阿膠及其制品質(zhì)量檢測方法研究進(jìn)展

林曉伊 - 李 亙 王馮宇 - 陳 毓

(杭州醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053)

阿膠又名驢皮膠、盆覆膠、傅致膠，是由馬科動物驢的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠[1]，含有豐富的糖類、必需氨基酸、多不飽和脂肪酸[2]、脂質(zhì)及人體所必需的多種微量元素[3]，具有益智健腦、改善皮膚[4]、補(bǔ)血止血、強(qiáng)抗氧化性[5]和提高免疫[6]等功效，既可作為保健品食用，也可用于藥膳中達(dá)到治療與營養(yǎng)雙重目的[7]，因而身價倍增。

隨著消費(fèi)升級，中國老齡人口數(shù)量逐步增多，阿膠需求量不斷增加，而驢皮原料供不應(yīng)求[8]。據(jù)《2021年中國阿膠行業(yè)分析報告—市場競爭現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢分析》[9]顯示，中國阿膠行業(yè)產(chǎn)量約為6 000 t，需要驢皮約480萬張，而國內(nèi)可供應(yīng)的驢皮不足200萬張，這促使部分生產(chǎn)企業(yè)從海外謀取驢皮，使得驢皮原料成本大大增加。而不法分子為謀高利，通過縮減驢皮使用量或者使用豬皮、馬皮等其他動物皮代替驢皮來制造假劣阿膠[10]，不利于行業(yè)良性發(fā)展。

研究[11]表明，不同動物皮熬制的膠有著與阿膠不同甚至相悖的功效，食用假冒劣質(zhì)的阿膠存在安全隱患。由于阿膠制作工藝復(fù)雜[12]，原料結(jié)構(gòu)破壞、成分改變致使阿膠的質(zhì)量鑒定變得相對困難[13]。因此，如何準(zhǔn)確測定阿膠及其各種衍生制品的驢皮成分及如何對產(chǎn)品中動物源性成分進(jìn)行檢測一直是阿膠鑒定研究過程中的難點(diǎn)與重點(diǎn)。

目前，阿膠及其制品的主要檢測方法有紅外光譜法、蛋白質(zhì)電泳法、高效液相色譜法、液相色譜—質(zhì)譜法[14]、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、DNA條形碼技術(shù)、低場核磁技術(shù)[15]等。其中，液相色譜—質(zhì)譜法是中國測定阿膠制品中氨基酸含量的標(biāo)準(zhǔn)方法，光譜法主要應(yīng)用于快速檢測，而多重PCR、熒光實(shí)時定量PCR、DNA條形碼技術(shù)等可通過靶標(biāo)物質(zhì)的鑒別進(jìn)行物種溯源，為阿膠檢測提供了新的方向；電泳法、高效液相色譜法有強(qiáng)大的分離分析能力，可對摻假的阿膠制品進(jìn)行進(jìn)一步的定量。文章擬綜述近年來常見阿膠制品的各種質(zhì)量檢測方法，旨在為高效檢驗(yàn)阿膠質(zhì)量、完善阿膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、加強(qiáng)阿膠市場監(jiān)控提供參考。

1 阿膠及其制品質(zhì)量檢驗(yàn)

1.1 紅外光譜法

紅外光譜法以無損、快速的檢測優(yōu)點(diǎn)在阿膠快速檢測領(lǐng)域有著較廣應(yīng)用[16]。張仁霞等[17]運(yùn)用傅立葉變換紅外光譜(FTIR)法，對加入了KBr粉末的樣品供試片進(jìn)行掃描，在波數(shù)為4 000～400 cm-1的范圍內(nèi)對阿膠配方顆粒進(jìn)行成分分析。其特定成分在特定區(qū)域具有強(qiáng)而復(fù)雜的吸收峰群，通過對比吸收峰特征的差異，可有效鑒別出各種阿膠樣品的輔料成分；高鳳偉等[18]采用近紅外光譜技術(shù)結(jié)合Fisher模型，在波數(shù)為12 820～4 000 cm-1的范圍內(nèi)對豬皮明膠、牛皮明膠和驢皮明膠進(jìn)行了主成分(PCA)分析，其預(yù)測識別率可達(dá)100%，可用于驢皮阿膠的快速鑒定；Li等[19]采用Antars II FT-NIR光譜儀對福牌阿膠樣品進(jìn)行檢測，可有效分析阿膠存放年限與其中營養(yǎng)物質(zhì)含量的相關(guān)性，但在定性和定量方面有待提升。

在紅外光譜測定中，波數(shù)范圍在12 500～4 000 cm-1的近紅外(NIR)區(qū)以及波數(shù)范圍在4 000～400 cm-1的中紅外(MIR)區(qū)均可應(yīng)用于食品的檢測分析，其中MIR比NIR有著更加清楚可辨別的光譜峰值，因此相比近紅外光譜技術(shù)，傅立葉變換紅外光譜法具有更優(yōu)的鑒別能力。傅立葉變換紅外光譜法檢測速度快，但檢測靈敏度低，對于驢皮成分含量較低的阿膠制品難以檢測，不適合做痕量分析；而近紅外光譜法雖然需要大量已知的代表性樣品作模型，但其檢測儀器便攜且成本較低，作為小批量樣品現(xiàn)場快速檢測分析方法較為普遍。

1.2 蛋白質(zhì)電泳法

阿膠中含有核心蛋白聚糖、雙糖鏈蛋白聚糖等富含亮氨酸的活性蛋白[20]，其中帶電荷的成分(膠原蛋白及其水解產(chǎn)物)能夠在電場的作用下泳動，因此可采用電泳法進(jìn)行膠類藥材的鑒別。付英杰等[21]基于Tricine-SDS-PAGE法，采用硫酸銨鹽析法對樣品進(jìn)行純化處理，并利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和木瓜蛋白酶4種不同的蛋白酶分別對樣品進(jìn)行酶解處理，通過對酶解液電泳所得電泳條帶經(jīng)銀染色后對比分析，最后對不同膠類藥材按氨基酸排列順序進(jìn)行有效分類，發(fā)現(xiàn)硫酸銨鹽析法處理樣品所得條帶不清晰，僅用脫脂棉過濾便可進(jìn)行樣品純化。而對比不同的蛋白酶處理樣品時發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶會干擾檢查結(jié)果，不建議用于阿膠測定。由于各種動物膠氨基酸排列順序不同，其酶解產(chǎn)物的電泳圖也大不相同，可提示膠類藥材種類的差異；李楠等[22]利用Tricine-SDS-PAGE法，制備了聚丙烯酰胺凝膠對3種不同膠類藥材進(jìn)行分離，并用考馬斯亮藍(lán)染色后觀察電泳圖譜，以實(shí)現(xiàn)對蛋白質(zhì)在膠類藥材加工過程中的動態(tài)變化規(guī)律的分析。結(jié)果顯示，驢皮、龜甲、鹿角的蛋白質(zhì)在10～250 kDa區(qū)域內(nèi)均有分布，其中驢皮樣品的條帶數(shù)較多，其中有3條較為清晰的條帶可與其他膠類藥材進(jìn)行區(qū)別，而不同加工程度的膠類藥材中的蛋白質(zhì)降解程度不同，僅可通過蛋白質(zhì)在泳道中呈現(xiàn)的彌散現(xiàn)象初步判定。

阿膠中蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量為15～250 kDa，經(jīng)過酶解處理后易形成小分子多肽，在對電泳產(chǎn)物的染色上，考馬斯亮藍(lán)染色法難以清楚染色，銀染色法相對更好。在Tricine-SDS-PAGE法中，一些相對分子質(zhì)量低于10 kDa 的小分子多肽在電泳分析的過程中容易丟失，分辨率較低。且Tricine-SDS-PAGE法無法清晰區(qū)分較為相近的特征條帶，只能作為膠類藥材粗略分類判讀的依據(jù)，如將阿膠與龜甲膠、鹿角膠等進(jìn)行區(qū)分，然而該技術(shù)無法準(zhǔn)確辨別出阿膠制品是否存在摻偽現(xiàn)象?？偟膩碚f，電泳技術(shù)在對阿膠原料基源鑒別上還尚缺乏論證，目前在阿膠檢測方面往往是作為其他檢測方法的輔助手段。

1.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法在阿膠及其制品質(zhì)量檢測中應(yīng)用較為普遍，主要是對于阿膠制品中含有的4種主要氨基酸成分(L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸)進(jìn)行分析鑒定[23]，以作為阿膠真?zhèn)蝺?yōu)劣判定的主要依據(jù)。另外，該法還可以對阿膠中核苷類化合物含量進(jìn)行對比分析[24]。

Xie等[25]采用高亞膠束液相色譜梯度洗脫法，以十二烷基硫酸鈉溶液—乙酸銨作為流動相A，乙腈作為流動相B有效分離出阿膠中的氨基酸，并對梯度洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，利用氨基酸含量的差異進(jìn)行阿膠的區(qū)分；汪明志等[26]將異硫氰酸苯酯作為衍生劑，采用柱前衍生—反相高效液相色譜法分析阿膠補(bǔ)血口服液中主要氨基酸含量。該方法雖會受阿膠組成成分的影響，但其氨基酸的平均回收率高，操作簡便，對阿膠中氨基酸的檢測分析有重大參考價值。

對于高效液相色譜法分離測定氨基酸來說，流動相的組成及配比對氨基酸的分離效果有著較大的影響，優(yōu)化后的亞膠束液相色譜法可實(shí)現(xiàn)對混合物快速準(zhǔn)確分離，對于分析阿膠這種成分復(fù)雜的制品具有較好的應(yīng)用價值，但分析時間相對較長。經(jīng)典的氨基酸分析方法是采用柱后衍生法，隨著反相柱柱前衍生化法的產(chǎn)生和發(fā)展，免去的柱后衍生化法的復(fù)雜儀器裝備，柱前衍生—反相高效液相色譜法以異硫氰酸苯酯作為衍生劑，可形成較為穩(wěn)定的產(chǎn)物供測定用，使混合物更容易分離，具有較高的準(zhǔn)確性、靈敏度，但需要注意衍生化試劑峰對結(jié)果的影響，進(jìn)行區(qū)分辨別。

1.4 超高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法

隨著相關(guān)物種特異性肽的發(fā)現(xiàn)及聯(lián)用技術(shù)的日趨成熟，膠類制品的真?zhèn)舞b別也逐步趨向于儀器聯(lián)用技術(shù)，對動物膠制品的質(zhì)量評價有重大意義[27]。王超等[28]采用UPLC-MS法對市售阿膠保健食品中4種主要氨基酸成分進(jìn)行測定，結(jié)果顯示阿膠中的阿膠主成分與阿膠中藥材相近，且對于部分保健品中的阿膠含量難以測定，表明該法雖檢測靈敏度高，但區(qū)分度較低，尚缺乏專項(xiàng)測定能力；Cheng等[29]采用超高效液相色譜—四極—飛行時間質(zhì)譜法結(jié)合了胰酶消化樣品進(jìn)行PCA分析，鑒定PCA載荷圖給出的標(biāo)記肽對5種膠類藥材進(jìn)行了有效分類。該方法有較強(qiáng)的專屬性，可對常用明膠的變異鑒別提供有效的技術(shù)支持。

總的來說，色譜—質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用比單一的色譜技術(shù)進(jìn)一步提高了靈敏度和準(zhǔn)確性，專屬性強(qiáng)[30]，能更好地對成分進(jìn)行定量，但該類方法儀器價格高昂，難以推廣應(yīng)用。其中超高效液相色譜—四極—飛行時間質(zhì)譜法易受膠類制品中的輔料的影響，容易對檢測結(jié)果造成偏差，還需改進(jìn)樣品前處理技術(shù)，通過富集蛋白質(zhì)以減少輔料影響。

1.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

目前，在阿膠制品中DNA提取及物種源性分析方面主要依靠分子生物學(xué)手段。張全芳等[31]基于阿膠中的DNA因加工工藝而發(fā)生降解的變化規(guī)律，建立了用SDS-蛋白酶K結(jié)合Chelex-100法對市面上所售的阿膠制品如阿膠補(bǔ)血口服液進(jìn)行微量DNA的提取，并用瓊脂糖凝膠電泳法對阿膠DNA提取方法進(jìn)行成功驗(yàn)證，為阿膠及其制品DNA提取困難開辟新道路。但對于摻假的阿膠樣品來說，能從中檢測出驢DNA并無法說明阿膠中是否含有其他動物的皮膠，因此，同時對阿膠中所含有的DNA進(jìn)行種源的分析也是阿膠鑒定的關(guān)鍵所在[32]。諶陽等[33]采用多重PCR，基于核質(zhì)遺傳原理進(jìn)行皮張種源性分析，特異性高，可有效排除樣品中非目的成分的干擾。

Zhang等[34]選擇了高特異性、高敏感性的探針/引物對多種阿膠制品中驢的DNA進(jìn)行分析，并同時尋找出可能進(jìn)行摻雜的其他動物源DNA，如馬、牛、豬等；Liu等[35]采用了含有指定含量的驢皮、豬皮混合物來建立體系，并基于單拷貝內(nèi)膽核作為參考引物，使用實(shí)時熒光定量PCR法對阿膠樣品進(jìn)行檢測評價；趙云東等[36]提取、克隆市售阿膠制品中目的DNA片段，以重組質(zhì)粒pGMT-Equ66bp作為陽性對照，并將檢測結(jié)果與質(zhì)譜檢測結(jié)果作對比，建立了阿膠中動物源性DNA成分的定量檢測方法。

綜合來說，實(shí)時熒光定量PCR方法可在混合動物產(chǎn)品中特異地鑒定出驢皮并量化驢皮明膠的含量。TaqMan探針法在純度的鑒定上具有較大優(yōu)勢，可實(shí)時檢測，免去了對擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析，避免了后續(xù)分析操作對結(jié)果造成的影響，然而TaqMan探針法中所使用的探針設(shè)計較復(fù)雜，價格昂貴，檢測成本相對偏高。

1.6 DNA條形碼技術(shù)

DNA條形碼技術(shù)作為一種新的生物識別技術(shù)，常利用線粒體基因如細(xì)胞色素b基因、12S rDNA、16S rRNA等來鑒定動物源性[37]，可更加高效地對阿膠制品的成分進(jìn)行生物物種識別。目前用于鑒定動物皮張源性的條形碼技術(shù)通常使用680 bp的線粒體COI序列作為靶標(biāo)，結(jié)合PCR技術(shù)，可有效解決阿膠DNA數(shù)量少的檢測難題。其常用的通用引物序列是LCO1490(5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’)及LCO2198(5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’)[38]。

嚴(yán)華等[39]通過供試品處理、DNA提取、PCR擴(kuò)增線粒體COI上的目的片段、PCR產(chǎn)物的純化測序、序列拼接及進(jìn)行序列比對和遺傳距離分析等一系列流程，進(jìn)行阿膠原料的基源鑒別。該法將擴(kuò)增序列與BOLD數(shù)據(jù)庫、GenBank數(shù)據(jù)庫等進(jìn)行比對，能快速、準(zhǔn)確地檢測阿膠的原料來源，如能將其與數(shù)據(jù)庫結(jié)合，構(gòu)建起方便、可靠的信息溯源系統(tǒng)，便可實(shí)現(xiàn)阿膠制造流通過程中的監(jiān)管。但如何對樣品進(jìn)行處理、采取的引物濃度是多少、PCR程序如何設(shè)計等都還需要進(jìn)一步探索研究。

盡管DNA條形碼技術(shù)仍存在一些缺陷：如線粒體基因向核內(nèi)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致無法有效檢測、難依據(jù)單基因片段實(shí)現(xiàn)所有物種鑒定、相關(guān)數(shù)據(jù)庫不夠完善等，但對比傳統(tǒng)物種鑒定法，它采用數(shù)字化形式，利用有機(jī)體的殘片，減少經(jīng)驗(yàn)依賴，并能夠快速進(jìn)行阿膠信息的采集比對并加以應(yīng)用，現(xiàn)已在多數(shù)動植物中藥材中得以成功應(yīng)用[40]，而更多相關(guān)數(shù)據(jù)庫的創(chuàng)建擴(kuò)充對阿膠檢測也有著重要意義。

近期，Bohmann等[41]主張無需進(jìn)行任何計算的密集型預(yù)處理，就可將完整的核酸序列用于確認(rèn)生物身份(稱為“DNA-mark”)，這進(jìn)一步完善了以DNA為基礎(chǔ)的分類鑒定，甚至可以用基因組略讀來替代條形碼PCR。

1.7 低場核磁(LF-NMR)技術(shù)

LF-NMR技術(shù)以其簡便的操作過程，無需進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理能節(jié)約試劑及樣本的優(yōu)點(diǎn)，在食品中得以普及應(yīng)用，在阿膠摻偽鑒定上也有著較大應(yīng)用價值。

姜嬌嬌[42]采用LF-NMR儀對阿膠進(jìn)行快速檢驗(yàn)，用主成分分析法和逐步判斷分析法分析了純阿膠與摻偽阿膠間的差別，并對摻偽阿膠不同摻偽比例進(jìn)行區(qū)分。結(jié)果表明所測7個廠家不同阿膠樣品的弛豫時間與峰面積均不相同，結(jié)合主成分分析法，可推測出不同輔料及加工工藝會引起H質(zhì)子狀態(tài)的差異，對快速鑒定不同品牌阿膠有著較大意義。通過逐步判斷分析法，依據(jù)得分模型可對各個摻偽阿膠中摻假物質(zhì)的最低檢出限進(jìn)行確定。對于測定數(shù)據(jù)的分析，逐步判斷分析法比主成分分析法在分析類別間差異上有著更加顯著的區(qū)分效果。

2 結(jié)論與展望

阿膠及其制品質(zhì)量檢測技術(shù)主要是針對于阿膠中的特異性成分(氨基酸、核酸)采用合理方法進(jìn)行成分測定。目前阿膠及其制品因深加工工藝致使阿膠性狀改變、結(jié)構(gòu)破壞、核酸降解，提取、濃縮、富集、測定等環(huán)節(jié)存在干擾因素影響檢測技術(shù)的發(fā)展。

通過對阿膠質(zhì)量檢測評估方法的總結(jié)發(fā)現(xiàn)，紅外光譜法易受深加工制品加工程度的影響，導(dǎo)致準(zhǔn)確性較低，已不能完全滿足日常監(jiān)督檢驗(yàn)的需求；Tricine-SDS-PAGE法存在著特異性和靈敏度較低的局限，僅作為膠類藥材粗略分類判讀的依據(jù)。近年來，隨著相關(guān)科學(xué)研究的深入，阿膠檢驗(yàn)技術(shù)趨于多樣化，在分子生物學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域取得了有效成果。熒光實(shí)時定量PCR在阿膠檢測方面的應(yīng)用靈敏度高并且鑒別結(jié)果特異性強(qiáng)，為阿膠真?zhèn)舞b別、優(yōu)劣鑒定提供有效手段。隨著生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫的不斷更新完善，DNA條形碼技術(shù)也愈發(fā)成熟，為國內(nèi)外食品安全保駕護(hù)航。同時，HPLC技術(shù)因不破壞樣品結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于阿膠等中藥材的鑒別，也是目前國際上普遍認(rèn)可的食藥制品質(zhì)量評價與控制的先進(jìn)技術(shù)，具有操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確、分析時間短及重復(fù)性好的優(yōu)勢，可對阿膠摻假檢測進(jìn)行定量分析。而LF-NMR技術(shù)也以其能快速高效地鑒定阿膠摻偽程度，為阿膠鑒定提供了新方向。

對于阿膠質(zhì)控來說，應(yīng)在鑒別時綜合考慮多方面因素，重點(diǎn)在于驢皮與其他動物皮之間專屬性成分的鑒定，并探索建立多學(xué)科、多面檢測技術(shù)集成的方法，例如：用HPLC法聯(lián)合DNA條形碼技術(shù)來進(jìn)行阿膠真?zhèn)蔚蔫b別，通過對DNA序列的差異性、樣品中氨基酸的含量平均值和RSD進(jìn)行綜合判別，不僅重復(fù)性好，分析時間也較短，能夠明確驢皮與其他動物皮基因序列的差異以及氨基酸含量與質(zhì)量優(yōu)劣的關(guān)聯(lián)性，將成為阿膠檢測方法中較有應(yīng)用前景的鑒別方式之一。