磷脂酰絲氨酸制備關(guān)鍵技術(shù)研究

磷脂酰絲氨酸(PS)是一種新資源食品，在制藥和功能食品領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，能夠改善老年人的阿爾茨海默病，具有保護神經(jīng)和抗氧化作用，還具有提高記憶力、緩解緊張、減輕抑郁等功效，為“腦專一性營養(yǎng)物質(zhì)”。

PS 的制備方法主要有溶劑提取法、化學合成法和酶轉(zhuǎn)化法。酶轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)易控、高效簡單等優(yōu)勢，逐漸得到廣泛的研究及應(yīng)用。 如，江南大學江波教授團隊（2020）采用硫酸銨分級沉淀、離子交換層析和凝膠層析對廣島鏈霉菌SK43.001-11 發(fā)酵液中的磷脂酶D 進行純化， 并對雙液相體系中酶法制備磷脂酰絲氨酸的工藝進行研究。 結(jié)果表明：純化后，磷脂酶D 比酶活提高到49.48 U/mg，是粗酶液的54.37 倍，回收率為32.31%。磷脂酶D 雙液相催化制備磷脂酰絲氨酸的最佳條件為：有機相為乙醚，pH 6.5，反應(yīng)溫度30 ℃，L-絲氨酸與磷脂酰膽堿質(zhì)量比15∶1，有機相與水相體積比1∶1，反應(yīng)時間2.5 h。 在最佳條件下，磷脂酰絲氨酸生成率達到74.8%。Liu 等(2014)利用基因工程和分子技術(shù)手段將PLD 成功展示在酵母表面，在進行酶轉(zhuǎn)化實驗中，可以將67.5%的磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化為PS。中國專利CN201710554483.3 提供了一種催化合成磷脂酰絲氨酸的生物酶及其制備方法和應(yīng)用，首先構(gòu)建生物酶的基因工程菌株，將全基因合成的生物酶基因片段，利用限制性內(nèi)切酶SalⅠ線性化重組質(zhì)粒，用于表達生物酶，經(jīng)過進一步發(fā)酵獲得催化合成磷脂酰絲氨酸的生物酶，利用磷脂酰絲氨酸合成酶高度專一性，催化卵磷脂和絲氨酸制備磷脂酰絲氨酸，轉(zhuǎn)化率達到80%。CN201610054776.0 涉及一株谷氨酸棒桿菌及其過量合成磷脂酰絲氨酸的方法。其提供了一株谷氨酸棒桿菌基因工程菌，該菌株是將谷氨酸棒桿菌宿主細胞中表達L-絲氨酸脫氨酶的sdaA 基因進行敲除， 并串聯(lián)表達磷脂酰絲氨酸合成酶的表達基因pssA 基因、3-磷酸甘油酸脫氫酶的突變基因serAΔ197 基因和CDP-甘油二酯合成酶的表達基因cdsA 基因而獲得， 該菌株經(jīng)發(fā)酵法制備磷脂酰絲氨酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高17%～39%。CN201110382207.6 提供一種酶法制備磷脂酰絲氨酸的方法。 大豆磷脂酰膽堿溶于有機溶劑中，加入一定量溶有2%～8%的絲氨酸水溶液，調(diào)節(jié)pH 5.6，在磷脂酶D 催化下進行堿基交換，經(jīng)過4 h 反應(yīng)，大豆磷脂酰膽堿轉(zhuǎn)化為磷脂酰絲氨酸，反應(yīng)物通過水洗有機相，經(jīng)脫水脫溶后，用丙酮充分洗滌， 分離出丙酮不溶物， 干燥得產(chǎn)品。 經(jīng)過HPLC 測定， 產(chǎn)品磷脂酰絲氨酸的含量大于40%。CN201310508296.3 提供一種制備磷脂酰絲氨酸的方法，包括以下步驟：將磷脂酰膽堿或含有磷脂酰膽堿的天然磷脂與吐溫-80、L-絲氨酸、氯化鈣、緩沖溶液、磷脂酶D 混合，在35～45 ℃攪拌反應(yīng)8～10 h；反應(yīng)結(jié)束后反應(yīng)粗品析出并上浮，離心分離水相和反應(yīng)粗品，將分離得到的反應(yīng)粗品用水洗滌，并離心過濾；離心過濾后的反應(yīng)粗品加入無水乙醇浸泡，攪拌，再離心過濾；對離心過濾后產(chǎn)物真空干燥，即得磷脂酰絲氨酸產(chǎn)品。 CN201710498577.3 公開了一種利用固定化磷脂酶D 生產(chǎn)磷脂酰絲氨酸的方法，配制表面活性劑水溶液，室溫下邊攪拌邊滴加游離酶水溶液至澄清，得混合液；將混合液滴加至金屬離子鹽溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)0.5～2 h 后得固定化的酶溶液；離心，干燥得到固定化的磷脂酶催化劑；將溶于有機相中的卵磷脂、絲氨酸溶液與固定化酶進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，溫度0～40 ℃，時間1～24 h。 CN201910996555.9 提供了一種重組磷脂酶D， 是通過大腸桿菌表面展示技術(shù)高通量篩選技術(shù)和DNA 基因重組技術(shù)篩選獲得新型的PLD。CN201710462045.4 涉及一種連續(xù)高效酶轉(zhuǎn)化合成食品用磷脂酰絲氨酸的方法。 通過將磷脂酶D 負載于高吸附氣凝膠多孔材料，從而提高磷脂酶D 的反應(yīng)活性和轉(zhuǎn)化催化效能，使得在短時間內(nèi)完成磷脂酰絲氨酸的催化合成反應(yīng)；進一步通過高壓下在窄流道中進行有機相、水相的反應(yīng)，不但反應(yīng)效率高，而且窄流到流體均化反應(yīng)，反應(yīng)均勻，易于穩(wěn)定控制。 CN201410279967.8 涉及一種利用高活力磷脂酶A2 和高活力磷脂酶D 催化制備sn-2 位為二十二碳六烯酸的磷脂酰絲氨酸(2-DHA-PS)的方法。 通過重疊PCR 技術(shù)實現(xiàn)定向進化，獲得高活力磷脂酶A2 和高活力磷脂酶D；利用高活力磷脂酶A2 和高活力磷脂酶D 催化制備2-DHA-PS，首先磷脂酰膽堿和絲氨酸在高活力磷脂酶D 的催化下生成磷脂酰絲氨酸，然后磷脂酰絲氨酸再與二十二碳六烯酸在高活力磷脂酶A2 的催化下生成2-DHA-PS。

目前國內(nèi)外研究者主要集中在PS 的提取、生物合成及應(yīng)用等方面開展研究，而PS 的產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用還處于發(fā)展初期。 未來隨著綠色生物酶法技術(shù)的發(fā)展、PS 多種生理保健功能的進一步開發(fā)，PS 將在食品、藥品領(lǐng)域擁有更廣闊的前景。