產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選與鑒定

王 娜，李 慧，戴伶俐，孫學(xué)穎，靳 燁，趙麗華*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010018 2 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 呼和浩特010031）

隨著居民生活水平的提高，人們的健康意識也逐漸提高，越來越重視食品安全問題。據(jù)美國疾病控制中心報(bào)道[1]：美國平均每年由食品腐敗所導(dǎo)致的疾病案例大約7 600 萬例，約5 000 人死亡，且大腸桿菌、單核增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌等食品腐敗菌的廣泛傳播危害了人類健康。在食品工業(yè)生產(chǎn)中，常加入防腐劑抑制食品中腐敗微生物的生長繁殖，以延長食品的保質(zhì)期。然而，食品防腐劑是否安全與人體健康息息相關(guān)。食品防腐劑從來源上可分為合成防腐劑和天然防腐劑。合成防腐劑在規(guī)定的劑量范圍內(nèi)使用，對人體無任何危害，然而，有的食品企業(yè)為了延長保質(zhì)期，存在過量添加防腐劑的問題，而長期過量攝取防腐劑對人體的危害極大。篩選天然、綠色防腐劑已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。由于乳酸菌素是天然微生物防腐劑，其能抑制食品中的金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特菌等致病菌的生長繁殖，且不會(huì)影響食品品質(zhì)，因此篩選產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，并大批量和產(chǎn)業(yè)化提取細(xì)菌素，對于防止食品腐敗變質(zhì)具有重要的意義，可能成為未來防腐劑的發(fā)展趨勢。

乳酸菌素[2-5]是乳酸菌在生長代謝過程中產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的肽或多肽物質(zhì)，大部分細(xì)菌素的抑菌能力主要表現(xiàn)在近源菌，然而抑菌范圍不僅僅限于相近的種，且產(chǎn)細(xì)菌素菌株本身具有免疫保護(hù)功能。1928年，Rogersl 等[6-7]發(fā)現(xiàn)Nisin，隨后國內(nèi)外的研究人員篩選產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌，至今已篩選出70 多種乳酸菌素。大量的研究表明片球菌素具有穩(wěn)定的理化特性，能抑制多種食源性致病菌的生長繁殖，尤其是單核增生李斯特菌[8]。目前，片球菌素已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，如片球菌素PA-1[9]、片球菌素SM-1[10]、戊糖片球菌素PPK34[11]、戊糖片球菌素N463[12]、戊糖片球菌素L5-6[13]、乳酸片球菌素HA-6111-2、乳酸片球菌素HA-5692-3[14]和乳酸片球菌素HW01[15]等。本研究以大腸桿菌、單核增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，從蒙古國風(fēng)干牛肉中篩選具有抑菌活性的片球菌，研究該菌的抑菌特性，為開發(fā)安全、高效的食品生物防腐劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 乳酸菌：均分離自蒙古國戈壁省市售自然風(fēng)干牛肉（2 份）；指示菌：大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、假單胞桿菌等均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要藥品及試劑 MRS 肉湯、MRS 固體培養(yǎng)基、LB 肉湯、LB 固體培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱有限責(zé)任公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，天根生化有限責(zé)任公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備 ZSB-1200IIA2 生物安全柜，南京博爾迪生物科技有限公司；PowerPac HC Power Supply 電泳儀、HE99X 電泳槽，美國伯樂公司；LRH-150 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KDC-140HR 高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的初篩 無菌稱取25 g 風(fēng)干牛肉，剪碎，置于225 mL 已滅菌的生理鹽水中，即稀釋度為10-1的樣品液，繼續(xù)10 倍遞減稀釋，分別吸取稀釋液100 μL 涂布于MRS+0.7%碳酸鈣固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，挑取有明顯鈣圈的菌落，并反復(fù)劃線，直至得到純菌株。

將乳酸菌活化2 代，用50 mL MRS 肉湯擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，將培養(yǎng)后的發(fā)酵液在4 ℃，8 000 r/min條件下離心10 min 留上清，然后用0.22 μm 水系濾菌器過濾菌株的雜質(zhì)，得到發(fā)酵上清液，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單核增生李斯特菌為指示菌進(jìn)行牛津杯抑菌試驗(yàn)。

1.2.2 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的復(fù)篩

1.2.2.1 排除酸及酸性末端產(chǎn)物試驗(yàn) 將菌株發(fā)酵液用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值至5.0，用乳酸、鹽酸、乙酸調(diào)節(jié)pH 值為5.0 的MRS 肉湯作對照組，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單核增生李斯特菌為指示菌進(jìn)行牛津杯抑菌試驗(yàn)。

1.2.2.2 排除過氧化氫試驗(yàn) 取排酸后仍能保持較強(qiáng)抑菌活性的菌株發(fā)酵液10 mL，并將pH 值調(diào)至7.0，然后加入10 mg 的過氧化氫酶，置于37 ℃的恒溫水浴鍋保溫2 h，再將pH 值調(diào)至5.0，以未處理的發(fā)酵液作對照，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單核增生李斯特菌為指示菌做牛津杯抑菌試驗(yàn)。

區(qū)塊鏈技術(shù)可以為IoT提供較強(qiáng)的安全防護(hù)。首先，區(qū)塊鏈內(nèi)生的激勵(lì)機(jī)制可以吸引更多的安全服務(wù)商加入到IoT系統(tǒng)的檢測中來，有利于形成更加系統(tǒng)權(quán)威的檢測報(bào)告；其次，區(qū)塊鏈衍生的大規(guī)模去中心化系統(tǒng)可以為IoT提供分布式信任機(jī)制，保障IoT跨域互聯(lián)互通的安全性；最后，區(qū)塊鏈自身的隱私防護(hù)特性可使得IoT智能交易更具匿名性，有效地保護(hù)用戶的隱私信息不受侵害。

1.2.2.3 蛋白酶敏感試驗(yàn) 將酸以及過氧化氫酶處理后仍能保持較強(qiáng)抑菌效果的菌株發(fā)酵液的pH 值調(diào)至胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的最適pH 值（分別為7.4，7.4，6.0，2.0），使各酶的終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，37 ℃恒溫水浴4 h，沸水5 min 使各酶的活性喪失，再將pH 值調(diào)為5.0，采用牛津杯法做抑菌試驗(yàn)，以未處理發(fā)酵液作對照[16]。

1.2.3 乳酸菌上清液中抑菌物質(zhì)對溫度及pH 的穩(wěn)定性試驗(yàn) 將菌株上清液的pH 值調(diào)至5.0，分別進(jìn)行如下處理：60，80，105 ℃條件下30 min 以及121 ℃條件下15 min，采用牛津杯法做抑菌試驗(yàn)。用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 將菌株上清液的pH 值調(diào)至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，采用牛津杯法做抑菌試驗(yàn)，同時(shí)以滅菌的MRS 肉湯作對照。

1.2.4 抑菌譜的測定 指示菌活化3 代并將菌濃度調(diào)至106CFU/mL，采用牛津杯法測定菌株發(fā)酵上清液對各指示菌的抑菌能力。

1.2.5 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌鑒定

1.2.5.1 表型鑒定 通過個(gè)體形態(tài)特征、菌落形態(tài)特征和液體形態(tài)特征等指標(biāo)進(jìn)行乳酸菌表型鑒定。

1.2.5.2 生理生化鑒定 參考文獻(xiàn)[17]，通過溫度試驗(yàn)，V-P 試驗(yàn)，產(chǎn)硫化氫試驗(yàn)，運(yùn)動(dòng)性以及糖發(fā)酵等試驗(yàn)進(jìn)行乳酸菌生理生化鑒定。

1.2.5.3 16S rDNA 鑒定 使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取乳酸菌DNA，PCR 擴(kuò)增以27F 和1492R 為引物。引物的合成和擴(kuò)增產(chǎn)物的測序均由上海生工生物有限責(zé)任公司完成。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，30 s，72 ℃，90 s，30 次循環(huán)；72 ℃，7 min。

利用NCBI 工作站進(jìn)行序列比對，利用軟件MegAlign 構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的初篩

由表1可知，菌株37X-3 和37X-13 對3 種指示菌的抑菌活性最高，因此選擇這2 株菌株進(jìn)行復(fù)篩試驗(yàn)。

表1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的初篩結(jié)果Table 1 Preliminary results of bacterioncin producing by latic acid bacteria

2.2 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的復(fù)篩

2.2.1 菌株發(fā)酵上清液排酸試驗(yàn) 由表2可知，當(dāng)pH 5 時(shí)，菌株發(fā)酵上清液對3 種指示菌均有較強(qiáng)的抑制效果，且對單核增生李斯特菌CMCC54001 抑制效果最強(qiáng)；但用乳酸、乙酸、鹽酸分別調(diào)節(jié)MRS 肉湯的pH 值為5.0 時(shí)，均不能抑制3種指示菌生長繁殖。由此可以說明，菌株發(fā)酵上清液對3 種指示菌所表現(xiàn)的抑菌作用，不是酸作用的結(jié)果，可能是其它物質(zhì)作用的結(jié)果，需進(jìn)行大量的試驗(yàn)驗(yàn)證。

表2 菌株發(fā)酵上清液排酸試驗(yàn)Table 2 Test of organic acid eliminnation of strain fermentation supernatant

2.2.2 菌株發(fā)酵上清液排除過氧化氫試驗(yàn) 由表3可知，經(jīng)過氧化氫酶處理的發(fā)酵液與未經(jīng)處理發(fā)酵液相比抑菌能力幾乎沒有下降，因此可以說明過氧化氫不是引起抑菌的物質(zhì)，可能有其它具有抑菌能力的物質(zhì)存在。

2.2.3 菌株發(fā)酵上清液對酶敏感試驗(yàn) 初篩的兩菌株經(jīng)各蛋白酶處理后，對指示菌的抑菌能力均表現(xiàn)降低的趨勢，甚至出現(xiàn)喪失的現(xiàn)象，由此可以證明發(fā)酵上清液中存在的抑菌活性物質(zhì)是細(xì)菌素。

表3 菌株發(fā)酵上清液排除過氧化氫試驗(yàn)Table 3 Test of hydrogen peroxide eliminnation of strain fermentation supernatant

表4 菌株發(fā)酵上清液對酶敏感試驗(yàn)Table 4 Sensitivity test of strain fermentation supernatant on protease

2.3 菌株發(fā)酵上清液對熱及pH 穩(wěn)定性試驗(yàn)

由圖1可知，隨溫度的升高，戊糖片球菌素37X-3 和乳酸片球菌素37X-13 對3 種指示菌的抑菌能力逐漸降低，經(jīng)80 ℃處理30 min，對3 種指示菌的抑菌能力較強(qiáng)；經(jīng)105 ℃處理30 min 后，抑菌能力有所降低；經(jīng)121 ℃處理15 min 后，對3種指示菌的抑菌活性仍能保持70%，表明這2 種乳酸菌素對熱不敏感。

由圖2可知，在pH 值為2～6 時(shí)，戊糖片球菌素37X-3 和乳酸片球菌素37X-13 對3 種指示菌均具有抑菌活性，隨pH 值的升高，對3 種指示菌的抑菌能力逐漸降低，說明這2 種乳酸菌素在低酸體系下活性較強(qiáng)。

2.4 抑菌譜

由表5可知，戊糖片球菌素37X-3 和乳酸片球菌素37X-13 能抑制枯草芽孢桿菌、屎腸球菌、巴黎鏈球菌等革蘭氏陽性菌及沙門氏菌、志賀氏菌等革蘭氏陰性菌，具有廣譜抑菌活性。

圖1 菌株發(fā)酵上清液對熱穩(wěn)定性試驗(yàn)Fig.1 Stability test of strain fermentation supernatant on thermal

2.4.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的表型鑒定 挑取有明顯鈣圈的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察發(fā)現(xiàn)菌體呈圓球形，對生排列。

在MRS+0.7%無菌碳酸鈣固體培養(yǎng)基中于30℃厭氧培養(yǎng)48 h 后，菌落表面光滑濕潤呈乳白色，菌落形態(tài)大致呈圓形或橢圓形，直徑約為1～2 mm，并且菌落周圍有明顯的透明圈。

在30 ℃的條件下培養(yǎng)24 h 后，MRS 液體培養(yǎng)基達(dá)到渾濁狀態(tài)，菌體呈白色并沉淀到MRS 液體培養(yǎng)基底部。

表5 乳酸菌素的抑菌譜Table 5 Antibacterial spectrum of lactic acid bacteriocin

2.4.2 菌株生理生化鑒定 菌株37X-3 在45 ℃下能生長，對鼠李糖、麥芽糖、核糖、阿拉伯糖、海藻糖具有發(fā)酵作用，初步判定為戊糖片球菌。菌株37X-13 在45 ℃下能生長，對核糖和木糖具有發(fā)酵作用，初步判定為乳酸片球菌。

圖2 菌株發(fā)酵上清液對pH 穩(wěn)定性試驗(yàn)Fig.2 Stability test of strain fermentation supernatant on pH

圖3 菌株菌體形態(tài)特征Fig.3 The morphological features of strains

表6 菌株37X-3 和37X-13 生理生化鑒定Table 6 Identification of physiology and biochemical for strain 37X-3 and 37X-13

2.4.3 菌株16S rDNA 鑒定 菌種16S rDNA 序列分析表明37X-3 的DNA 基因序列共1 452 bp，37X-13 的DNA 基因序列共1 539 bp，經(jīng)BLAST分析，結(jié)果見圖4，37X-3 與戊糖片球菌MH111691.1 （Pediococcus pentosaceus MH111691.1）的相似度達(dá)到99.2%，37X-13 與乳酸片球菌EF059987（Pediococcus acidilatici EF059987）的相似度達(dá)到99.9%，因此鑒定37X-3 為戊糖片球菌，37X-13 為乳酸片球菌。

圖4 37X-3 和37X-13 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree analysis of strain 37X-3 and 37X-13

圖5 37X-3 和37X-13 的序列同源性分析Fig.5 Sequence homology analysis of strain 37X-3 and 37X-13

3 結(jié)果與討論

3.1 乳酸菌素篩選及鑒定

乳酸菌可以產(chǎn)生多種抗菌活性成分，但逐一排除難度非常大。張紅星等[12]通過乳酸菌排酸試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、酶敏感試驗(yàn)，認(rèn)為上清液中有蛋白類物質(zhì)的存在，即為細(xì)菌素。由于本試驗(yàn)菌株37X-3 和37X-13 的上清液在酸及過氧化氫酶處理后，仍能保持較強(qiáng)的抗菌活性，且對各類蛋白酶敏感，因此認(rèn)為菌株37X-3 和37X-13 的上清液中存在細(xì)菌素物質(zhì)。

生理生化的方法存在許多缺陷，試驗(yàn)結(jié)果并不能準(zhǔn)確地反映菌株的種屬，應(yīng)將表型鑒定、生理生化鑒定和16S rDNA 鑒定相結(jié)合，使結(jié)果更加準(zhǔn)確。馬迎濤[16]將以上3 種方法結(jié)合起來鑒定菌株S2 為副干酪乳桿菌，本試驗(yàn)菌株37X-3 和37X-13 分別經(jīng)以上3 種方法鑒定為戊糖片球菌和乳酸片球菌。

3.2 乳酸菌素對熱及pH 值穩(wěn)定性

本研究中具有抗菌效果的戊糖片球菌素37X-3 和乳酸片球菌素37X-13 在酸性體系中能保持較強(qiáng)的抗菌能力，隨pH 值的升高抗菌能力減弱，如Nisin 在pH 值為6 的體系中僅殘留10%的抗菌活性，這與大部分乳酸菌素的特性相似。由此可知，2 株片球菌素可作為酸性或中性防腐劑。Jack 等[18]的研究表明，乳酸菌素在高pH 值的體系中抗菌能力減弱甚至喪失，可能是由于高pH 值體系會(huì)改變?nèi)樗峋氐姆肿拥鞍捉Y(jié)構(gòu)。Zacharof 等[19]的研究表明，乳酸菌素在弱酸體系中更有利于蛋白類物質(zhì)吸附于靶細(xì)胞上，有利于發(fā)揮抗菌作用。

對熱穩(wěn)定是乳酸菌素的一大優(yōu)勢，目前大多數(shù)乳酸菌素經(jīng)高溫處理后仍能保持較強(qiáng)的抗菌能力。乳酸菌素的熱穩(wěn)定性與其純度、酸堿性等有密切關(guān)系。65～80 ℃為巴氏殺菌的溫度，而121 ℃為微生物滅菌的溫度。該試驗(yàn)中的2 株片球菌素在pH 值為5 時(shí)，經(jīng)65，80，121 ℃處理后對3 種指示菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌效果，故這2 株片球菌素在需熱處理的食品中有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以蒙古國風(fēng)干牛肉為樣品，通過平板劃線法分離出28 株乳酸菌。以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單核增生李斯特菌為指示菌檢測28株乳酸菌的抑菌活性，經(jīng)排除酸和過氧化氫酶以及酶敏感試驗(yàn)，從中選取2 株抑菌能力最強(qiáng)的乳酸菌，經(jīng)表型、生理生化和基因型鑒定，確定菌株37X-3 為戊糖片球菌，菌株37X-13 為乳酸片球菌。

2 種片球菌素在121 ℃，15 min，pH 值為2～6范圍內(nèi)能抑制3 種指示菌的生長，且對單核李斯特菌抑菌作用最強(qiáng)。2 種片球菌素均能抑制枯草芽孢桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌等革蘭氏陽性菌及沙門氏菌、志賀氏菌等革蘭氏陰性菌，具有廣譜抑菌活性。