應(yīng)用回歸方程設(shè)置CLIA法檢測(cè)梅毒抗體的灰區(qū)范圍

張志遠(yuǎn)，羅夏菲，劉榮靜△

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.產(chǎn)科，廣東廣州 510260

梅毒是由梅毒螺旋體引起的一種慢性全身性傳播疾病，在我國(guó)屬于法定乙類傳染病，血清學(xué)試驗(yàn)是臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)梅毒的常用方法。化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)法憑借其靈敏度高、特異性強(qiáng)、結(jié)果判定客觀、適于自動(dòng)化檢測(cè)等諸多優(yōu)點(diǎn)，被臨床廣泛應(yīng)用于梅毒抗體的檢測(cè)[1-2]。但是作為一種篩查方法，其檢測(cè)結(jié)果中有一定比例的假陽(yáng)性，臨床實(shí)驗(yàn)室將這些假陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告出去，可能會(huì)讓臨床醫(yī)生產(chǎn)生疑惑，或者給受檢者帶來(lái)一些麻煩和心理傷害，甚至?xí)疳t(yī)患糾紛。為了減少因試驗(yàn)假陽(yáng)性造成的誤診，提高檢驗(yàn)報(bào)告準(zhǔn)確性，可以將測(cè)定中處于臨界值(Cut-off值)附近、臨床意義可疑的一部分結(jié)果，設(shè)置為檢測(cè)的“灰區(qū)范圍”，達(dá)到提醒臨床醫(yī)生注意和重視的目的。筆者對(duì)本實(shí)驗(yàn)室使用CLIA法檢出的878例梅毒抗體陽(yáng)性血清標(biāo)本，采用梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)(TPPA)為確證試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)，通過(guò)研究CLIA法S/CO值與檢測(cè)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值的相關(guān)關(guān)系，獲得兩者間的關(guān)系模型及回歸方程，并以此設(shè)置本實(shí)驗(yàn)室CLIA法檢測(cè)梅毒抗體的灰區(qū)范圍，現(xiàn)將方法和結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年1-12月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科使用CLIA法檢測(cè)梅毒抗體結(jié)果為陽(yáng)性(S/CO≥1)的血清標(biāo)本，共計(jì)878例。

1.2儀器與試劑 Architect i2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及原裝配套試劑，來(lái)自美國(guó)雅培公司；TPPA試劑盒(內(nèi)含溶解液、血清稀釋液、致敏粒子、未致敏粒子、陽(yáng)性對(duì)照血清)，為日本富士瑞必歐株式會(huì)社產(chǎn)品；質(zhì)控品來(lái)自廣東省臨床檢驗(yàn)中心。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本處理 干燥管抽取靜脈血液3～5 mL，待血液自行凝固后3 500 r/min離心5 min，分離血清待檢。

1.3.2CLIA的檢測(cè)流程及結(jié)果判定 (1)對(duì)Architect i2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀進(jìn)行常規(guī)維護(hù)和保養(yǎng)；(2)項(xiàng)目質(zhì)控監(jiān)測(cè)，質(zhì)控合格后開(kāi)始標(biāo)本的檢測(cè)；(3)記錄每個(gè)標(biāo)本測(cè)得的S/CO值。結(jié)果判定：S/CO值≥1判定為梅毒抗體陽(yáng)性，S/CO值<1判定為梅毒抗體陰性。

1.3.3TPPA的檢測(cè)流程及結(jié)果判定 (1)用微量加樣器將血清稀釋液加入微量反應(yīng)板中，第1孔100 μL，第2孔至第4孔各25 μL；(2)吸取25 μL標(biāo)本至第1孔中，吹打混合均勻，然后吸出25 μL加入第2孔，以2n的方式稀釋至第4孔；(3)向第3孔中滴入25 μL未致敏粒子，在第4孔中滴入25 μL致敏粒子；(4)用振蕩混勻器以不會(huì)導(dǎo)致微量反應(yīng)板內(nèi)容物濺出的強(qiáng)度振蕩混勻30 s，加蓋后于室溫(15～30 ℃)水平靜置。2 h后，觀察其反應(yīng)圖像并進(jìn)行結(jié)果判斷和記錄。結(jié)果判定：觀察微量反應(yīng)板第3、4孔中粒子形成的反應(yīng)圖像，參照表1進(jìn)行判斷。

表1 TPPA反應(yīng)圖像判定表

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 對(duì)878例血清標(biāo)本經(jīng)CLIA法檢測(cè)獲得的S/CO值，按照S/CO≥值1～<3、3～<5、5～<7、7～<9、9～<11、≥11將標(biāo)本分為6組，以TPPA結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算出各組CLIA法檢測(cè)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值；對(duì)各組的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值與S/CO值的關(guān)系進(jìn)行曲線擬合，分析最適合的曲線模型并建立回歸方程。

1.5檢驗(yàn)體系灰區(qū)的設(shè)置 為了使灰區(qū)范圍以外的陽(yáng)性結(jié)果有95%以上的可信度，根據(jù)曲線擬合建立的回歸方程，計(jì)算出CLIA法檢測(cè)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值達(dá)到95%時(shí)的S/CO值，設(shè)為本實(shí)驗(yàn)室CLIA法檢測(cè)血清梅毒抗體灰區(qū)范圍的上限，以S/CO值=1設(shè)置為灰區(qū)的下限。

2 結(jié) 果

2.1TPPA法對(duì)878例CLIA法檢測(cè)梅毒抗體呈陽(yáng)性的血清標(biāo)本確認(rèn)結(jié)果 878例標(biāo)本經(jīng)TPPA法檢測(cè)，確認(rèn)陽(yáng)性(包含弱陽(yáng)性)標(biāo)本779例，陰性標(biāo)本99例。CLIA法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為88.72%。如表2所示，S/CO值在1～<3、3～<5、5～<7、7～<9、9～<11、≥11的6個(gè)組的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為50.77%、79.28%、89.28%、97.80%、98.57%、100.00%。

表2 S/CO值在1～<3、3～<5、5～<7、7～<9、9～<11、≥11的6組標(biāo)本TPPA確認(rèn)結(jié)果

2.2CLIA法檢測(cè)血清梅毒抗體S/CO值與檢測(cè)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值的相關(guān)性分析 使用SPSS20.0軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線估計(jì)，表3是11種曲線模型的擬合結(jié)果，其中S型模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，決定系數(shù)R2=0.997最高，故為最適合的模型。建立的S型模型的回歸方程：Y=e-1.692/X+0.174，其中自變量X為S/CO值，因變量Y為陽(yáng)性預(yù)測(cè)值。圖1為S型模型的擬合曲線，可見(jiàn)效果比較滿意。

表3 表2數(shù)據(jù)11種模型曲線擬合結(jié)果

圖1 表2數(shù)據(jù)S型模型的擬合曲線

2.3灰區(qū)范圍設(shè)置 根據(jù)S型曲線回歸方程Y=e-1.692/X+0.174，當(dāng)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值Y=0.95時(shí)，X=7.52。即S/CO=7.52時(shí)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值可達(dá)95%。因此可設(shè)置檢驗(yàn)體系的灰區(qū)為1≤S/CO值≤7.52。

3 討 論

抗體檢測(cè)的假陽(yáng)性問(wèn)題是長(zhǎng)期以來(lái)梅毒研究者廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)之一[3]。近年來(lái)，盡管全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀和檢測(cè)試劑的性能都取得了很大提升，但CLIA法檢測(cè)梅毒抗體假陽(yáng)性問(wèn)題依然沒(méi)有得到令臨床滿意的解決方案。因此，世界各國(guó)和地區(qū)都采用了多元化的梅毒血清學(xué)診斷策略。美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心、加拿大梅毒實(shí)驗(yàn)室工作小組和中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)出臺(tái)的相關(guān)指南和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，都推薦了使用TPPA對(duì)CLIA法檢測(cè)呈陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行復(fù)查。多項(xiàng)研究也證明TPPA有較高的靈敏度和特異度，可作為梅毒抗體檢測(cè)的確證試驗(yàn)。

在本研究中，878份CLIA法檢測(cè)為陽(yáng)性的標(biāo)本，經(jīng)TPPA檢測(cè)后確認(rèn)有99例實(shí)際應(yīng)為陰性，即有11.28%的標(biāo)本經(jīng)CLIA法檢測(cè)結(jié)果呈假陽(yáng)性。分析其原因：(1)CLIA法檢測(cè)梅毒抗體的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)是將標(biāo)本中存在的梅毒抗體經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)后產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號(hào)與預(yù)先校準(zhǔn)確定的Cut-off信號(hào)進(jìn)行比較，根據(jù)S/CO值是否≥1確定標(biāo)本是否存在梅毒抗體。為了保證檢測(cè)體系有較高的靈敏度，儀器在設(shè)定Cut-off信號(hào)時(shí)會(huì)將其設(shè)定得偏低，相應(yīng)地會(huì)使得檢測(cè)結(jié)果S/CO值偏高，導(dǎo)致部分結(jié)果為假陽(yáng)性。(2)標(biāo)本來(lái)源。相關(guān)研究表明，惡性腫瘤、心血管疾病、肝炎、自身免疫性疾病、血液病等疾病患者的血清中可能含有某些治療性抗體、類脂嗜異性抗體、自身抗糖尿病抗體、類風(fēng)濕因子、甲胎蛋白等[4-5]，這些物質(zhì)能夠與試劑中的抗原成分非特異性結(jié)合，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性。另外，年齡也是假陽(yáng)性產(chǎn)生的一個(gè)重要因素，一些研究表明老年人梅毒抗體測(cè)定的假陽(yáng)性率偏高[6-7]，且陽(yáng)性率隨年齡增大呈階梯性增高[8-10]，可能是因?yàn)槔夏耆松眢w功能衰退，能夠產(chǎn)生一些干擾化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的異常蛋白質(zhì)[11]。在本研究中，99例假陽(yáng)性標(biāo)本中，來(lái)源是60歲以上的患者占45.5%。

對(duì)CLIA法檢測(cè)梅毒抗體的檢測(cè)體系進(jìn)行灰區(qū)的設(shè)置，可以提高檢測(cè)報(bào)告的準(zhǔn)確性和嚴(yán)謹(jǐn)性，并能夠有針對(duì)性地對(duì)標(biāo)本進(jìn)行復(fù)查，提高檢測(cè)效率，節(jié)省成本?；覅^(qū)的設(shè)置方法有多種，例如舒豐等[12]應(yīng)用ROC曲線對(duì)AutoLumo A2000化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)梅毒抗體進(jìn)行了灰區(qū)設(shè)置；許曉峰等[13]認(rèn)為，使用CLIA法檢測(cè)梅毒抗體時(shí)，對(duì)于陽(yáng)性預(yù)測(cè)值大于95%的檢測(cè)結(jié)果，可以不必進(jìn)行確診試驗(yàn)以減少工作量。然而根據(jù)表2發(fā)現(xiàn)，CLIA法檢測(cè)梅毒抗體的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值隨S/CO值增大而升高，S/CO值與陽(yáng)性預(yù)測(cè)值之間存在某種相關(guān)關(guān)系。因此本研究采用曲線擬合的方法，確認(rèn)了S/CO值與陽(yáng)性預(yù)測(cè)值的數(shù)量關(guān)系呈S型，并獲得了兩者的回歸方程。通過(guò)回歸方程，不僅可以計(jì)算出陽(yáng)性預(yù)測(cè)值達(dá)到95%時(shí)的S/CO值，將其作為CLIA法灰區(qū)的上限，并且可以根據(jù)任何一個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本的S/CO值，計(jì)算它為真陽(yáng)性的概率，從某種程度上講這比設(shè)置檢驗(yàn)方法的灰區(qū)更有意義。國(guó)內(nèi)有研究顯示，CLIA法檢測(cè)梅毒抗體的靈敏度和陰性預(yù)測(cè)值均為100%[14]，表明使用CLIA法檢測(cè)梅毒抗體幾乎可以排除假陰性情況的出現(xiàn)。因此，本研究可以將S/CO值=1作為灰區(qū)的下限，并將灰區(qū)范圍最終設(shè)置為1≤S/CO值≤7.52。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2019年本實(shí)驗(yàn)室梅毒抗體檢測(cè)處于灰區(qū)范圍外的陽(yáng)性標(biāo)本約為530例，若與臨床醫(yī)生加強(qiáng)溝通，注重流行病學(xué)調(diào)查，則可為這些患者節(jié)省復(fù)查費(fèi)用，節(jié)約醫(yī)療資源。對(duì)于處于灰區(qū)范圍內(nèi)，尤其是非孕產(chǎn)婦、老年人、腫瘤及血液病患者等，應(yīng)該進(jìn)行TPPA等確證試驗(yàn)進(jìn)行復(fù)查確認(rèn)，以提高診斷準(zhǔn)確率。

需要說(shuō)明的是，入選本研究的S/CO值≥11的標(biāo)本，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值達(dá)到了100%，并不代表不會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性的情況。但是這并不影響S/CO值與陽(yáng)性預(yù)測(cè)值關(guān)系方程的建立，因?yàn)镾/CO值≥11的分組其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值非常接近100%，將其應(yīng)用于曲線估計(jì)模型時(shí)的意義并不大，也不會(huì)影響回歸方程的系數(shù)。本研究在進(jìn)行曲線擬合時(shí)使用了表2的前5組數(shù)據(jù)，并以每組S/CO值范圍的中位數(shù)作為該組的檢測(cè)陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，這可能會(huì)使曲線模型的估計(jì)及回歸方程的系數(shù)產(chǎn)生一定偏差。