分解以及合成代謝效率，miR-27a可能在肥胖NAFLD的病理發(fā)展中發(fā)揮作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-335在肥胖小鼠的白色脂肪組織和肝臟中表達(dá)上調(diào)，這可能與肥胖的病理生理機(jī)制相關(guān)[16]。在飲食誘導(dǎo)小鼠NAFLD的肝臟中發(fā)現(xiàn)miR-335-5p上調(diào)，而miR-21有所降低，這些miR-335的靶標(biāo)分子在調(diào)控脂類和碳水化合物代謝、信號(hào)傳導(dǎo)以及凋亡中都有重要作用，這對(duì)飲食引起肥胖、脂肪肝、肝纖維化甚至肝硬化的發(fā)生、發(fā)展具有重要作用[17]。

綜上所述，青少年NAFLD患者血清差異性表達(dá)的miRNA可能與疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，但仍需深入研究，miR-122-5p、miR-335-5p、miR-27a-5p可能可以作為肥胖NAFLD早期診斷的標(biāo)記物。