多基因編輯豬-猴心臟、肝臟、腎臟移植臨床前研究初步報道

張玄 王琳 張洪濤 楊詔旭 岳樹強 楊雁靈 董海龍 陳敏 路志紅 程亮 劉金成 俞世強 張更 秦衛(wèi)軍 李紀鵬 魏紅江 楊璐菡 周亮 龍恩武 陶開山 竇科峰

目前，隨著器官移植技術(shù)的日益成熟，供體短缺已成為嚴峻的全球性問題，嚴重阻礙著臨床器官移植的發(fā)展[1-2]。以基因編輯豬為供體的異種移植是解決這一難題的有效途徑之一[3]。近年來，供體豬的基因編輯過程實現(xiàn)了快速、高效和多樣化[4]，其器官在非人靈長類動物體內(nèi)的存活時間不斷延長，原位腎臟移植受體術(shù)后最長存活時間達499 d[5]，異位和原位心臟移植受體術(shù)后最長存活時間分別為945 d和195 d[6-7]。與此同時，作為病原體跨物種感染核心的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（porcine endogenous retrovirus, PERV）也在供體豬中被敲除，并實現(xiàn)了PERV敲除豬的培育繁殖[8-9]。臨床異種器官移植發(fā)展初具規(guī)模[10-11]。

在供體豬的多樣化基因編輯過程中，敲除引起超急性排斥反應(yīng)的3種主要異種抗原基因[α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（α-1，3-galactosyltransferase，GalT）、β-1，4-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶2（β-1，4-N-acetylg alactosaminyltransferase 2，β4GalNT2）、單磷酸胞嘧啶-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）]，并轉(zhuǎn)入抑制補體活化、調(diào)節(jié)凝血紊亂、抗炎抗吞噬的人源化基因等，是降低靈長類受體免疫反應(yīng)、減少移植物損傷的重要手段[4]。在篩選適合臨床應(yīng)用的基因編輯組合時，出現(xiàn)了“7基因編輯”豬、“9基因編輯”豬等臨床移植潛在的供體，但其實際應(yīng)用效果仍有待通過臨床前實驗來驗證[4,12-13]。

在前期基礎(chǔ)上，本研究團隊在國際范圍內(nèi)首次成功培育出基因改造程度最大的PERV敲除豬，實現(xiàn)了“13基因編輯”，即PERV-KO/GalT-KO/β4GalNT2-KO/CMAH-KO/hCD46/hCD55/hCD59/hβ2M/hHLA-E/hCD47/hTHBD/hTFPI/hCD39（PERV-KO/3-KO/9-TG），并將其作為供體，實施了豬-恒河猴異種心臟、肝臟和腎臟移植的臨床前研究，探索了此種類型供體豬在異種器官移植中的臨床應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

供體：PERV-KO/GalT-KO/β4GalNT2-KO/CMAHKO/hCD46/hCD55/hCD59/hβ2M/ hHLA-E/hCD47/hTHBD/hTFPI/hCD39（PERV-KO/3-KO/9-TG）的基因編輯Bama小型豬，體質(zhì)量11.0 kg，血型O型，由杭州啟函生物科技有限公司和云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院聯(lián)合培育提供。受體：恒河猴，由四川省醫(yī)學科學院暨四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所提供。其中心臟移植受體（芯片號61890），雄性，體質(zhì)量8.6 kg，血型B型；肝臟移植受體（芯片號61873），雄性，體質(zhì)量14.7 kg，血型B型；腎臟移植受體（芯片號823804），雄性，體質(zhì)量10.6 kg，血型B型。所有實驗均通過空軍軍醫(yī)大學實驗動物倫理委員會審核。

1.2 手術(shù)方式

心臟移植采用腹部異位心臟移植，具體術(shù)式同小鼠腹部心臟移植[14]。肝臟移植采用脾窩異位輔助性肝臟移植[15-16]，因前期術(shù)式門靜脈灌注量偏低，本研究對該術(shù)式進行了改良：在腎靜脈平面下方離斷受體下腔靜脈，將移植肝臟門靜脈和遠心端下腔靜脈吻合，肝靜脈和近心端下腔靜脈吻合，肝動脈和腹主動脈吻合，膽道行膽腸吻合。腎臟移植受體自體雙腎切除后，采用臨床常規(guī)的左髂窩腎臟移植[17]。

1.3 免疫抑制方案

心臟移植：抗胸腺細胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）術(shù)前1 d給藥（5 mg/kg）；眼鏡蛇毒因子（cobra venom factor，CVF）術(shù)前 1 d給藥（100 μg/kg）； 抗 CD20單克隆抗體（anti-CD20 monoclonal antibody, aCD20）術(shù)前1周、手術(shù)當日和術(shù)后每周1次給藥（19 mg/kg）；抗CD40單克隆抗體（anti-CD40 monoclonal antibody, aCD40）術(shù)前1 d給藥（40 mg/kg），手術(shù)當日、術(shù)后4 d、術(shù)后9 d、之后每周1次給藥（20 mg/kg）；嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）術(shù)后每日2次給藥（20 mg/kg）；甲潑尼龍（methylprednisolone，MP）手術(shù)當日給藥（10 mg/kg），術(shù)后1 d減半，之后每3 d減半。

肝臟移植：ATG術(shù)前1 d給藥（5 mg/kg）；CVF術(shù)前1 d給藥（100 μg/kg）；他克莫司（tacrolimus，Tac）每日2次（0.06 mg/kg）；aCD40手術(shù)當日、術(shù)后4 d給藥（20 mg/kg），術(shù)后7 d、之后每周1次給藥（10 mg/kg）；MP手術(shù)當日給藥（10 mg/kg），術(shù)后1 d減半，之后每3 d減半。

腎臟移植：ATG術(shù)前1 d給藥（5 mg/kg）；aCD20術(shù)前1周、手術(shù)當日、術(shù)后每周1次給藥（19 mg/kg）；aCD40術(shù)前1 d給藥（40 mg/kg），手術(shù)當日、術(shù)后4 d、術(shù)后7 d、之后每周1次給藥（20 mg/kg）；Tac每日2次給藥（0.06 mg/kg）；MMF術(shù)后每日2次給藥（15 mg/kg）；MP手術(shù)當日給藥（10 mg/kg），術(shù)后1 d減半，之后每3 d減半。

1.4 研究內(nèi)容

觀察血流重建后各移植物的功能狀態(tài)，包括顏色、質(zhì)地、血流灌注及器官功能恢復情況，并總結(jié)受體存活情況；采用彩色多普勒超聲（彩超）監(jiān)測移植物的血流動力學情況；比較各器官移植受體的心肌酶譜、肝功能和腎功能等血液學指標變化；在觀察終點，獲取各移植物組織樣本，行組織病理學檢查。綜合評估移植器官功能狀態(tài)和異種移植排斥反應(yīng)發(fā)生情況。

2 結(jié) 果

2.1 血流重建后各移植物的功能狀態(tài)和受體存活情況

手術(shù)過程順利，各移植物血流恢復后均顯示顏色紅潤、質(zhì)地柔軟、血流灌注狀態(tài)良好（圖1）。其中，移植心臟即刻復跳，搏動規(guī)律有力；移植肝臟有金黃色的膽汁從膽管流出；移植腎臟可見尿液從輸尿管中流出。心臟、肝臟和腎臟移植受體的存活時間分別為7 d、26 d和1 d，分別死于下腔靜脈血栓形成、凝血紊亂所致低血壓和嚴重心律失常。

2.2 移植物的血流動力學情況

采用彩超對各移植物分別進行血流動力學監(jiān)測。結(jié)果顯示，術(shù)后1 d，移植心臟、肝臟和腎臟均表現(xiàn)為動、靜脈血流狀態(tài)充盈、灌注情況良好（圖2）。

2.3 血液學指標的變化

圖1 血流重建后各移植物的功能狀態(tài)Figure 1 The functional states of xenografts after blood flow reconstruction

采集各受體術(shù)后不同時間點的血液樣本，進行心肌酶譜、肝功能和腎功能檢測。結(jié)果顯示，心臟移植受體術(shù)后1 d肌酸激酶、肌酸激酶同工酶以及乳酸脫氫酶水平均升高，分別為3 720 U/L、513 U/L和1 744 U/L，至術(shù)后6 d逐漸恢復至接近正常水平。術(shù)后7 d，各項指標均急劇升高，分別為51 852 U/L、956 U/L和5 766 U/L（圖3A）。肝臟移植受體術(shù)后2 d天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平升高，達到3 714 U/L，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶為365 U/L，總膽紅素為13 μmol/L。術(shù)后10 d轉(zhuǎn)氨酶基本恢復正常水平，但總膽紅素持續(xù)升高。術(shù)后12 d，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平均出現(xiàn)升高，至術(shù)后15 d達到高峰，分別為1 398 U/L和151 U/L，總膽紅素為74 μmol/L（圖3B）。結(jié)合受體臨床表現(xiàn)，考慮移植肝臟出現(xiàn)異種排斥反應(yīng)，給予糖皮質(zhì)激素治療后各項指標逐漸好轉(zhuǎn)。腎臟移植受體術(shù)后1 d血清肌酐374 μmol/L，并出現(xiàn)輕微蛋白尿，后因突發(fā)嚴重心律失常死亡。

2.4 移植物組織病理學表現(xiàn)

分別在各移植終點獲取移植物組織樣本，行蘇木素-伊紅染色。結(jié)果顯示，在移植終點，移植心臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)接近正常（圖4A、D），而移植肝臟表現(xiàn)為片狀壞死（圖4B、C分別顯示不同的區(qū)域），肝組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，并伴有明顯炎癥損傷、間質(zhì)出血和血栓性微血管病。

3 討 論

目前，異種器官移植主要存在超急性排斥反應(yīng)、急性排斥反應(yīng)、凝血功能障礙和物種間交叉感染等問題[4]。將異種器官移植應(yīng)用于臨床，一方面需要對供體豬進行大規(guī)模的基因改造，提高其人源化程度，以減輕異種移植免疫排斥反應(yīng)、克服凝血功能紊亂等[12,18]；另一方面則需要摸索合適的免疫抑制方案，并通過大量動物實驗來觀察移植物功能和受體存活狀態(tài)，從而驗證基因編輯效果[4]。本研究中的供體，在世界范圍內(nèi)首次實現(xiàn)了PERV敲除聯(lián)合3種主要異種抗原基因敲除（GalT、β4GalNT2、CMAH），以及抑制補體活化（hCD46、hCD55、hCD59）、調(diào)節(jié)凝血紊亂（hTHBD、hTFPI、hCD39）、抗炎抗吞噬（hB2M、hHLA-E、hCD47）的9種人源化基因轉(zhuǎn)入[9]，在世界范圍內(nèi)，屬于基因改造程度最大、人源化程度最高的供體豬類型。理論上，該類供體既可解決異種器官移植后PERV交叉感染及超急性排斥反應(yīng)的問題，也可以降低異種器官移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)和凝血功能紊亂等問題。同時，移植受體選擇恒河猴，相比于其它非人靈長類具有以下優(yōu)勢：（1）恒河猴基因組與人類基因組的同源性達94%，生理指標與人類接近[19]；（2）恒河猴基因組測序工作已完成[20]，且高質(zhì)量的中國恒河猴參考基因組為功能注釋提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)[21]；（3）實驗中所使用的aCD40免疫抑制劑在恒河猴體內(nèi)的效能明確[5,22]。

圖2 術(shù)后1 d各移植物的血流動力學情況Figure 2 Hemodynamic condition of xenografts at 1 d after operation

圖3 心臟移植和肝臟移植受體心肌酶譜和肝功能的變化Figure 3 Changes of myocardial enzyme spectrum and liver function of heart transplant and liver transplant recipients

圖4 各移植物組織病理學表現(xiàn)（蘇木素-伊紅，×200）Figure 4 Histopathological manifestations of xenografts

本研究在國際范圍內(nèi)首次使用PERV敲除的“13基因編輯”豬作為供體[4]，并同時將1只供體的器官分別移植給3只受體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植物再灌注后顏色紅潤、質(zhì)地柔軟、血流灌注狀態(tài)良好，提示GalT、β4GalNT2、CMAH敲除可抑制異種移植超急性排斥反應(yīng)，與其他學者前期的研究結(jié)果一致[13,23]。但是，隨著受體生存期延長，移植肝臟出現(xiàn)明顯的體液性排斥反應(yīng)，表現(xiàn)為片狀壞死，肝組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂，并伴有炎癥損傷、間質(zhì)出血和血栓性微血管病等，提示供體豬9種人源化基因的轉(zhuǎn)入并不能完全避免異種移植物損傷。本研究中，肝臟移植受體突破了豬-猴輔助性肝臟移植國際同類術(shù)式最長存活時間記錄[4,24]，在一定程度上證實了PERV-KO/3-KO/9-TG豬在改善移植排斥反應(yīng)、受體凝血異常等方面仍有自身優(yōu)勢，但其能否作為臨床異種器官移植的潛在供體仍需進一步評估。此外，PERV敲除理論上可阻斷病毒跨物種傳播，本研究結(jié)果也提示PERV不會傳播到受體血液或組織中，但PERV監(jiān)測仍然是一個值得關(guān)注的問題，尤其是在長期存活的受體當中[25]。

綜上所述，PERV-KO/3-KO/9-TG豬在克服超急性排斥反應(yīng)、緩解體液性排斥反應(yīng)及凝血紊亂方面具有一定優(yōu)勢，但其能否作為臨床異種器官移植潛在供體需進一步評估。異種器官移植臨床前研究實施難度大，受體依從性差，給藥窗口窄，用藥、護理等術(shù)后管理困難[12,15]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上[15]，采用同一基因編輯豬作為3種器官供體，并同時完成心臟、肝臟和腎臟移植，為后期進一步的臨床研究積累了豐富經(jīng)驗，并提供了重要的數(shù)據(jù)支撐。