pH驅(qū)動(dòng)法制備姜黃素乳液

高洪霞，繆金玉，吳曉琳，成 策，馬 麗，鄒立強(qiáng)，劉 偉

（南昌大學(xué)食品學(xué)院 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047）

姜黃素 （Curcumin）是從姜科植物（Curcuma longa）的根莖中提取的一種植物活性多酚[1]。姜黃素具有較好的生理活性，如抗氧化和抗炎活性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等行業(yè)。然而，姜黃素的高熔點(diǎn)、低水溶性、低口服生物利用度等缺陷極大地限制了其應(yīng)用。姜黃素的生物活性和生物利用度與其在運(yùn)載體中的物理形態(tài)密切相關(guān)。目前，已有許多食品運(yùn)載體系被廣泛用于包封姜黃素，如脂質(zhì)體[2]、納米粒子[3]、乳液[4]等。研究表明：姜黃素經(jīng)運(yùn)載體系包封后，其水溶性、穩(wěn)定性、生物利用率等方面可得到有效改善[5]。然而，這些傳統(tǒng)方法在包埋姜黃素時(shí)需加熱或引入有機(jī)溶劑，具有一定的局限性[6]。研發(fā)新型的姜黃素遞送方法具有重要意義。

近年來，pH 驅(qū)動(dòng)法被廣泛用于包埋水不溶性物質(zhì)——姜黃素，該方法基于姜黃素不易溶于酸性和中性水溶液中，易溶于堿性環(huán)境的原理，此外，該方法無需加熱且不使用有機(jī)溶劑[7-8]。目前關(guān)于pH 驅(qū)動(dòng)法制備的姜黃素運(yùn)載體主要有磷脂脂質(zhì)體[7]、蛋白納米粒子[9]、槐糖脂納米粒子[8]等，而關(guān)于用pH 驅(qū)動(dòng)法制備姜黃素乳液的研究尚未見報(bào)道。乳液是目前應(yīng)用較廣的運(yùn)載體系，可用于運(yùn)載疏水的生物活性物質(zhì)。目前基于乳液包封姜黃素的報(bào)道有很多，主要可分為傳統(tǒng)法和熱驅(qū)動(dòng)法。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)熱驅(qū)動(dòng)法制備的姜黃素乳液的溶解度和穩(wěn)定性差異與乳化劑類型有關(guān)[10]。不同類型乳化劑穩(wěn)定乳液的界面性質(zhì)差異很大，選擇合適的乳化劑種類是決定乳狀液能否制備成功的關(guān)鍵因素之一，由于不同的乳化劑呈現(xiàn)不同的物化性能，因此乳化劑在油-水界面的吸附能力以及表面成膜能力等均有所不同，這直接影響乳狀液的穩(wěn)定性[11]。

為此，本試驗(yàn)中選擇3 種食品工業(yè)常用乳化劑（乳清分離蛋白、酪蛋白酸鈉和OSA 變性淀粉）制備空白乳液，通過pH 驅(qū)動(dòng)法制備姜黃素乳液；考察不同乳化劑類型對pH 驅(qū)動(dòng)法制備的姜黃素乳液姜黃素包封率、粒子特性及環(huán)境穩(wěn)定性的影響。通過體外消化模型探究不同乳化劑制備的乳液對姜黃素的生物可接受率及穩(wěn)定性的影響。本研究結(jié)果可為食品營養(yǎng)素遞送提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

姜黃素 （98%），阿拉丁試劑上海有限公司；bipro 分離乳清蛋白粉，美國Davisco 食品國際公司；酪蛋白酸鈉、黏膜蛋白（M2378）、胃蛋白酶（P7125）、脂肪酶（L3126）、胰液素（P1750）、牛 膽鹽、α-淀粉酶（A3176）、淀粉葡萄糖苷酶（A7095），均購買于美國Sigma-Aldrich 公司；OSA 變性淀粉（Purity Gum 2000，F(xiàn)GI6655），購買于美國Bridgewater 國民淀粉化學(xué)有限責(zé)任公司；山茶油，江西綠野軒生物科技有限公司；所有化學(xué)試劑均為分析純。

IKA T18 分散機(jī)，德國艾卡儀器設(shè)備有限公司；M-110 高壓微射流，美國Microfluidic 公司；T6世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Zetasizer Nano-ZSP 納米粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；SORVALL Biofuge PrimoR 臺式離心機(jī)，上海研域儀器設(shè)備有限公司；METTLER TOLEDO pH 計(jì)，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SHZ-B 水浴恒溫振蕩器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 姜黃素乳液的制備 乳液的制備[12]：將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的乳化劑（OSA 變性淀粉，WPI，酪蛋白酸鈉）溶于磷酸緩沖溶液（0.01 mol/L，pH=6.5）中作為水相，山茶油為油相。油相與水相按照質(zhì)量比1∶9 混合，分散機(jī)（12 000 r/min，2 min）均質(zhì)制得粗乳液；粗乳液經(jīng)高壓微射流（100 MPa，3 次）處理制得細(xì)乳液。

姜黃素乳液的制備[7]：稱取姜黃素粉末溶于pH 12.5 的NaOH 水溶液中 （質(zhì)量濃度為9 mg/mL），500 r/min 避光攪拌5 min 使其完全溶解。將姜黃素堿性水溶液與不同乳化劑穩(wěn)定乳液按1∶19 的比例混勻，立即回調(diào)pH 至6.5，避光攪拌30 min，置于4 ℃冰箱避光待用。

1.2.2 姜黃素包封率測定 姜黃素乳液經(jīng)8 000 r/min 離心10 min 除去未包封的姜黃素；離心后取1 mL 乳液與9 mL 氯仿混合，3 000 r/min 離心10 min，離心后收集有機(jī)層，重復(fù)萃取2 次合并萃取液，將其稀釋至適宜濃度，419 nm 處測其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=6.8775x-0.1817，R2=0.9991，計(jì)算姜黃素含量。

由下列公式計(jì)算包封率 （Entrapment Efficiency，EE）：

1.2.3 姜黃素乳液物理特性的表征 通過馬爾文Zetasizer Nano-ZSP 粒度儀對姜黃素乳液的平均粒徑、PDI、電位進(jìn)行測定。姜黃素乳液用相同pH、離子濃度蒸餾水稀釋100 倍。

1.2.4 姜黃素乳液的pH 穩(wěn)定性測試 參考Liu等[13]的方法對姜黃素乳液的pH 穩(wěn)定性進(jìn)行測定，調(diào)姜黃素乳液pH 至4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，再分別用相同pH 的蒸餾水將其稀釋100 倍；分別測定乳液粒徑與電位。

1.2.5 姜黃素的穩(wěn)定性和生物可接受率

1.2.5.1 模擬體外消化模型 體外消化模型的建立及消化各階段消化液的制備參考Chen 等[14]的方法，所有溶液在使用前預(yù)加熱至37 ℃，整個(gè)試驗(yàn)過程的溫度都控制在37 ℃。

口腔：7.5 mL 含黏膜蛋白（30 mg/mL），α-淀粉酶（4.2 mg/mL）的模擬唾液（SSF）與7.5 mL 初樣品混合并將混合液的pH 調(diào)至6.8，將混合體系放置在恒溫?fù)u床水浴中100 r/min 振蕩10 min。

胃：15 mL 經(jīng)口腔消化后的混合溶液與15 mL 含胃蛋白酶（3.2 mg/mL）的模擬胃液（SGF）混合，混合后將樣品的pH 調(diào)至2.5。將混合體系放置在恒溫?fù)u床水浴中100 r/min 振蕩2 h。

小腸：將30 mL 經(jīng)胃消化后的混合溶液pH調(diào)至7.0。再與含1.5 mL 腸鹽，2.5 mL 脂肪酶（24 mg/mL），212 μL 淀粉葡萄糖苷酶，2.5 mL 胰液素（24 mg/mL）和3.5 mL 膽鹽的模擬腸液（SIF）混合。脂肪酶，胰液素和膽鹽用PBS（pH 7，0.5 mmol/L）溶解。將混合體系的pH 調(diào)至7.0，置于恒溫?fù)u床水浴中100 r/min 振蕩2 h，并用0.1 mol/L NaOH溶液滴定使整個(gè)小腸消化過程混合液的pH 保持在7.0。

1.2.5.2 姜黃素生物可接受率和消化穩(wěn)定性的測定 參考Liu 等[13]的方法，體外消化試驗(yàn)結(jié)束后，取一部分小腸消化液15 000 r/min 離心30 min，得到3 層分布產(chǎn)物，上層為未消化的油脂，中間層為膠束，下層為固形物，收集中間的膠束層，1 mL 氯仿與1 mL 膠束混合，充分混勻后8 000 r/min 離心3 min。收集溶有姜黃素的有機(jī)相，重復(fù)萃取2 次。另一部分小腸消化液直接用氯仿進(jìn)行萃取，與上述萃取步驟相同。將收集好的姜黃素溶液用紫外可見分光光度計(jì)在419 nm 處測其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算姜黃素含量。姜黃素的生物可接受率和穩(wěn)定性用以下公式計(jì)算：

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)都進(jìn)行3 次平行，數(shù)據(jù)分析和圖表分析采用Origin 8.0 軟件，試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。試驗(yàn)數(shù)據(jù)之間用SPSS 1.7 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，不同字母標(biāo)識表示具有顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素乳液的物理特性

圖1 不同乳化劑穩(wěn)定姜黃素乳液粒徑分布圖Fig.1 Particle size distributions of curcumin emulsion prepared with different emulsifiers

圖1表明3 種姜黃素乳液都比較穩(wěn)定，無分層和絮凝現(xiàn)象發(fā)生。從圖1和表1可知WPI 和酪蛋白酸鈉穩(wěn)定的姜黃素乳液與OSA 乳液相比具有更小的粒徑，平均粒徑從小到大依次是WPI 乳液 （171.8 nm±0.5 nm）、酪蛋白酸鈉乳液（204.7 nm±1.3 nm）、OSA 變性淀粉乳液 （327.8 nm±9.2 nm）。由圖1的粒徑分布圖可知，3 種姜黃素乳液的粒徑主要分布在100～600 nm 范圍內(nèi)。乳清分離蛋白與酪蛋白酸鈉穩(wěn)定的姜黃素乳液具有較高的負(fù)表面電荷，分別為（-41.27±2.53）mV 和（-38.50±2.27）mV，遠(yuǎn)大于OSA 變性淀粉穩(wěn)定的乳液（-9.16 mV±0.61 mV）?？赡苁怯捎诘鞍踪|(zhì)穩(wěn)定乳液液滴間的主要作用力為靜電斥力，乳液粒徑相對較小，液滴間的排斥力超過吸引力，從而抑制了液滴聚集。而OSA 變性淀粉穩(wěn)定乳液其油滴表面有一層厚的親水多糖，穩(wěn)定乳液的主要作用力是空間位阻[15]。

表1 不同乳化劑制備的姜黃素乳液的性質(zhì)表征Table 1 Characterization of curcumin emulsion prepared with different emulsifiers

2.2 姜黃素乳液的包封率

3 種不同乳化劑穩(wěn)定的乳液最初含有等量的姜黃素（450 μg/mL），由圖2可知，不同乳化劑穩(wěn)定的乳液對姜黃素的包封率顯著不同。WPI 和酪蛋白酸鈉穩(wěn)定乳液的底部有橘黃色的姜黃素沉淀物，而OSA 變性淀粉乳液底部未發(fā)現(xiàn)姜黃素沉淀物。這一直觀現(xiàn)象與乳液包封率數(shù)據(jù)相吻合，如圖3所示酪蛋白酸鈉和WPI 穩(wěn)定乳液的姜黃素包封率分別為（65.6±1.7）%和（77.9±1.3）%，低于OSA變性淀粉穩(wěn)定的乳液（81.7%±1.5%）。OSA 變性淀粉的包封率較高的原因可能是姜黃素與OSA 變性淀粉分子之間發(fā)生相互作用。此外OSA 變性淀粉乳液具有較厚的界面膜，從而阻止姜黃素從油滴中泄漏。

圖2 不同乳化劑制備的姜黃素乳液外觀圖Fig.2 Appearance of curcumin emulsion prepared with different emulsifiers

2.3 姜黃素乳液的pH 穩(wěn)定性

圖3 不同乳化劑制備的姜黃素乳液的包封率圖Fig.3 Encapsulation efficiency of curcumin emulsion prepared with different emulsifiers

在食品生產(chǎn)和食用過程中，食品運(yùn)載體系常常會(huì)暴露在不同的pH 環(huán)境下，因此研究運(yùn)載體系的pH 穩(wěn)定性對其應(yīng)用十分重要。由圖4可知，酪蛋白酸鈉姜黃素乳液在pH 4 和pH 5 時(shí)出現(xiàn)分層，WPI 乳液在pH 5 時(shí)出現(xiàn)分層，而OSA 變性淀粉穩(wěn)定的乳液在pH 4～8 范圍內(nèi)為均一穩(wěn)定體系。在pH 4～6 時(shí)，隨著pH 升高，OSA 變性淀粉穩(wěn)定乳液的粒徑呈現(xiàn)下降趨勢，pH 6～8 時(shí)基本穩(wěn)定；2 種蛋白質(zhì)穩(wěn)定乳液粒徑在pH 4～5 時(shí)急劇上升，而在pH 6～8 時(shí)基本穩(wěn)定（圖5）。2 種蛋白質(zhì)穩(wěn)定乳液的電位在pH 4～8 間由正變負(fù)，在低于等電點(diǎn)時(shí)帶正電荷，高于等電點(diǎn)時(shí)帶負(fù)電，且pH距離等電點(diǎn)越大其電位的絕對值也越大。OSA 變性淀粉穩(wěn)定乳液的電位變化趨勢隨pH 降低而略微升高，基本穩(wěn)定在0～-10 mV 間（圖6）。由此可知，與2 種蛋白質(zhì)穩(wěn)定乳液相比，OSA 變性淀粉姜黃素乳液具有較高的pH 穩(wěn)定性。在等電點(diǎn)附近，蛋白質(zhì)穩(wěn)定的乳液粒徑的增大可能歸因于液滴間靜電斥力的降低，從而導(dǎo)致液滴絮凝出現(xiàn)分層現(xiàn)象[16]。OSA 變性淀粉穩(wěn)定乳液的主要作用力是空間位阻，對pH 的依賴性較小，因此具有較好的pH穩(wěn)定性。

圖4 不同乳化劑制備姜黃素乳液在不同pH 環(huán)境的外觀圖Fig.4 Appearance of curcumin emulsion prepared by different emulsifiers in different pH values

圖5 不同乳化劑制備的姜黃素乳液在不同pH 值下的平均粒徑Fig.5 The mean droplet diameter of curcumin emulsion prepared with different emulsifiers at different pH values

圖6 不同乳化劑制備的姜黃素乳液在不同pH 值下的電位Fig.6 ζ-Potential of curcumin emulsion prepared with different emulsifiers at different pH values

2.4 姜黃素的生物可接受率及消化穩(wěn)定性

由于姜黃素的化學(xué)不穩(wěn)定性及相對較低的生物可接受率可能會(huì)導(dǎo)致其在模擬體外消化過程中生物活性降低。因此，用體外消化試驗(yàn)來探究不同乳化劑對姜黃素生物可接受率及穩(wěn)定性的影響。圖7展示了不同乳化劑姜黃素乳液在各個(gè)消化階段完成后的表觀形態(tài)。在初樣品階段3 種乳液均呈嫩黃色；在口腔消化結(jié)束后，與初樣品相比，乳液顏色均變淺；胃消化結(jié)束后，WPI 穩(wěn)定姜黃素乳液出現(xiàn)明顯的絮凝現(xiàn)象，這可能是由于在較低的pH 值下，蛋白酶水解作用導(dǎo)致蛋白和乳液液滴發(fā)生絮凝，但這并不影響小腸階段的脂質(zhì)分解作用[17]。小腸消化完成后，3 種姜黃素乳液從外觀看均呈淺黃色。

圖7 不同乳化劑制備的姜黃素乳液在不同消化階段的表觀形態(tài)Fig.7 The apparent state of curcumin emulsion prepared with different emulsifiers at different stages of digestion

圖8 不同乳化劑制備的姜黃素乳液體外消化后的保留率（a）和生物可接受率（b）Fig.8 Chemical stability （a）and bioaccessibility （b）of curcumin emulsion prepared with different emulsifiers after in vitro digestion

姜黃素穩(wěn)定性結(jié)果顯示3 種不同乳化劑穩(wěn)定乳液中姜黃素的保留率無顯著差別（圖8a）。姜黃素在不同乳化劑穩(wěn)定的乳液中具有良好的穩(wěn)定性可能是由以下兩方面原因引起的：（1）WPI 和酪蛋白酸鈉穩(wěn)定的乳液在體外消化過程中由于蛋白質(zhì)被分解，釋放出具有抗氧化性的多肽[18]。（2）OSA 變性淀粉穩(wěn)定的乳液具有較厚的界面膜能夠保護(hù)姜黃素，使其具有較好的穩(wěn)定性[19]。

測得OSA 變性淀粉穩(wěn)定乳液的生物可接受率為（43.4±1.4）%，WPI 和酪蛋白酸鈉穩(wěn)定乳液的生物可接受率分別為（47.1±4.7）%和（30.8±2.5）%（圖8b）。結(jié)果表明OSA 變性淀粉和WPI 穩(wěn)定乳液的生物可接受率較高。WPI 穩(wěn)定乳液的生物可接受率較高可能是由于其乳液粒徑較小，在小腸消化階段，更大的脂質(zhì)表面積暴露于脂肪酶，有利于脂肪酶快速作用于液滴表面，釋放出更多的姜黃素[20]。OSA 變性淀粉穩(wěn)定乳液的生物可接受率較高可能是因?yàn)镺SA 變性淀粉形成較致密的結(jié)構(gòu)分散在油滴周圍，進(jìn)一步降低姜黃素在消化過程中的降解[21]。酪蛋白酸鈉穩(wěn)定乳液的生物可接受率較低可能是由于乳液粒徑相對較大且無較厚的界面結(jié)構(gòu)對其進(jìn)行保護(hù)，只有少部分的姜黃素轉(zhuǎn)移至膠束層中，因此導(dǎo)致測得的姜黃素生物可接受率較低。

3 結(jié)論

為了提高姜黃素在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用，以乳液作為運(yùn)載體系，以3 種常用的食品級乳化劑（乳清分離蛋白、酪蛋白酸鈉、OSA 變性淀粉），通過pH 驅(qū)動(dòng)法制備姜黃素乳液。比較不同乳化劑穩(wěn)定的乳液對姜黃素的包封率、粒子特性及pH穩(wěn)定性。結(jié)果表明，3 種乳化劑穩(wěn)定乳液對姜黃素的包封率為OSA＞W(wǎng)PI＞酪蛋白酸鈉；OSA 變性淀粉乳液具有更廣泛的pH 穩(wěn)定性。體外消化試驗(yàn)結(jié)果表明，3 種不同乳化劑穩(wěn)定乳液中姜黃素的穩(wěn)定性無顯著差異；不同乳化劑穩(wěn)定乳液中姜黃素的生物可接受率為OSA≈WPI＞酪蛋白酸鈉。這些試驗(yàn)結(jié)果為設(shè)計(jì)姜黃素運(yùn)載體系用于食品或其它工業(yè)提供了有用的信息。