穿龍薯蕷莖段組培體系的建立

黨裳霓, 劉 影, 高潤(rùn)梅

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院， 山西 太谷 030801)

穿龍薯蕷(Dioscoreanipponica)為薯蕷科(Dioscoreaceae)多年生纏繞草質(zhì)藤本，廣泛分布于我國(guó)東北、華北、西北(除新疆)及河南、山東、安徽、浙江、江西 (廬山) 、陜西 (秦嶺以北) 、四川等地[1]。其根狀莖是提取藥用成分薯蕷皂甙的重要原料[2]。目前對(duì)藥源材料的需求持續(xù)增加，但穿龍薯蕷野生資源量日趨減少，已處于瀕危狀態(tài)，屬國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物[3]。生產(chǎn)上雖可通過(guò)根狀莖繁殖或播種的方法解決對(duì)藥源材料的需求，但人工栽培存在許多不足，如以根狀莖繁殖，不僅要消耗大量的根狀莖，而且難以保證藥材質(zhì)量，繁殖速度較慢，人工栽培一般3年后采收；如采用種子進(jìn)行繁殖，不僅萌發(fā)率低，苗期長(zhǎng)，且定植5年后才可采收[4-6]。組織培養(yǎng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物良種培育與快速繁殖，為穿龍薯蕷的大規(guī)模種植開(kāi)辟了新途徑，對(duì)解決生產(chǎn)中種苗缺乏的突出矛盾，提高穿龍薯蕷的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義[7]。本試驗(yàn)以穿龍薯蕷幼嫩帶節(jié)莖段為試材，分析消毒時(shí)間、培養(yǎng)基激素配比對(duì)該種腋芽誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)等的影響，以期建立穩(wěn)定、高效的穿龍薯蕷離體再生體系，實(shí)現(xiàn)穿龍薯蕷生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化，促進(jìn)穿龍薯蕷種植產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 植物材料

穿龍薯蕷植株引種自山西省陽(yáng)城縣蟒河國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，2015年春栽種于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院苗圃。

2016年6月，取生長(zhǎng)健壯的穿龍薯蕷植株幼嫩莖段，剪成長(zhǎng)1.5～2 cm的帶芽莖段，置于飽和洗衣粉溶液的燒杯中清洗后流水持續(xù)沖洗30 min，再用蒸餾水沖洗3遍。將供試材料放入超凈工作臺(tái)進(jìn)行消毒[8]。

1.2 外植體消毒

75%酒精外植體表面消毒30 s后，以0.1% HgCl2進(jìn)行消毒處理，分別設(shè)置3 min、5 min和8 min的處理時(shí)間，比較不同時(shí)間處理的消毒效果。接種30 d后，統(tǒng)計(jì)莖段的褐化死亡率、污染率和萌芽率。其中外植體無(wú)污染、未褐變視之為成活，之后有效回收HgCl2[9]。

1.3 莖段離體培養(yǎng)

試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基中均添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH調(diào)至6.0，121 ℃高壓滅菌30 min。所有培養(yǎng)物均于(25±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1 500 lx，光暗各12 h。

1.3.1誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素配比

采用3因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。3個(gè)因素為基本培養(yǎng)基、NAA、6-BA，其中，選取3種培養(yǎng)基MS、B5、1/2 MS；NAA選取0、0.1 mg·L-1和0.2 mg·L-13個(gè)濃度水平；6-BA選取0、1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-13個(gè)濃度水平，試驗(yàn)共有9種組合培養(yǎng)基。外植體按適宜消毒時(shí)間處理后，分別接種于上述9種培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種20瓶，每瓶接種3個(gè)外植體，接種30 d后統(tǒng)計(jì)莖段的污染率、褐化死亡率及萌芽率。

1.3.2增殖培養(yǎng)基激素配比

采用2因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。將初代培養(yǎng)得到的瓶苗剪成1～2 cm帶一葉一節(jié)的莖段轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中。2因素為NAA、6-BA，其中，NAA選取0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1和0.3 mg·L-13個(gè)濃度；6-BA選取1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1和3.0 mg·L-13個(gè)濃度水平，試驗(yàn)共有9種組合。每個(gè)處理方式接種20瓶，每瓶接種3株。以30 d為1個(gè)繼代周期，繼代3次后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)和叢生芽數(shù)，觀察芽的長(zhǎng)勢(shì)。

1.3.3生根培養(yǎng)基激素配比

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IBA、6-BA、NAA于培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)。將生長(zhǎng)至3～4 cm長(zhǎng)勢(shì)較為健壯的芽苗轉(zhuǎn)入不同生根培養(yǎng)基中進(jìn)行根誘導(dǎo)。其中，NAA選取0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-14個(gè)梯度；6-BA濃度設(shè)置為1.0 mg·L-1；IBA濃度設(shè)置為0.5 mg·L-1。每種培養(yǎng)基接種30瓶，每瓶接種3株，60 d后觀察不同處理之間的生長(zhǎng)狀況、生根率、根數(shù)、根長(zhǎng)及株高情況。

1.3.4瓶苗移栽

由于組培苗幼嫩，一直處于可控的環(huán)境下生長(zhǎng)，抗性較低。所以移栽前要先煉苗，提高其成活率。

將生根培養(yǎng)后生長(zhǎng)良好的試管苗移至(25±1)℃、50%～70%遮陰度的大棚內(nèi)，進(jìn)行光培煉苗，自然光下閉瓶煉苗3 d[10]。再將封口膜取下2～3 d，煉苗過(guò)程中，每天選擇光照弱的時(shí)候通風(fēng)2次，每次30 min[11]。取出幼苗，洗去根部瓊脂，移栽于蛭石∶腐殖土∶河沙=1∶1∶1的基質(zhì)中[12]。并在移栽后滿足組培苗所需水分，保持較高的濕度，每天噴霧噴施適量水，20 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel、SPSS、DPS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平為0.05和0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響

以污染率、褐化死亡率和萌芽率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析0.1% HgCl2不同消毒時(shí)間對(duì)外植體的影響，見(jiàn)表1。

表1 消毒時(shí)間對(duì)外植體滅菌效果的影響

由表1可知，HgCl2消毒不同時(shí)間，對(duì)萌芽率的影響達(dá)顯著水平(p<0.01)，隨著滅菌時(shí)間的增加，污染率逐漸降低，在5 min時(shí)外植體萌芽率最高(83.33%)。由于材料較幼嫩，消毒時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，外植體褐化死亡現(xiàn)象加重，萌芽率顯著下降，在8 min時(shí)死亡率達(dá)36.67%，萌芽率降到58.33%。可見(jiàn)，以0.1% HgCl2作為腋芽誘導(dǎo)外植體消毒溶液，消毒時(shí)間以5 min為宜。

2.2 蕷莖段腋芽誘導(dǎo)NAA與6-BA濃度的優(yōu)化

以萌芽率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)合腋芽生長(zhǎng)情況，分析不同處理對(duì)腋芽萌發(fā)的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同濃度NAA與6-BA組合對(duì)腋芽萌發(fā)的影響

由表2可知，基本培養(yǎng)基類(lèi)型、2種外源激素NAA和6-BA的濃度對(duì)腋芽誘導(dǎo)效果存在顯著差異(p<0.01)，2.0 mg·L-16-BA對(duì)腋芽萌發(fā)的效果較好，1.0 mg·L-1次之。在MS、1/2 MS和B5培養(yǎng)基中，2.0 mg·L-16-BA時(shí)萌芽率較高，分別為86.67%、75.00%和73.33%。因此，在0～2.0 mg·L-1的6-BA濃度范圍內(nèi)，萌芽率隨6-BA濃度增加呈上升趨勢(shì)，且MS培養(yǎng)基是腋芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基。結(jié)合萌芽率和生長(zhǎng)狀況等，不定芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基為MS+0.2 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-16-BA，萌芽率為86.67%，且生長(zhǎng)勢(shì)好，葉色濃綠。

2.3 腋芽繼代培養(yǎng)

對(duì)不同激素配比培養(yǎng)條件下不定芽的增殖情況進(jìn)行極差分析，如表3所示。

由表3可知，6-BA對(duì)穿龍薯蕷再生苗的增殖影響大于NAA的影響。從不同處理的平均萌芽率(k)的大小可以看出，穿龍薯蕷不定芽增殖培養(yǎng)的適宜水平激素組合為 0.2 mg·L-1NAA+ 3.0 mg·L-16-BA，增殖系數(shù)為4.58；6-BA濃度為1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-1時(shí)，苗弱發(fā)黃，長(zhǎng)勢(shì)較弱；6-BA濃度為3.0 mg·L-1時(shí)，不僅增殖率高，而且幼苗健壯，葉色淡綠，生長(zhǎng)速度快。因此，較低的NAA/6-BA濃度比顯著促進(jìn)穿龍薯蕷芽增殖。

表3 不同濃度NAA與6-BA組合對(duì)增殖系數(shù)影響的極差分析

2.4 生根培養(yǎng)

將經(jīng)繼代培養(yǎng)后高達(dá)3 cm的小植株，接種于添加不同激素的1/2 MS生根培養(yǎng)基上。10 d左右開(kāi)始出現(xiàn)白色根原基，20 d左右組培苗莖段底部逐漸出現(xiàn)白色根，一個(gè)月后小苗生根趨于穩(wěn)定。

方差分析結(jié)果(表4)表明，添加單一激素NAA生根效果明顯優(yōu)于其它處理。與其它處理相比，1號(hào)培養(yǎng)基生根效果最好，誘導(dǎo)的根系粗壯且生長(zhǎng)較快，葉色濃綠，有明顯主根，生根率達(dá)到峰值73.34%。而對(duì)照的生根率僅次于1號(hào)培養(yǎng)基，說(shuō)明在不添加外源激素的情況下，同樣可以誘導(dǎo)生根，生根率為60.02%，但根較細(xì)弱，葉色黃綠，無(wú)明顯的主根，多為須根。隨著NAA濃度增加，穿龍薯蕷根的長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)。NAA濃度為0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1時(shí)利于芽苗生根，濃度過(guò)高(1.0 mg·L-1)生根率會(huì)降低，影響生根效果。在NAA基礎(chǔ)上添加6-BA或IBA時(shí)，生根率低，且株高、根數(shù)和根長(zhǎng)均低于含單一激素NAA(處理1、2、3)和對(duì)照。

表4 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)生根培養(yǎng)的影響

生根后的幼苗在上述6種培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d、20 d、45 d和60 d后，株高見(jiàn)圖1 。

由圖1可知，生根培養(yǎng)前20 d內(nèi)，培養(yǎng)基濃度對(duì)幼苗株高影響差異不顯著(p<0.05)，但對(duì)培養(yǎng)45 d(C)和60 d(D)的幼苗株高存在顯著影響(p<0.05)。不同的培養(yǎng)時(shí)間段，1號(hào)培養(yǎng)基幼苗株高均高于其他5種處理：10 d的株高為2.48 cm，20 d的株高為5.05 cm，45 d的株高為7.51 cm，60 d時(shí)株高達(dá)8.68 cm，生長(zhǎng)狀況最好，株高增幅顯著；其次是ck、2號(hào)和3號(hào)培養(yǎng)基；45 d和60 d幼苗株高1號(hào)培養(yǎng)基比ck分別高3.42 cm和4.02 cm。由此可見(jiàn)，生根率和生根情況以及平均株高可作為綜合評(píng)價(jià)組培苗的指標(biāo)體系。在NAA基礎(chǔ)上，添加IBA和6-BA對(duì)促進(jìn)芽苗生根的影響作用較小。

注：不同小寫(xiě)字母示處理間在0.05水平上差異顯著。下同。

對(duì)60 d內(nèi)不同濃度生根培養(yǎng)基的組培苗的根數(shù)和根長(zhǎng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，不同組培苗之間生根數(shù)和根長(zhǎng)存在一定差異。平均根數(shù)和根長(zhǎng)在不同濃度的培養(yǎng)基間的差異顯著(p<0.05)。其中1號(hào)培養(yǎng)基的平均根數(shù)13.2條，而5號(hào)培養(yǎng)基僅3.4條(圖2 A)；1號(hào)培養(yǎng)基的根長(zhǎng)達(dá)2.79 cm，而5號(hào)培養(yǎng)基根長(zhǎng)僅0.8 cm(圖2 B)。因此，單一激素NAA與2種激素組合相比，前者誘導(dǎo)生根的效果明顯優(yōu)于后者。由于穿龍薯蕷地下生物量和地上生物量成正比關(guān)系，NAA濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，生根率達(dá)到峰值，株高、根數(shù)和根長(zhǎng)增幅顯著，生長(zhǎng)狀況較好。因此適宜生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg·L-1NAA。

圖2 不同濃度的激素組合對(duì)生根數(shù)和根長(zhǎng)的影響

2.5 瓶苗移栽

本次試驗(yàn)選用腐質(zhì)土∶蛭石∶河沙=1∶1∶1混合物作為移栽基質(zhì)，煉苗后移栽時(shí)基質(zhì)的選擇對(duì)組培苗能否成活起著重要作用。而腐質(zhì)土、蛭石和河沙的混合物是較為理想的基質(zhì)，通透性與保水性較好，將基質(zhì)混合均勻且在121 ℃滅菌30 min。移栽初期，組培苗幼嫩，不適應(yīng)新環(huán)境，呈現(xiàn)萎蔫狀態(tài)。移栽14 d左右，組培苗恢復(fù)正常，并長(zhǎng)出1～2片新葉，長(zhǎng)勢(shì)良好，移栽存活率可達(dá)63.20%(見(jiàn)圖3)。

注：A為初代培養(yǎng)芽誘導(dǎo)(MS+0.2 mg·L-1 NAA+2.0 mg·L-1 6-BA)；B為第1次繼代培養(yǎng)(MS+0.2 mg·L-1 NAA+3.0 mg·L-1 6-BA)；C為第2次繼代培養(yǎng) (MS+0.2 mg·L-1 NAA +3.0 mg·L-1 6-BA)；D為第3次繼代培養(yǎng)(MS+0.2 mg·L-1 NAA+3.0 mg·L-1 6-BA)；E為生根培養(yǎng)(1/2 MS+ 0.1 mg·L-1 NAA )；F為移栽成活的試管苗。

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論

對(duì)于處于瀕危狀態(tài)的物種通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模繁殖，利于其種質(zhì)資源的保存，但不同的物種其培養(yǎng)條件各異[13]。

取大田栽培的穿龍薯蕷地上幼嫩帶節(jié)莖段，較難獲得無(wú)菌外植體。消毒時(shí)間的選擇也需謹(jǐn)慎，因?yàn)椴牧陷^幼嫩，若消毒時(shí)間過(guò)短，則會(huì)出現(xiàn)大面積的污染，從而失去寶貴的試驗(yàn)材料，增加成本；若消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，雖可降低污染率，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致接入培養(yǎng)基后存活率的降低或抑制其生長(zhǎng)，加重外植體死亡與褐化現(xiàn)象的發(fā)生[14]。且HgCl2毒性大，易殘留，環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)高，對(duì)使用和回收要求高[15-16]。

生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素相互配合在植物離體培養(yǎng)中能夠?qū)?xì)胞的分裂與分化、形態(tài)建成、控制器官的分化均有著重要的調(diào)節(jié)作用[17]，并且不同組培階段所需的外源激素種類(lèi)、濃度和配比不完全相同，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有相當(dāng)大的影響[18-20]。在一定濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的濃度比是關(guān)鍵指標(biāo)，對(duì)芽與根的萌發(fā)與發(fā)育有重要的影響。生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素比值高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致植株的膨大生長(zhǎng)，減弱芽生長(zhǎng)，利于生根，比值較低時(shí)相反[21]，有研究甚至提出對(duì)帶芽莖段萌芽率誘導(dǎo)的比值為10時(shí)，腋芽萌發(fā)率最高[22]。本研究中，細(xì)胞分裂素對(duì)芽誘導(dǎo)和芽增殖影響顯著，而生長(zhǎng)素對(duì)2個(gè)培養(yǎng)階段無(wú)明顯影響。芽誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基NAA和6-BA激素濃度的比值為10。根誘導(dǎo)是植物組織培養(yǎng)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，只有誘導(dǎo)出健壯、發(fā)達(dá)的根，組培苗才能成功移栽。本次試驗(yàn)中，通過(guò)比較生根率、根數(shù)和根長(zhǎng)，并結(jié)合組培苗的株高與生長(zhǎng)狀況，認(rèn)為單一激素NAA的生根效果優(yōu)于2種激素組合。

光是植物生長(zhǎng)不可缺少的條件，光照強(qiáng)度對(duì)植物生長(zhǎng)率、葉片數(shù)量和株高有重要意義[23]。研究表明，光照強(qiáng)度低時(shí)，植物會(huì)通過(guò)消耗自身的物質(zhì)來(lái)擴(kuò)大接收光能的面積，同時(shí)光合作用的速度減慢，光合作用產(chǎn)物的積累變少，不利于植物生長(zhǎng)[24]。由于光照強(qiáng)度影響光合色素合成，葉綠素含量與葉色顯著相關(guān)[25]。因此，光照強(qiáng)度對(duì)植物組培苗的影響主要體現(xiàn)在苗色變化上[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，穿龍薯蕷腋芽誘導(dǎo)的芽苗轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基后，苗色由深綠變?yōu)闇\綠。芽苗繼代培養(yǎng)與初代培養(yǎng)相比，需要更強(qiáng)的光照，本試驗(yàn)的苗色變化可能是由光照強(qiáng)度減弱引起的，所以一個(gè)繼代周期后，選擇透光性好的培養(yǎng)瓶，芽苗接收光照更充分，苗色逐漸恢復(fù)。

3.2 結(jié) 論

本研究以穿龍薯蕷幼嫩帶芽莖段為外植體，通過(guò)對(duì)消毒時(shí)間、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基激素配比進(jìn)行對(duì)比優(yōu)化，構(gòu)建莖段再生體系如下：

1) 以0.1% HgCl2作為腋芽誘導(dǎo)外植體消毒溶液的消毒時(shí)間以5 min為宜。

2) MS+0.2 mg·L-1NAA+2.0 mg·L-16-BA為誘導(dǎo)腋芽的適宜培養(yǎng)基。

3) MS+0.2 mg·L-1NAA+3.0 mg·L-16-BA芽增殖分化效果好。

4) 1/2 MS+0.1 mg·L-1NAA為適宜生根培養(yǎng)基。

5) 腐殖土∶蛭石∶沙河=1∶1∶1作為移栽基質(zhì)，幼苗成活率高。