油松組織培養(yǎng)及再生體系建立研究

費昭雪， 劉莉麗， 侯 娜， 彭少兵

(1.西北農(nóng)林科技大學林學院， 楊凌 712100； 2.貴州省林業(yè)科學研究院， 貴陽 550005)

油松(PinustabulaeformisCarriere.)為松科松屬常綠喬木，樹高可達30 m以上，胸徑可達1 m[1]。油松適應(yīng)性強，廣泛分布于我國東北、西北、華中、西南等地區(qū)[2-4]。油松材質(zhì)致密耐用，是建筑、造船及家具等的良好用材[5-8]。油松的用途廣泛，市場需求量逐年增加，野生資源已經(jīng)難以滿足需求，主要依靠人工種植，因此，油松苗木供應(yīng)亟待一種快速繁殖的方法。植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有高效快速、遺傳穩(wěn)定的優(yōu)點成為了油松繁殖的有效途徑[9-11]。試驗以油松組織培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)為核心進行研究，旨在為相關(guān)的生產(chǎn)研究提供一定的依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

于2018年春季采集一年生健壯、無病蟲害的油松嫩枝作為外植體，在洗潔精水中漂洗3～5 min，洗去材料表面的泥土和灰塵，然后用自來水進行流動沖洗，時間30 min[12]。清洗中修剪過長或過大枝條，隨后用75%酒精消毒30 s，0.1%升汞消毒10 min，最后用無菌水沖洗3～5次。

1.2 實驗方法

1.2.1外植體預(yù)處理1.2.2油松外植體的芽分化培養(yǎng)

研究油松的分化，可以為遺傳體系建立和多倍體等實驗做鋪墊，另外，快速繁殖還能夠縮短育種周期，提高藥用成分的含量。實驗以MS為基本培養(yǎng)基，加入30.0 g·L-1蔗糖，5.0 g·L-1瓊脂，采用正交實驗法設(shè)計6-BA、TDZ和NAA 三種激素的不同濃度和配比，添加到培養(yǎng)基中[13-16]。分裂素(6-BA)設(shè)置濃度分別為1.0、2.0、3.0 mg·L-1，TDZ設(shè)置濃度分別為0.01、0.05、0.10 mg·L-1，生長素(NAA)設(shè)置濃度分別為0.05、0.1、0.2 mg·L-1。按照正交試驗設(shè)計9組不同激素濃度配比和1組空白對照處理。實驗所用材料為健壯無菌苗，莖段(不帶葉腋)切成長約1 cm，平鋪于培養(yǎng)基中，每瓶4枚，每組10瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件同上。在培養(yǎng)期間定期觀察并做好分化率和生長情況的記錄。

1.2.3油松外植體的芽增殖培養(yǎng)

實驗在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，輔以蔗糖(30.0 g·L-1)，瓊脂(5.0 g·L-1)，以6-BA、TDZ和NAA三種激素濃度及配比為影響因素，采用正交實驗進行設(shè)計。分裂素6-BA設(shè)0.1、0.3、0.5 mg·L-1等3個濃度，TDZ設(shè)0.01、0.05、0.10 mg·L-1等3個濃度，生長素NAA設(shè)0.01、0.05、0.10 mg·L-1等3個濃度。選取消毒備用的材料，切取長約1 cm帶葉腋的莖段和長約2 cm的頂芽。莖段平鋪于培養(yǎng)基表面，每瓶4枚，每組10瓶，重復(fù)3次；頂芽插入培養(yǎng)基，每瓶4株，每組10瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件同上。在培養(yǎng)期間定期觀察并做好增殖情況、平均苗高和生長情況的記錄。

1.2.4油松不定芽生根培養(yǎng)

以1/2 MS(大量元素及鈣鹽用量減半，其余母液用量不變)為基本培養(yǎng)基，附加30.0 g·L-1蔗糖，5.0 g·L-1瓊脂，采用正交實驗設(shè)計研究IBA、NAA 2種激素的不同濃度和活性炭添加量對油松生根的影響。生長素(IBA)和NAA濃度梯度均為0.1、0.2、0.3 mg·L-1，活性炭設(shè)0.1、0.2、0.3 g·L-1等3個濃度。實驗選取健壯的無菌苗為材料，切取長約2 cm的頂芽接入培養(yǎng)基中，每瓶4株，每組10瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件同上。在生根培養(yǎng)期間定期觀察并記錄生根情況，統(tǒng)計生根數(shù)和測量根長。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0、Excel 2007軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對油松芽分化的影響

不同培養(yǎng)基對油松莖段的分化有明顯影響。從表1可以看出，用油松的莖段來分化，對照組處理(ck)分化芽數(shù)最低，為0；8號組合的分化芽數(shù)最高，為3.67。但是8號處理組合的油松長勢欠佳，有的出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，不利于后期的繼代繁殖。其中4號處理組合和6號處理組合雖然不是分化芽數(shù)最高的，但是其苗高和生長情況在本實驗中是最好的，且無玻璃化現(xiàn)象。4號處理組合的分化芽數(shù)(3.49)比6號組合的分化芽數(shù)(3.15)高。綜上所述，4號處理組合為油松莖段最佳分化培養(yǎng)基，即MS+2.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.05 mg·L-1NAA。

表1 不同培養(yǎng)基對油松莖段分化的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對油松芽增殖的影響

2.2.1不同培養(yǎng)基對油松莖段芽增殖的影響

不同種類激素濃度的配比對油松莖段的增殖效率有明顯影響(圖1)。從表2可以看出，沒有添加激素的組合(ck)增殖系數(shù)最低，為1.75。A 2號處理組合的增殖系數(shù)為5.33，是實驗組合中增殖系數(shù)最高的，并且增殖的植株長勢粗壯。雖然A 4號處理組合培養(yǎng)基增殖的植株長勢粗壯，且增殖系數(shù)達4.00，但其平均苗高為3.0 cm，較A 2號處理組合的低。A 1號和A 6號處理組合增殖系數(shù)也到達了4.00，但是長勢不如A 2號處理組合，且存在一定的玻璃化現(xiàn)象。綜合評定，A 2號處理組合的增殖系數(shù)、平均苗高、生長情況是實驗組合中最好的，綜上所述，油松帶葉腋莖段的最佳增殖培養(yǎng)基為A 2號處理組合MS+0.1 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.05 mg·L-1NAA。

注：A為外植體；B、C為愈傷組織；D為油松芽。

表2 不同培養(yǎng)基對油松莖段增殖的影響

2.2.2不同培養(yǎng)基對油松頂芽增殖的影響

不同種類激素濃度的配比對油松頂芽的增殖有明顯影響。從表3可知，以油松頂芽進行增殖，對照處理(ck)增殖系數(shù)最低，為1.33。A 8號組合的增殖系數(shù)最高，為4.67。但是A 8號組合的油松長勢欠佳，存在一定比例的玻璃化現(xiàn)象，不利于后期的繼代繁殖。其中A 4號組合和A 6號組合雖然不是增殖系數(shù)最高的，但是其苗高和生長情況在本實驗中均是最好的，且無玻璃化現(xiàn)象。A 4號組合的增殖系數(shù)(4.29)比A 6號組合的增殖系數(shù)(4.00)高，綜上所述，油松頂芽的最佳增殖培養(yǎng)基為A 4號組合MS+0.3 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.01 mg·L-1NAA。

表3 不同培養(yǎng)基對油松頂芽增殖的影響

2.3 生根培養(yǎng)

在生根培養(yǎng)的30 d里，不同時間段植株生根株數(shù)不同，在第10～15天生根植株增加得最多，平均為11株，第15天后生根的株數(shù)逐漸減少。分析其原因為油松需要萌發(fā)根原基才能順利完成生根，其生根方式為愈傷組織生根。不同的單株所需形成愈傷組織的需求不同，導(dǎo)致某些植株會優(yōu)先長出根，導(dǎo)致植株生根株數(shù)出現(xiàn)不規(guī)則遞增的現(xiàn)象。

試驗的總平均生根率為66.7%，由表4可看出，對照組(ck)的生根率最低，而B 1～B 9號處理組合的生根率為58.3%～91.7%，可以得出油松在激素的誘導(dǎo)下易于生根，無激素生根較困難。B 1～B 3，B 4～B 6，B 7～B 9號處理組合中生根率有下降的趨勢，以3個編號為一組進行分析，可以發(fā)現(xiàn)， 在IBA濃度保持不變的情況下，生根率隨NAA濃度升高呈下降趨勢，生根率最高的是B 7號處理組合(91.7%)，平均根長最長，為0.6 cm，然其苗高最低，為3.1 cm。分析原因為較高濃度的IBA和較低濃度的NAA對油松生根有良好的促進作用，因其有良好的誘導(dǎo)生根效果，但對植株營養(yǎng)器官的生長效果有所減弱，導(dǎo)致植株高度總體偏低。就活性炭添加量而言，B 1、B 6、B 8號處理組合活性炭添加量為0.1 g·L-1，其平均生根率最低，為66.7%；B 2、B 4、B 9號處理組合活性炭添加量為0.2 g·L-1，其平均生根率為77.8%； B 3、B 5、B 7號處理組合活性炭添加量為0.3 g·L-1，其平均生根率為77.8%。因此，活性炭添加量在0.2～0.3 g·L-1范圍內(nèi)時可促進生根。綜上，活性炭作為油松最佳生根培養(yǎng)基為B 7號處理組合。即1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-1NAA+0.3 g·L-1。

表4 油松生根數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

油松嫩枝優(yōu)化后的分化培養(yǎng)基是MS+2.0 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.05 mg·L-1NAA。其誘導(dǎo)分化率達4.49%，誘導(dǎo)分化的不定芽顏色濃綠，長勢較粗壯。

帶腋芽油松莖段組織培養(yǎng)增殖生長最佳培養(yǎng)基為MS+0.1 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.05 mg·L-1NAA。增殖植株生長粗壯，顏色濃綠，增殖系數(shù)達5.33；油松頂芽組織培養(yǎng)增殖生長最佳培養(yǎng)基為MS+0.3 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.01 mg·L-1NAA。在此條件下增殖植株生長粗壯，顏色濃綠，增殖系數(shù)達4.29。1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-1NAA+0.3 g·L-1活性炭為油松生根的最佳培養(yǎng)基。此條件下植株生長粗壯，生根條數(shù)在5條左右，生根率達91.7%。

3.2 討 論

MS+0.3 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1TDZ+0.01 mg·L-1NAA培養(yǎng)基能夠較好地呈現(xiàn)油松組織生長情況，可作為增殖生長的最佳培養(yǎng)基，在此條件下增殖植株生長粗壯，顏色濃綠，增殖系數(shù)為4.29。實驗中也對B 5培養(yǎng)基對油松的增殖效果進行了研究，結(jié)果顯示，在MS培養(yǎng)基的增殖效果普遍好于B 5培養(yǎng)基。試驗中還發(fā)現(xiàn)，選用油松莖段為材料進行增殖時，會逐漸膨大產(chǎn)生愈傷組織，培養(yǎng)一段時間后，愈傷組織開始分化出綠色的芽點，隨后分化出芽，因此認為，油松更適合于通過產(chǎn)生愈傷組織來增殖擴繁。

實驗還發(fā)現(xiàn)，適宜的培養(yǎng)基種類和激素配比對組織培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)分化、增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)均有促進作用。有學者也得到類似的結(jié)論[16]。在試驗中也證明了這一點，加激素的處理組明顯比未加激素的對照組的效果好。此外，在培養(yǎng)過程中，會出現(xiàn)增殖植株玻璃化的現(xiàn)象。引起試驗材料玻璃化是由于滲透勢不均衡造成的，當植物體內(nèi)的滲透勢低于培養(yǎng)基較多時，植物組織會從培養(yǎng)基中大量吸水，來促使兩側(cè)的滲透勢接近。結(jié)果導(dǎo)致培養(yǎng)的材料水分含量較高，呈現(xiàn)一種透明或半透明的狀態(tài)，稱之為玻璃化現(xiàn)象[17]。玻璃化的植株長勢弱，不能用作進一步增殖和生根的材料，對實驗結(jié)果也有一定的影響。在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，不能完全凝固的培養(yǎng)基中容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，一些激素濃度的配比也會導(dǎo)致一定程度的玻璃化。綜合分析來看，導(dǎo)致玻璃化現(xiàn)象的因素較多，比如培養(yǎng)材料、培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)基成分、繼代次數(shù)、植物激素等，但是在所查閱的文獻中未見到對油松組織培養(yǎng)實驗中玻璃化現(xiàn)象的講述。