液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法鑒別驢肉真?zhèn)?/h1>
2021-01-15 05:53:52張穎穎李瑩瑩李石磊李慧晨王守偉
中國食品學報 2020年12期
張穎穎，李瑩瑩，李石磊，郭 超，李慧晨，王守偉
（中國肉類食品綜合研究中心 北京100068）
驢肉不僅肉質(zhì)紅嫩、纖維細膩[1]、口感勁道，而且蛋白質(zhì)含量高，必需氨基酸種類豐富，其氨基酸總量高于日常食用的豬肉、牛肉、羊肉等，能為人類提供豐富的優(yōu)質(zhì)動物源性蛋白資源[2]。除此之外，驢肉中的脂肪含量較低，并且多不飽和脂肪酸含量高于其它畜禽肉，能夠更好地滿足人體的營養(yǎng)需求[3]，因此驢肉更適宜高血壓、肥胖癥、動脈硬化患者及老年人等人群食用[4]。然而，由于驢的生長周期較長，資源相對匱乏，導致驢肉價格不斷攀升。不法商販為謀取不正當利益，常使用較為廉價的肉代替驢肉生產(chǎn)銷售。畜肉中牛肉和羊肉的價格較高，而禽肉的肉質(zhì)、色澤及口感與驢肉相差較大，因此驢肉中常被摻入豬肉和馬肉，這種行為不僅欺騙消費者，損害消費者利益，而且不利于市場公正。
目前，測定驢肉摻假的方法主要包括基于形態(tài)學、代謝物、核酸及蛋白質(zhì)的檢測方法。形態(tài)學方法是通過觀察外貌及辨別氣味對肉的品種及品質(zhì)進行鑒定[5]，該方法受主觀影響較大，操作繁瑣費時，偏差較大[6]?；诖x物的檢測方法是通過測定肉中的小分子化合物，如糖、脂肪酸、氨基酸等進行鑒定，主要包括近紅外光譜法[4，7-8]、高效液相色譜法[9-11]等。由于代謝物易受到生長環(huán)境、年齡、肉制品的加工條件等外界因素的影響，因此在鑒定準確性方面有待進一步提升。聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)可通過測定基因序列鑒定物種，其準確性高，靈敏度強，是目前測定摻假的主要方法，也是現(xiàn)行國家及行業(yè)標準[12]指定的檢測方法，目前常用種特異性PCR 技術(shù)[13]、限制性片段長度多態(tài)性PCR 技術(shù)[14-15]、熒光定量PCR 技術(shù)[16-18]、多重PCR 技術(shù)[19]、DNA 條形碼[20]等。然而，PCR 技術(shù)也存在一定的問題，如易受復雜基質(zhì)的干擾[21]，加工過程中易降解[22-23]等?；诘鞍踪|(zhì)的檢測方法主要是對不同物種間的特異性蛋白質(zhì)進行測定，有電泳法[24]、免疫法[25]等。然而，蛋白質(zhì)較易發(fā)生變性，且物種之間易發(fā)生交叉污染，因此通過測定蛋白質(zhì)來鑒定物種的應(yīng)用越來越少。隨著蛋白質(zhì)組學的快速發(fā)展，在食品摻假方面的應(yīng)用也越來越廣，主要以物種的特異性肽段作為生物標志物進行鑒別[26-29]。肽段是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，在熱加工過程中比DNA 更穩(wěn)定[30]，在深加工肉制品方面具有不可比擬的優(yōu)勢，并且其前處理較為簡便，可同時測定多個物種。
本研究基于蛋白質(zhì)組學理論，針對當前惡意混入豬肉和馬肉的驢肉摻假問題，采用高分辨質(zhì)譜進行數(shù)據(jù)采集及分析，建立主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）數(shù)據(jù)模型，并分別篩選馬、驢、豬的特異性多肽鏈，建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid chromatography -tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鑒別驢肉摻假的方法。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
胰蛋白酶（測序級）及二硫蘇糖醇（DTT）（生化級），美國Promega 公司；甲酸、乙酸（HAC）、乙腈（ACN）（色譜純級），德國Merck 公司；碘乙酰胺（IAA）、三氟乙酸（TFA）（生化級），美國Sigma 公司；HLB 固相萃取柱，美國Waters 公司；尿素、硫脲、鹽酸（分析純級），上海國藥集團化學試劑有限公司。
生鮮豬肉、驢肉和馬肉均來自屠宰場，市售驢肉及其制品均購買于當?shù)夭耸袌?、超市、便利店或餐館。
1.2 儀器與設(shè)備
液相色譜四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)Q Exactive HF-X （配有電噴霧離子源ESI）及TSQ 超高效液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀 （配有電噴霧離子源ESI），美國Thermo 公司；固相萃取裝置，美國Agilent 公司；高速冷凍離心機，日本Hitachi 公司；氮吹儀，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。
1.3 試驗方法
1.3.1 樣品制備 通過前期的試驗摸索[31]，優(yōu)化了樣品前處理過程，包括蛋白質(zhì)提取、酶解和除鹽步驟。
蛋白質(zhì)提?。悍Q取1 g 樣品，加入5 mL 提取溶液 （0.05 mol/L Tris-HCl，7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，pH 8.0），冰水浴下均質(zhì)。用5 mL 提取溶液清洗刀頭，合并溶液，渦旋，離心（4 ℃，12 000 r/min）20 min。此過程使用高濃度尿素促使蛋白質(zhì)變性，提高其溶解度。
酶解：取適量上清液，加入DTT 溶液，渦旋（混合溶液中DTT 的濃度為5 mmol/L），56 ℃振蕩反應(yīng)1 h 還原蛋白質(zhì)多肽鏈之間的二硫鍵，打開蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，裸露酶切位點，便于后續(xù)酶解反應(yīng)。放置室溫后，加入IAA 溶液，渦旋混勻（溶液中IAA 的濃度為10 mmol/L），暗處反應(yīng)30 min 使打開的二硫鍵基團發(fā)生乙?；磻?yīng)，避免二硫鍵再次形成。加入DTT 溶液（終濃度為5 mmol/L），暗處反應(yīng)15 min 去掉多余的IAA，避免影響后續(xù)酶切反應(yīng)。加入5～6 倍溶液體積的緩沖液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）稀釋尿素的濃度，避免高濃度的尿素使蛋白酶變性。按照蛋白質(zhì)∶胰蛋白酶=50∶1（質(zhì)量比）的比例加入胰蛋白酶溶液，調(diào)節(jié)pH 值為8.0，37 ℃過夜反應(yīng)。
除鹽：放置室溫后，用0.5% TFA 調(diào)節(jié)pH ＜2，終止酶解反應(yīng)。依次用乙腈、乙腈∶水=1∶1（體積比）溶液、0.1% TFA 活化HLB 固相萃取柱，上樣后依次用3 mL 0.1% TFA，2 mL 0.5% HAC 淋洗，采用2 mL ACN∶0.5% HAC=3∶2 （體積比）的混合液洗脫，過0.22 μm 濾膜，備用。
1.3.2 高分辨液-質(zhì)聯(lián)用儀（LC-QE）
1.3.2.1 儀器條件 色譜條件：色譜柱Hypersil GOLD C18 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃，進樣量5 μL；流動相及梯度洗脫程序見表1。
表1 LC-QE 流動相及梯度洗脫程序Table 1 LC-QE mobile phase and gradient elution program
質(zhì)譜條件：噴霧電壓3 400 V，毛細管溫度320℃，鞘氣流速40 Arb，輔助流速15 Arb，全掃描分辨率120 000，掃描質(zhì)量范圍為350～2 000，自動增益值為3×106，注入時間為100 ms，二級掃描，topN為10，分辨率為30 000，AGC 值為2×105，IT 時間為50 ms，碰撞能量為30 eV。
1.3.2.2 數(shù)據(jù)分析 用蛋白質(zhì)組學處理軟件Proteome Discoverer 軟件（Thermo）對高分辨質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)進行非標記定量分析，檢索數(shù)據(jù)庫為Uniprot 全庫，最多漏切位點設(shè)為2，每個多肽最大平均修飾為3，可變修飾為氧化，Oxidation （蛋氨酸，Methionine），乙?；?，Acetylation （蛋白N端，Protein N-term），固定修飾為氨甲酰甲基，Carbamidomethyl （半胱氨酸，Cysteinine），母離子質(zhì)量偏差為10×10-6，多肽最小長度為7，其它參數(shù)為默認值。
采用悟空數(shù)據(jù)分析平臺（https：//www.omicsolution.org/wu-kong-beta-linux/main/）對Proteome Discoverer 軟件處理的數(shù)據(jù)進行主成分分析，利用Origin 軟件作圖。
1.3.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）
1.3.3.1 儀器條件 色譜條件：色譜柱Hypersil GOLD C18 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃，進樣量20 μL；流動相及梯度洗脫程序與LC-QE 的過程一致，詳見表1。
質(zhì)譜條件：噴霧電壓3 500 V；鞘氣38 Arb；輔氣15 Arb；離子傳輸管溫度275 ℃；離子源霧化溫度380 ℃；采集周期為1.0 s；碰撞氣壓力為1.5 mTorr；Q1 和Q3 分辨率都為0.7。
1.3.3.2 數(shù)據(jù)分析 通過Proteome Discoverer 軟件找出驢肉、豬肉及馬肉的專屬性多肽鏈，并通過查看二級碎裂譜圖，篩選每個多肽鏈的母離子與子離子信息，轉(zhuǎn)換為適于LC-MS/MS 的質(zhì)譜采集方法。將該采集方法導入LC-MS/MS 中，對驢肉、豬肉及馬肉分別進行多反應(yīng)監(jiān)測模式 （MRM）掃描，通過對比每組離子對的保留時間、響應(yīng)強度等信息，對每個物種的特異性離子對進行篩查，以確定定性及定量離子對，離子對信息見表2。
本研究的試驗流程圖如圖1所示。
圖1 試驗流程圖Fig.1 Experimental flow chart
表2 驢肉、豬肉及馬肉MRM 采集參數(shù)Table 2 MRM parameters of donkey，pig and horse
2 結(jié)果與分析
2.1 專屬性多肽鏈的篩選
采用高分辨的全掃描結(jié)合ddMS2的掃描模式，對樣品溶液進行數(shù)據(jù)采集。將采集數(shù)據(jù)導入Proteome Discoverer 軟件中，結(jié)合Uniprot 數(shù)據(jù)庫，進行非標記定量分析，最終共檢索到匹配多肽12 047 條。對各個物種的特異性參數(shù)進行設(shè)置，即篩選一個物種的多肽時，可信度設(shè)置為高，其它物種均設(shè)置為未檢出，經(jīng)篩選之后，共得到552 條多肽，因此通過特異性參數(shù)設(shè)置后，可以刪除90%不符合的多肽信息。各個物種的專屬性多肽應(yīng)來自本物種自身含有的蛋白質(zhì)，而部分多肽并非來源于該物種本身的蛋白質(zhì)，而來自于其它物種，這主要是由于各個物種所含的蛋白質(zhì)的種類大體相同，而其中的部分肽段存有差異，在搜庫的過程中，會存在物種匹配錯誤的情況，因此還需剔除錯誤數(shù)據(jù)。此外，通過定量數(shù)據(jù)可以判定多肽在儀器中的響應(yīng)強度，可通過設(shè)置響應(yīng)強度參數(shù)進一步篩選物種專屬性多肽。最終篩選出50 條馬的專屬性多肽鏈、48 條驢的專屬性多肽鏈、50 條豬的專屬性多肽鏈，分析每個多肽的二級譜圖，通過響應(yīng)值強度，確定每個多肽的母離子及子離子。
LC-MS/MS 采用MRM 掃描模式對化合物進行測定，通過二級子離子進行定性及定量，因此基質(zhì)干擾小，準確性高，并且LC-MS/MS 的普及度高，更適用于日常的食品檢測。但LC-MS/MS 的分辨率較LC-QE 低，因此將LC-QE 中篩選的多肽的母離子與子離子信息導入至LC-MS/MS 后，還需通過離子響應(yīng)強度、峰形、基質(zhì)干擾、豐度信息等，進一步篩選適合應(yīng)用至LC-MS/MS 中的多肽及其離子對信息，最終篩選了豬、驢、馬的專屬性多肽各3 條，詳細信息見表3，離子對信息見表2，圖2分別為多肽驢_1、豬_1 與馬_1 的3 個子離子的選擇離子流圖。
2.2 方法靈敏度及準確度
由2.1 節(jié)所得物種專屬性多肽鏈是從純生鮮肉中篩選出的，雖然多肽在熱加工處理過程中比DNA 的穩(wěn)定性更強，但是不同的熱加工處理方式會影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)，進而影響樣品前處理過程中的酶解效率，從而影響多肽的響應(yīng)，因此還需對不同熱加工處理的肉制品進行驗證。
為了驗證該方法的準確度，將豬肉、馬肉按照質(zhì)量比10%摻入驢肉中，并根據(jù)不同生產(chǎn)工藝進行不同熱處理，分別為78 ℃加熱、100 ℃加熱、121℃高壓滅菌、燒烤。將熱處理后的樣品按照本文建立的方法進行樣品制備及LC-MS/MS 數(shù)據(jù)采集，結(jié)果如圖3a 所示，豬、馬、驢3 個物種的3 條專屬性多肽鏈全部檢出，證明該方法對生鮮肉及不同加工方式的肉制品均有良好的準確度。
為了測定該方法的靈敏度，將豬肉、馬肉按照質(zhì)量比0.5%摻入驢肉中，進行樣品處理及數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖3b 所示，豬與馬的3 條專屬性多肽鏈均檢出，證明該方法可以測定0.5%的摻假比例，而一般認為食品中1%以下的摻假不屬于人為惡意摻假[32]，因此該方法的靈敏度完全滿足食品摻假檢測要求。
表3 豬、馬、驢的多肽信息Table 3 The peptide information of pig，horse and donkey
圖2 驢肉、豬肉與馬肉選擇離子流圖Fig.2 MRM chromatograms of donkey，pig and horse
圖3 摻假試驗提取離子流圖Fig.3 MRM chromatograms of adulteration test
2.3 實際樣品測定
根據(jù)本試驗的前處理方法及儀器條件，對從當?shù)夭煌牟耸袌觥⒊?、便利店、餐館中購買的生鮮驢肉及驢肉制品，包括驢肉火燒、五香驢肉、醬汁驢肉、醬鹵驢肉、驢肉干等，進行樣品分析，最終在一驢肉制品（五香驢肉）中檢出馬的專屬性多肽，可判定該食品中摻入了馬肉，其色譜圖如圖4所示；將該樣品用PCR 進行測定，其結(jié)果與LCMS/MS 方法一致。而其它食品未檢測出豬、馬成分。
圖4 樣品的提取離子流圖Fig.4 MRM chromatograms of sample
2.4 主成分分析
將通過特異性參數(shù)設(shè)置后所篩選出來的552多肽的定量信息提取出來，進行主成分分析（PCA），由碎石圖（圖5a）可知，第1 主成分的方差貢獻率為83.3%，第2 主成分的方差貢獻率為10.7%，2 個主成分的累積貢獻率為94%，說明這2 個主成分能夠充分的表示3 個物種的多肽信息。由此繪制二維主成分分析圖，結(jié)果如圖5b 所示。從中可以看出，3 個物種能夠完全區(qū)分，之間互不干擾。
為判定該模型的準確性，將2.3 節(jié)實際樣品中的3 個樣品溶液進行高分辨數(shù)據(jù)采集及分析，分析結(jié)果如圖5b 中綠色五角星所示。其中樣品2與樣品3 處于驢的分布區(qū)，由此判定樣品2 與樣品3 為驢肉；而樣品1 處于驢和馬的分布區(qū)的中間位置，判定其含有驢肉和馬肉。該結(jié)果與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法所得到的結(jié)果一致，也進一步證明了該模型的準確性。
圖5 驢肉、豬肉與馬肉的主成分分析碎石圖（a）與PCA 分析圖（b）Fig.5 Scree plot （a）and PCA （b）of donkey，pig and horse
3 結(jié)論
本研究建立了測定摻假驢肉的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。利用高分辨質(zhì)譜進行數(shù)據(jù)采集，通過Proteome Discoverer 軟件進行非標記定量分析，通過參數(shù)設(shè)置，用篩選的數(shù)據(jù)創(chuàng)建了PCA 分析圖，并進行了方法驗證；此外通過參數(shù)設(shè)置進一步篩選了豬、驢、馬的專屬性多肽鏈，轉(zhuǎn)換為特異性離子對信息，導入LC-MS/MS 中，創(chuàng)建了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，最低可測定0.5%的摻假比例，該方法操作簡便，可同時測定多個物種，靈敏度高，準確可靠，可用于日常食品檢測。
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目前，測定驢肉摻假的方法主要包括基于形態(tài)學、代謝物、核酸及蛋白質(zhì)的檢測方法。形態(tài)學方法是通過觀察外貌及辨別氣味對肉的品種及品質(zhì)進行鑒定[5]，該方法受主觀影響較大，操作繁瑣費時，偏差較大[6]?；诖x物的檢測方法是通過測定肉中的小分子化合物，如糖、脂肪酸、氨基酸等進行鑒定，主要包括近紅外光譜法[4，7-8]、高效液相色譜法[9-11]等。由于代謝物易受到生長環(huán)境、年齡、肉制品的加工條件等外界因素的影響，因此在鑒定準確性方面有待進一步提升。聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)可通過測定基因序列鑒定物種，其準確性高，靈敏度強，是目前測定摻假的主要方法，也是現(xiàn)行國家及行業(yè)標準[12]指定的檢測方法，目前常用種特異性PCR 技術(shù)[13]、限制性片段長度多態(tài)性PCR 技術(shù)[14-15]、熒光定量PCR 技術(shù)[16-18]、多重PCR 技術(shù)[19]、DNA 條形碼[20]等。然而，PCR 技術(shù)也存在一定的問題，如易受復雜基質(zhì)的干擾[21]，加工過程中易降解[22-23]等?；诘鞍踪|(zhì)的檢測方法主要是對不同物種間的特異性蛋白質(zhì)進行測定，有電泳法[24]、免疫法[25]等。然而，蛋白質(zhì)較易發(fā)生變性，且物種之間易發(fā)生交叉污染，因此通過測定蛋白質(zhì)來鑒定物種的應(yīng)用越來越少。隨著蛋白質(zhì)組學的快速發(fā)展，在食品摻假方面的應(yīng)用也越來越廣，主要以物種的特異性肽段作為生物標志物進行鑒別[26-29]。肽段是蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，在熱加工過程中比DNA 更穩(wěn)定[30]，在深加工肉制品方面具有不可比擬的優(yōu)勢，并且其前處理較為簡便，可同時測定多個物種。
本研究基于蛋白質(zhì)組學理論，針對當前惡意混入豬肉和馬肉的驢肉摻假問題，采用高分辨質(zhì)譜進行數(shù)據(jù)采集及分析，建立主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）數(shù)據(jù)模型，并分別篩選馬、驢、豬的特異性多肽鏈，建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Liquid chromatography -tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）鑒別驢肉摻假的方法。
1 材料與方法
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生鮮豬肉、驢肉和馬肉均來自屠宰場，市售驢肉及其制品均購買于當?shù)夭耸袌?、超市、便利店或餐館。
1.2 儀器與設(shè)備
液相色譜四極桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)Q Exactive HF-X （配有電噴霧離子源ESI）及TSQ 超高效液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀 （配有電噴霧離子源ESI），美國Thermo 公司；固相萃取裝置，美國Agilent 公司；高速冷凍離心機，日本Hitachi 公司；氮吹儀，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。
1.3 試驗方法
1.3.1 樣品制備 通過前期的試驗摸索[31]，優(yōu)化了樣品前處理過程，包括蛋白質(zhì)提取、酶解和除鹽步驟。
蛋白質(zhì)提?。悍Q取1 g 樣品，加入5 mL 提取溶液 （0.05 mol/L Tris-HCl，7 mol/L 尿素，2 mol/L硫脲，pH 8.0），冰水浴下均質(zhì)。用5 mL 提取溶液清洗刀頭，合并溶液，渦旋，離心（4 ℃，12 000 r/min）20 min。此過程使用高濃度尿素促使蛋白質(zhì)變性，提高其溶解度。
酶解：取適量上清液，加入DTT 溶液，渦旋（混合溶液中DTT 的濃度為5 mmol/L），56 ℃振蕩反應(yīng)1 h 還原蛋白質(zhì)多肽鏈之間的二硫鍵，打開蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，裸露酶切位點，便于后續(xù)酶解反應(yīng)。放置室溫后，加入IAA 溶液，渦旋混勻（溶液中IAA 的濃度為10 mmol/L），暗處反應(yīng)30 min 使打開的二硫鍵基團發(fā)生乙?；磻?yīng)，避免二硫鍵再次形成。加入DTT 溶液（終濃度為5 mmol/L），暗處反應(yīng)15 min 去掉多余的IAA，避免影響后續(xù)酶切反應(yīng)。加入5～6 倍溶液體積的緩沖液（25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）稀釋尿素的濃度，避免高濃度的尿素使蛋白酶變性。按照蛋白質(zhì)∶胰蛋白酶=50∶1（質(zhì)量比）的比例加入胰蛋白酶溶液，調(diào)節(jié)pH 值為8.0，37 ℃過夜反應(yīng)。
除鹽：放置室溫后，用0.5% TFA 調(diào)節(jié)pH ＜2，終止酶解反應(yīng)。依次用乙腈、乙腈∶水=1∶1（體積比）溶液、0.1% TFA 活化HLB 固相萃取柱，上樣后依次用3 mL 0.1% TFA，2 mL 0.5% HAC 淋洗，采用2 mL ACN∶0.5% HAC=3∶2 （體積比）的混合液洗脫，過0.22 μm 濾膜，備用。
1.3.2 高分辨液-質(zhì)聯(lián)用儀（LC-QE）
1.3.2.1 儀器條件 色譜條件：色譜柱Hypersil GOLD C18 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃，進樣量5 μL；流動相及梯度洗脫程序見表1。
表1 LC-QE 流動相及梯度洗脫程序Table 1 LC-QE mobile phase and gradient elution program
質(zhì)譜條件：噴霧電壓3 400 V，毛細管溫度320℃，鞘氣流速40 Arb，輔助流速15 Arb，全掃描分辨率120 000，掃描質(zhì)量范圍為350～2 000，自動增益值為3×106，注入時間為100 ms，二級掃描，topN為10，分辨率為30 000，AGC 值為2×105，IT 時間為50 ms，碰撞能量為30 eV。
1.3.2.2 數(shù)據(jù)分析 用蛋白質(zhì)組學處理軟件Proteome Discoverer 軟件（Thermo）對高分辨質(zhì)譜采集的數(shù)據(jù)進行非標記定量分析，檢索數(shù)據(jù)庫為Uniprot 全庫，最多漏切位點設(shè)為2，每個多肽最大平均修飾為3，可變修飾為氧化，Oxidation （蛋氨酸，Methionine），乙?；?，Acetylation （蛋白N端，Protein N-term），固定修飾為氨甲酰甲基，Carbamidomethyl （半胱氨酸，Cysteinine），母離子質(zhì)量偏差為10×10-6，多肽最小長度為7，其它參數(shù)為默認值。
采用悟空數(shù)據(jù)分析平臺（https：//www.omicsolution.org/wu-kong-beta-linux/main/）對Proteome Discoverer 軟件處理的數(shù)據(jù)進行主成分分析，利用Origin 軟件作圖。
1.3.3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）
1.3.3.1 儀器條件 色譜條件：色譜柱Hypersil GOLD C18 （2.1 mm×100 mm，1.9 μm）；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃，進樣量20 μL；流動相及梯度洗脫程序與LC-QE 的過程一致，詳見表1。
質(zhì)譜條件：噴霧電壓3 500 V；鞘氣38 Arb；輔氣15 Arb；離子傳輸管溫度275 ℃；離子源霧化溫度380 ℃；采集周期為1.0 s；碰撞氣壓力為1.5 mTorr；Q1 和Q3 分辨率都為0.7。
1.3.3.2 數(shù)據(jù)分析 通過Proteome Discoverer 軟件找出驢肉、豬肉及馬肉的專屬性多肽鏈，并通過查看二級碎裂譜圖，篩選每個多肽鏈的母離子與子離子信息，轉(zhuǎn)換為適于LC-MS/MS 的質(zhì)譜采集方法。將該采集方法導入LC-MS/MS 中，對驢肉、豬肉及馬肉分別進行多反應(yīng)監(jiān)測模式 （MRM）掃描，通過對比每組離子對的保留時間、響應(yīng)強度等信息，對每個物種的特異性離子對進行篩查，以確定定性及定量離子對，離子對信息見表2。
本研究的試驗流程圖如圖1所示。
圖1 試驗流程圖Fig.1 Experimental flow chart
表2 驢肉、豬肉及馬肉MRM 采集參數(shù)Table 2 MRM parameters of donkey，pig and horse
2 結(jié)果與分析
2.1 專屬性多肽鏈的篩選
采用高分辨的全掃描結(jié)合ddMS2的掃描模式，對樣品溶液進行數(shù)據(jù)采集。將采集數(shù)據(jù)導入Proteome Discoverer 軟件中，結(jié)合Uniprot 數(shù)據(jù)庫，進行非標記定量分析，最終共檢索到匹配多肽12 047 條。對各個物種的特異性參數(shù)進行設(shè)置，即篩選一個物種的多肽時，可信度設(shè)置為高，其它物種均設(shè)置為未檢出，經(jīng)篩選之后，共得到552 條多肽，因此通過特異性參數(shù)設(shè)置后，可以刪除90%不符合的多肽信息。各個物種的專屬性多肽應(yīng)來自本物種自身含有的蛋白質(zhì)，而部分多肽并非來源于該物種本身的蛋白質(zhì)，而來自于其它物種，這主要是由于各個物種所含的蛋白質(zhì)的種類大體相同，而其中的部分肽段存有差異，在搜庫的過程中，會存在物種匹配錯誤的情況，因此還需剔除錯誤數(shù)據(jù)。此外，通過定量數(shù)據(jù)可以判定多肽在儀器中的響應(yīng)強度，可通過設(shè)置響應(yīng)強度參數(shù)進一步篩選物種專屬性多肽。最終篩選出50 條馬的專屬性多肽鏈、48 條驢的專屬性多肽鏈、50 條豬的專屬性多肽鏈，分析每個多肽的二級譜圖，通過響應(yīng)值強度，確定每個多肽的母離子及子離子。
LC-MS/MS 采用MRM 掃描模式對化合物進行測定，通過二級子離子進行定性及定量，因此基質(zhì)干擾小，準確性高，并且LC-MS/MS 的普及度高，更適用于日常的食品檢測。但LC-MS/MS 的分辨率較LC-QE 低，因此將LC-QE 中篩選的多肽的母離子與子離子信息導入至LC-MS/MS 后，還需通過離子響應(yīng)強度、峰形、基質(zhì)干擾、豐度信息等，進一步篩選適合應(yīng)用至LC-MS/MS 中的多肽及其離子對信息，最終篩選了豬、驢、馬的專屬性多肽各3 條，詳細信息見表3，離子對信息見表2，圖2分別為多肽驢_1、豬_1 與馬_1 的3 個子離子的選擇離子流圖。
2.2 方法靈敏度及準確度
由2.1 節(jié)所得物種專屬性多肽鏈是從純生鮮肉中篩選出的，雖然多肽在熱加工處理過程中比DNA 的穩(wěn)定性更強，但是不同的熱加工處理方式會影響蛋白質(zhì)的性質(zhì)及結(jié)構(gòu)，進而影響樣品前處理過程中的酶解效率，從而影響多肽的響應(yīng)，因此還需對不同熱加工處理的肉制品進行驗證。
為了驗證該方法的準確度，將豬肉、馬肉按照質(zhì)量比10%摻入驢肉中，并根據(jù)不同生產(chǎn)工藝進行不同熱處理，分別為78 ℃加熱、100 ℃加熱、121℃高壓滅菌、燒烤。將熱處理后的樣品按照本文建立的方法進行樣品制備及LC-MS/MS 數(shù)據(jù)采集，結(jié)果如圖3a 所示，豬、馬、驢3 個物種的3 條專屬性多肽鏈全部檢出，證明該方法對生鮮肉及不同加工方式的肉制品均有良好的準確度。
為了測定該方法的靈敏度，將豬肉、馬肉按照質(zhì)量比0.5%摻入驢肉中，進行樣品處理及數(shù)據(jù)分析，結(jié)果如圖3b 所示，豬與馬的3 條專屬性多肽鏈均檢出，證明該方法可以測定0.5%的摻假比例，而一般認為食品中1%以下的摻假不屬于人為惡意摻假[32]，因此該方法的靈敏度完全滿足食品摻假檢測要求。
表3 豬、馬、驢的多肽信息Table 3 The peptide information of pig，horse and donkey
圖2 驢肉、豬肉與馬肉選擇離子流圖Fig.2 MRM chromatograms of donkey，pig and horse
圖3 摻假試驗提取離子流圖Fig.3 MRM chromatograms of adulteration test
2.3 實際樣品測定
根據(jù)本試驗的前處理方法及儀器條件，對從當?shù)夭煌牟耸袌觥⒊?、便利店、餐館中購買的生鮮驢肉及驢肉制品，包括驢肉火燒、五香驢肉、醬汁驢肉、醬鹵驢肉、驢肉干等，進行樣品分析，最終在一驢肉制品（五香驢肉）中檢出馬的專屬性多肽，可判定該食品中摻入了馬肉，其色譜圖如圖4所示；將該樣品用PCR 進行測定，其結(jié)果與LCMS/MS 方法一致。而其它食品未檢測出豬、馬成分。
圖4 樣品的提取離子流圖Fig.4 MRM chromatograms of sample
2.4 主成分分析
將通過特異性參數(shù)設(shè)置后所篩選出來的552多肽的定量信息提取出來，進行主成分分析（PCA），由碎石圖（圖5a）可知，第1 主成分的方差貢獻率為83.3%，第2 主成分的方差貢獻率為10.7%，2 個主成分的累積貢獻率為94%，說明這2 個主成分能夠充分的表示3 個物種的多肽信息。由此繪制二維主成分分析圖，結(jié)果如圖5b 所示。從中可以看出，3 個物種能夠完全區(qū)分，之間互不干擾。
為判定該模型的準確性，將2.3 節(jié)實際樣品中的3 個樣品溶液進行高分辨數(shù)據(jù)采集及分析，分析結(jié)果如圖5b 中綠色五角星所示。其中樣品2與樣品3 處于驢的分布區(qū)，由此判定樣品2 與樣品3 為驢肉；而樣品1 處于驢和馬的分布區(qū)的中間位置，判定其含有驢肉和馬肉。該結(jié)果與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法所得到的結(jié)果一致，也進一步證明了該模型的準確性。
圖5 驢肉、豬肉與馬肉的主成分分析碎石圖（a）與PCA 分析圖（b）Fig.5 Scree plot （a）and PCA （b）of donkey，pig and horse
3 結(jié)論
本研究建立了測定摻假驢肉的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。利用高分辨質(zhì)譜進行數(shù)據(jù)采集，通過Proteome Discoverer 軟件進行非標記定量分析，通過參數(shù)設(shè)置，用篩選的數(shù)據(jù)創(chuàng)建了PCA 分析圖，并進行了方法驗證；此外通過參數(shù)設(shè)置進一步篩選了豬、驢、馬的專屬性多肽鏈，轉(zhuǎn)換為特異性離子對信息，導入LC-MS/MS 中，創(chuàng)建了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，最低可測定0.5%的摻假比例，該方法操作簡便，可同時測定多個物種，靈敏度高，準確可靠，可用于日常食品檢測。
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