TTC法快速測定南京椴種子生活力的研究

朱思宇， 周思雨， 祝 燕， 李吉春， 談建中

(1.蘇州大學(xué)建筑學(xué)院風(fēng)景園林系， 江蘇 蘇州 215123； 2.蘇州園林發(fā)展股份有限公司， 江蘇 蘇州 215008)

南京椴(TiliamiquelianaMaxim.)為椴樹科(Tiliaceae)椴樹屬(Tilia)高大落葉喬木，為我國特有種。南京椴集觀賞價值、經(jīng)濟(jì)價值及藥用價值于一身，綜合利用價值很高。南京椴資源的開發(fā)利用正日益受到重視[1]，但其苗木繁殖比較困難，資源不充足，目前種子繁殖仍是其最常用的繁殖方式之一。研究表明，南京椴種子飽滿程度各不相同，又具有深度休眠特性[2]，持續(xù)可達(dá)2～3年甚至更久，因此無法通過發(fā)芽率試驗判斷種子質(zhì)量的優(yōu)劣。種子生活力是指種子發(fā)芽的潛在能力和種胚具有的生命活力，是判定種子質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)之一[3]，其中TTC法測定種子生活力已成為國際通用種子檢測方法[4]，適用于絕大多數(shù)種子，具有快速、有效、準(zhǔn)確的特點[5]，但在南京椴種子生活力測定中的應(yīng)用研究目前尚少見報導(dǎo)。另一方面，南京椴種子由于種皮致密堅硬、透水性差，即使在溫水中浸泡一周仍然堅硬，很難切取種胚進(jìn)行生活力測定，這是TTC法快速測定南京椴種子生活力時需要解決的實際問題。為此，本研究采取不同的種皮處理方式對南京椴種子TTC染色活力進(jìn)行了測定，并選擇TTC濃度、染色溫度與染色時間三因素進(jìn)行了正交試驗，以優(yōu)化TTC法快速測定南京椴種子生活力的技術(shù)條件，為南京椴種子質(zhì)量鑒定與種苗生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的南京椴果實在泥炭土∶蛭石∶黃沙=1∶1∶1的基質(zhì)中層積催芽4個月，取出果實清洗干凈后，用錘子輕擊果實、剝?nèi)ス?，取出完整種子用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1種皮處理

選取外觀完好的南京椴種子，分4種方法對種皮進(jìn)行處理： 1) 使用解剖刀小心剝?nèi)シN皮(去皮處理)； 2) 在種子側(cè)面小心切出一個缺口，露出胚乳(切刻處理)； 3) 使用錘子輕擊種皮至產(chǎn)生一道裂口(裂口處理)； 4) 種子種皮不做任何處理、直接浸漬于蒸餾水(對照組)。每個試驗區(qū)均設(shè)置3個重復(fù)，每次取種子15粒。

1.2.2種子浸漬處理

將上述4種不同種皮處理的南京椴種子浸漬于蒸餾水，置室溫下使其充分吸水。其中，對照組種子浸種過夜后，種皮仍很堅硬，無法用解剖刀切開，表明種胚尚未充分吸水；持續(xù)浸種10 d后可用解剖刀進(jìn)行縱切，表明種胚及胚乳已充分吸水。其余各處理區(qū)種子浸種過夜后均充分吸脹。

1.3 TTC染色

將浸泡吸水完全的南京椴種子在鋪有吸水紙的硬板上，用解剖刀沿縱向?qū)⒎N胚中央切開，取出有種胚的一半放于培養(yǎng)皿中，倒入濃度為0.15%的TTC染液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，浸沒種子，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗條件下染色40 min。

各個試驗區(qū)的種子染色結(jié)束后，取出種子立即用清水清洗，觀察染色情況。其中，種胚全部被染為紅色與淡紅色，或者胚軸染成淡紅色、且胚頂端或兩端被染成紅色的即判定為有生活力的種子。

1.4 正交試驗設(shè)計

在上述試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取TTC濃度、染色溫度和染色時間作為影響種子生活力測定準(zhǔn)確性的主要因素，設(shè)計L9(33)正交試驗(表1)，進(jìn)一步優(yōu)化南京椴種子TTC染色檢測方法。

表1 南京椴種子生活力測定條件正交試驗的因素和水平

1.5 調(diào)查項目及數(shù)據(jù)處理

種子飽滿度(%)=(獲得種子個數(shù)/供試果實個數(shù))×100%；

種子生活力(%)=(有生活力的種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

采用SPSS 23軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，判斷各種皮處理組之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 南京椴成熟果實的種子飽滿度調(diào)查

供試南京椴果實經(jīng)層積催芽后，取出清洗干凈、記錄所取果實數(shù)，并用錘子輕擊果實，剝?nèi)ス?，取出的種子按單粒(果實發(fā)育1個完整飽滿種子)與復(fù)粒(果實發(fā)育2個完整飽滿種子)、飽滿與空癟(果實未發(fā)育成完整飽滿種子)等不同情況進(jìn)行調(diào)查，分析種子飽滿度情況，結(jié)果如表2所示，三批果實的種子飽滿度平均為64.7%?？梢姡┰嚨哪暇╅补麑嵲趯臃e催芽4個月后其種子飽滿度并不高。

表2 供試果實的種子飽滿度

2.2 種皮不同處理對南京椴種子生活力測定結(jié)果的影響

由表3可見，未處理對照組的種子不但需要長時間浸種，且種子生活力也較低，僅31.1%，很難準(zhǔn)確判定種子生活力的實際情況；去皮處理組由于種皮堅硬，去皮處理難度很大，耗時耗力，種子生活力僅為20.0%，顯然也不能準(zhǔn)確判定種子生活力的情況；與此相比，切刻處理組與裂口處理組測得的種子生活力較高，分別為80.0%與64.4%，兩者的處理效果無顯著差異，但與另外兩組的處理結(jié)果之間的差異顯著。

表3 南京椴種皮不同預(yù)處理種子生活力測定結(jié)果

2.3 南京椴種子生活力TTC測定方法的優(yōu)化

南京椴種子經(jīng)種皮不同處理后，在染色試驗過程中普遍出現(xiàn)染色較淺的現(xiàn)象；推測可能與TTC染色效果的影響因素有關(guān)。為此，在分析前人研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇TTC染色液濃度、染色溫度及染色時間3個主要因素進(jìn)行了正交試驗，以優(yōu)化TTC染色法的技術(shù)參數(shù)，結(jié)果如圖1和表4所示。

表4 南京椴種子TTC速測法的正交試驗結(jié)果

在不同因素與水平組合處理下，南京椴種子生活力介于76.7%～96.7%之間，存在較大差異，其中以0.2%TTC、40 ℃、染色2 h條件下種子生活力最高，染色效果也最好(圖1)，明顯優(yōu)于其他處理組合；而組合0.1%TTC、30 ℃、染色1 h條件下種子生活力最低，染色較淺，效果較差(表4)。

注：A為染色條件為0.15%TTC、30 ℃、染色1 h，染色較淺； B為優(yōu)化處理Ⅴ，染色條件為0.15%TTC、30 ℃、染色2 h；C為優(yōu)化處理Ⅶ，染色條件為0.2%TTC、40 ℃、染色2 h。

方差分析結(jié)果(表5)表明，3個因素中，染色溫度和染色時間對生活力測定具有顯著影響(p<0.05)，TTC濃度對生活力測定影響不顯著(p>0.05)。三者對南京椴生活力的影響程度從大到小依次為：染色時間、染色溫度、TTC濃度。

表5 南京椴種子生活力測定正交試驗的方差分析結(jié)果

3 討 論

種子生活力對于快速檢驗植物種子的質(zhì)量具有重要指導(dǎo)意義[6]，但因南京椴種皮堅硬、透水性差，很難快速、準(zhǔn)確判斷其種子生活力。為此，本研究首先調(diào)查了4種不同的種皮處理方式對種子生活力測定的影響，發(fā)現(xiàn)種皮不同預(yù)處理方法對種子染色速度和生活力測定值具有顯著影響，其中未處理對照組的種子短期內(nèi)很難充分吸脹，導(dǎo)致種子生活力測定的結(jié)果不夠準(zhǔn)確，去皮處理浸種12～15 h后，種子活力明顯偏低，也不能作為判斷的依據(jù)，且去皮處理費時費力；而裂口處理或切刻處理進(jìn)行浸泡不僅處理相對簡單、浸泡時間大大縮短，結(jié)果也相對準(zhǔn)確。尤其是切刻處理方法能確保種胚完整不受損傷，結(jié)果準(zhǔn)確，可以認(rèn)為這是快速、準(zhǔn)確測定南京椴種子生活力的有效處理方法之一。

染色濃度、染色溫度以及染色時間是TTC法快速測定種子生活力的主要影響因素[7]。本研究采用正交試驗方法，篩選南京椴種子生活力TTC測定的適宜條件。結(jié)果表明，隨著染色濃度、染色時間與染色溫度的優(yōu)化，TTC法可以快速、準(zhǔn)確地測定南京椴種子生活力。其中采用0.2%TTC、染色溫度40 ℃、染色時間2 h組合處理時，其種胚染色效果較好，表現(xiàn)為染色程度較深，種子生活力高達(dá)96.7%，可以認(rèn)為這是南京椴種子生活力TTC速測法的優(yōu)化條件。

采用TTC速測法獲得的南京椴種子生活力并不低，明顯高于實際生產(chǎn)中的發(fā)芽率，這是因為南京椴果實的種子飽滿度各不相同，有的果實內(nèi)沒有發(fā)育完全的種胚(空癟種子)，有的因?qū)臃e催芽持續(xù)時間較長而霉?fàn)€變質(zhì)。另一方面，南京椴種子自身存在的機(jī)械障礙和胚乳中含有抑制萌發(fā)的物質(zhì)[8-9]，使得種子成熟后早期的發(fā)芽率較低。因此，本研究的南京椴種子生活力TTC速測法雖然具有快速、簡便、準(zhǔn)確等優(yōu)點，可用于評估南京椴種子的潛在發(fā)芽能力，但同時還需要考慮層積催芽方法對發(fā)芽率的影響，將兩者結(jié)合起來可更好地應(yīng)用于播種育苗生產(chǎn)。