家蠅乙酰膽堿酯酶基因密碼子優(yōu)化及酶學(xué)特性表征

袁巧敏，盧海強，黃 蕾，谷新晰，李 晨，田洪濤，2*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071001 2 國家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 河北保定071001）

我國已經(jīng)明文禁止有機磷中的甲胺磷、甲基對硫磷、對硫磷、磷胺、久效磷等劇毒、高毒農(nóng)藥用于果蔬的病蟲害防治，而有些果農(nóng)、菜農(nóng)及相關(guān)企業(yè)仍使用這些有機磷農(nóng)藥對害蟲進行防治[1]。因過量使用或濫用農(nóng)藥而導(dǎo)致的農(nóng)藥殘留及急慢性中毒事件屢見不鮮，故做好農(nóng)藥殘留的檢測，進而保證食品安全刻不容緩[2]。

基于乙酰膽堿酯酶（achetylcholinesterase，AchE）的酶抑制分析方法（簡稱酶法）快速、簡便，尤其是檢測成本低，適宜基層大面積現(xiàn)場篩查的需要，是對大型儀器檢測方法的補充[3-4]。其中，核心原材料——AchE 的制備是關(guān)鍵，也一直備受研究者的關(guān)注。相比從動植物中分離提取，采用基因工程技術(shù)進行重組AchE 的制備是未來的發(fā)展方向[5]。

自Schumacher 等[6]首次從電鰩克隆得到AchE 的cDNA 以來，研究者已從鼠、鯉魚、果蠅等生物體內(nèi)獲取了AchE 的cDNA，并開展重組AchE 的表達研究[7-9]。畢赤酵母（Pichia pastoris）作為一種真核表達系統(tǒng)，除了能對外源蛋白進行翻譯后的加工修飾外，還能使產(chǎn)物有效分泌，培養(yǎng)方便、經(jīng)濟[10]。目前國內(nèi)外有多種昆蟲ache 基因利用畢赤酵母系統(tǒng)得到很好的表達。例如，Zhou 等[11]利用該系統(tǒng)表達了重組東亞飛蝗乙酰膽堿酯酶；盧臨萍[12]利用該系統(tǒng)表達了家蠶乙酰膽堿酯酶；曹雪等[13]利用該系統(tǒng)大量表達了中華蜜蜂乙酰膽堿酯酶。

鑒于畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)勢及應(yīng)用前景，本試驗通過序列分析并根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，對家蠅乙酰膽堿酯酶基因進行密碼子替換，構(gòu)建分泌表達載體pPIC9K-mdAchE，進而實現(xiàn)重組酶mdAchE 在畢赤酵母 GS115 中的高效表達，為進一步將mdAchE 應(yīng)用于有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢測提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴斯德畢赤酵母GS115 和質(zhì)粒pPIC9K，由本實驗室保存；大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans 1-T1，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；T4 DNA 連接酶和限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、BglⅡ，購自TaKaRa 公司；質(zhì)粒小提中量試劑盒和DNA 回收試劑盒，購自Biomiga 公司；8 種有機磷農(nóng)藥（100 μg/mL）和8 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥（100 μg/mL），購自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；碘化硫代乙酰膽堿 （ATC）和 5，5-二硫雙 （2-硝基苯甲酸）（DNTB），購自Sigma 公司。根據(jù)《畢赤酵母表達手冊》制備最小葡萄糖（MD）瓊脂板、緩沖復(fù)合甘油培養(yǎng)基（BMGY）和緩沖復(fù)合甲醇培養(yǎng)基（BMMY）；其它化學(xué)試劑為進口或國產(chǎn)分析純級；核酸測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

Sigma 3K15 高速臺式離心機，德國Sigma 公司；Biometra Tprofessional PCR 儀，德國Biometra公司；DYY-6C 型電泳儀，北京六一儀器廠；JY04S-3E 型凝膠成像系統(tǒng)，君意電泳；酶標(biāo)儀，美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 乙酰膽堿酯酶的密碼子優(yōu)化 參照Gen-Bank 中乙酰膽堿酯酶基因序列（GenBank：GU220395.1），利用密碼子數(shù)據(jù)庫（http：//www.kazusa.or.jp/codon）分析序列，采用密碼子優(yōu)化軟件（http：//www.jcat.de/）設(shè)計乙酰膽堿酯酶基因，使其與畢赤酵母GS115 的密碼子使用頻率相匹配，同時在基因序列的5’端與3’端分別引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點，將優(yōu)化后的基因序列送河北本元生物科技有限公司合成。

1.3.2 酵母表達載體的構(gòu)建 用EcoRⅠ/NotⅠ分別對質(zhì)粒pMDTM19T-mdAchE 和pPIC9K 進行雙酶切，利用膠回收試劑盒對目的酶切產(chǎn)物進行回收，并進行mdAchE 和pPIC9K 的連接反應(yīng)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-mdAchE。采用5′AOX 和3′AOX 通用引物對轉(zhuǎn)化子進行驗證，將陽性轉(zhuǎn)化子送至上海生工生物工程股份有限公司進行測序。

利用質(zhì)粒提取試劑盒，提取質(zhì)粒pPIC9KmdAchE，使用限制性酶BglⅡ?qū)PIC9K-mdAchE線性化，電轉(zhuǎn)化至GS115 感受態(tài)，參照《畢赤酵母表達手冊》進行陽性克隆子的篩選。

1.3.3 重組菌株誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE 分析挑取單陽性轉(zhuǎn)化子至50 mL YPD 培養(yǎng)基中，30℃，250 r/min 培養(yǎng)12 h。以1%的接種量接種于200 mL BMGY 中，在搖床中30 ℃，250～300 r/min生長至OD600=2～6（約16～18 h），室溫8 000×g 離心5 min 收集細胞，去除上清，100 mL BMMY 重懸細胞，放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)，維持甲醇終體積分?jǐn)?shù)為0.5%，每隔12 h 取樣，培養(yǎng)72 h 后離心收集發(fā)酵液，即為粗酶液，進行活力測定及SDS-PAGE分析。

1.3.4 乙酰膽堿酯酶的酶學(xué)性質(zhì)分析 參照Ellman 等[14]的方法，稍加改進。在酶標(biāo)板中依次加入以下試劑：25 μL 磷酸鹽緩沖液 （0.1 mol/L，pH 8.0），25 μL 8 mmol/L 碘化硫代乙酰膽堿，50 μL適當(dāng)稀釋酶液，25 ℃培養(yǎng)箱孵育10 min，加入50 μL 1.0×105mg/L SDS 終止反應(yīng)，50 μL 2 mmol/L DTNB 顯色，空白則在加入DTNB 后，補加50 μL稀釋酶液，顯色穩(wěn)定后在波長412 nm 處測定吸光值，并計算酶活力。

1.3.4.1 pH 值對重組酶mdAchE 的影響 分別在pH 值為5.0～9.0 條件下，測定重組酶mdAchE 的酶活力，分析其最適作用pH 值。將重組酶mdAchE 在pH 值2.0～12.0 的條件下，37 ℃處理1 h，對照為未進行處理的酶，按照標(biāo)準(zhǔn)酶活力測定方法測定酶活力，分析其pH 耐受性。緩沖液為pH 2.0～7.0 的100 mmol/L 檸檬酸-檸檬酸三鈉和pH 8.0～12.0 的100 mmol/L 甘氨酸-NaOH。

1.3.4.2 溫度對重組酶mdAchE 的影響 將重組酶mdAchE 在最適pH 值下，分別在溫度為20～90℃范圍內(nèi)測定重組酶mdAchE 的酶活力，分析其最適反應(yīng)溫度。將重組酶在50，60，70 ℃下，孵育0，5，10，20，30 和60 min 后，測定酶活力，分析其熱穩(wěn)定性。

1.3.4.3 金屬離子、有機溶劑及表面活性劑對重組酶mdAchE 的影響 在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，分別測定終濃度1.35×105mol/L、2.70×105mol/L 和6.75×105mol/L 丙酮；2.16×105mol/L、2.15×105mol/L 和2.14×105mol/L 乙醇；0.42×103mol/L 和0.84×103mol/L 吐溫；4 mol/L 和6 mol/L 尿素；0.5×104mg/L CTAB 和1.0×104mg/L CTAB；1 mmol/L 和5 mmol/L 的金屬離子（Fe3+、Cu2+、K+、Zn2+、Na+、Mg2+、Ca2+、Li+和Mn2+）、EDTA 和SDS 下的乙酰膽堿酯酶酶活力。

1.3.5 重組乙酰膽堿酯酶mdAchE 對農(nóng)藥的敏感性的應(yīng)用試驗 在酶標(biāo)板中依次加入以下試劑：25 μL 8 mmol/L 碘化硫代乙酰膽堿，75 μL 磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 8.0）稀釋的不同濃度農(nóng)藥，50 μL 適當(dāng)稀釋酶液，25 ℃培養(yǎng)箱孵育10 min，加入50 μL 1.0×105mg/L SDS 終止反應(yīng)，50 μL 2 mmol/L DTNB 顯色，顯色穩(wěn)定后在412 nm 波長處測定吸光值ΔAx。對照管為不含農(nóng)藥的正常測定管ΔA0。根據(jù)下式計算抑制率：

抑制率（%）=（ΔA0-ΔAx）/ΔA0×100

以農(nóng)藥對mdAchE 的抑制率對農(nóng)藥濃度的對數(shù)作圖，并計算農(nóng)藥對mdAchE 的抑制中濃度IC50。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析及處理 每組試驗平行測定3次，利用SPSS 19.0 軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示所得結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙酰膽堿酯酶的密碼子優(yōu)化

利用密碼子在線分析軟件發(fā)現(xiàn)，家蠅乙酰膽堿酯酶的DNA 序列中有些密碼子編碼的氨基酸，如GGG/C（Gly），CTA/C（Leu），TAT（Tyr），AGC/T，TCA/G（Ser），GTA（Val），GCA（Ala），ACA/T（Thr），CCG（Pro）等，它們在畢赤酵母中的使用率低于15%，通過基因設(shè)計使乙酰膽堿酯酶基因與畢赤酵母GS115 的密碼子使用頻率相匹配，從而提高mdAchE 的表達水平。將畢赤酵母表達系統(tǒng)中氨基酸最常用的密碼子質(zhì)量值設(shè)置為100，其余的密碼子質(zhì)量值相應(yīng)縮小[15]。密碼子優(yōu)化前密碼子質(zhì)量處于50 以上的約75%，密碼子質(zhì)量處于90以上的約20%；密碼子優(yōu)化后，密碼子質(zhì)量處于50 以上的約99%，密碼子質(zhì)量處于90 以上的約70%，密碼子質(zhì)量明顯提高。同時，對乙酰膽堿酯酶各個區(qū)段GC 含量進行優(yōu)化，使GC 含量均保持在45%～55%。每個氨基酸的優(yōu)化密碼子總結(jié)見表1。

表1 野生型（wt）和合成型（syn）ache 基因密碼子的比較Table 1 Comparison of wild-type （wt）and synthetic （syn）ache gene condons

2.2 乙酰膽堿酯酶基因mdAchE 工程菌株的構(gòu)建

對質(zhì)粒pMDTM19T-mdAchE 和質(zhì)粒pPIC9K分別進行雙酶切，使用T4 DNA 連接酶連接雙酶切產(chǎn)物，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans I -T1 感受態(tài)細胞，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC9K-mdAchE。用5′AOX 和3′AOX 通用引物驗證正確的陽性克隆，經(jīng)測序結(jié)果正確。將pPIC9K-mdAchE 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115 產(chǎn)生56 個陽性克隆子。經(jīng)過對陽性克隆子誘導(dǎo)表達，篩選出3 株高產(chǎn)菌株，分別為mdAchE-2、mdAchE-4 和mdAchE-7。

2.3 重組菌株mdAchE 的誘導(dǎo)表達及其產(chǎn)物的SDS-PAGE 分析

將重組菌株按1.3.4 節(jié)的方法進行培養(yǎng)和誘導(dǎo)表達之后，對細胞發(fā)酵液進行酶活檢測，結(jié)果顯示，發(fā)酵液中乙酰膽堿酯酶的酶活力為8.82 U/mL。進一步對誘導(dǎo)不同時間的重組菌發(fā)酵液進行SDS-PAGE 蛋白電泳檢測，結(jié)果見圖1。

圖1可見，發(fā)酵產(chǎn)物在約63 ku 處出現(xiàn)顯著蛋白條帶，而這與AfTanA 的蛋白理論分子質(zhì)量（76.84 ku）存在一定的差異，蛋白分子質(zhì)量偏小的原因可能是某些氨基酸的組成導(dǎo)致了電泳遷移率變小[16]。

2.4 重組酶mdAchE 酶學(xué)性質(zhì)分析

根據(jù)1.3.4.1 節(jié)和1.3.4.2 節(jié)試驗方法進行pH值與溫度對重組乙酰膽堿酯酶mdAchE 影響的酶學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果見圖2。

圖1 重組乙酰膽堿酯酶mdAchE SDS-PAGE電泳分析Fig.1 Sodium dodecy sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis （SDS-PAGE）analysis of recombinant mdAchE

圖2 溫度和pH 值對重組乙酰膽堿酯酶mdAchE 的影響Fig.2 Effect of temperature and pH on recombinant mdAchE

圖2a、圖2b 顯示，重組酶mdAchE 在20～80℃有活力，在50 ℃和65 ℃酶活力相當(dāng)，其最適反應(yīng)溫度為60 ℃。在50，60，70 ℃3 個溫度處理下的前20 min 其酶活力均下降得非常明顯，在50℃處理1 h，mdAchE 酶活性損失了50%；在60 ℃處理1 h 后，mdAchE 相對酶活損失了60%；70 ℃處理1 h，mdAchE 酶活性僅剩38%。

圖2c、圖2d 表明，重組酶mdAchE 在pH 6.5～9.0 的條件下有活力，最適反應(yīng)pH 值為8.5。在pH 值2.0～8.0 處理1 h 后，mdAchE 酶活性全部喪失；在pH 9.0 和11.0 處理1 h 后，mdAchE 相對酶活性保持在80%左右；在pH 8.5 和12.0 處理1 h 后，mdAchE 酶活性均保持在65%以上，由此可知重組酶mdAchE 在堿性條件下酶活力較為穩(wěn)定。

2.5 金屬離子、有機溶劑及表面活性劑對重組酶的影響

根據(jù)1.3.4.3 節(jié)試驗方法進行金屬離子、有機溶劑及表面活性劑對重組乙酰膽堿酯酶mdAchE影響的酶學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果見表2。

表2 各種化學(xué)試劑及金屬離子對mdAchE 活力的影響Table 2 The effect of various chemical reagents and metal ions on the activity of mdAchE

表2表明，不同種類的金屬離子、有機試劑及表面活性劑對酶活力影響存在差異，且不同濃度也存在差異。只有Li+、Na+、K+、EDTA 對mdAchE活性無抑制作用，其余金屬離子、有機試劑及表面活性劑對mdAchE 的抑制作用均隨著試劑濃度提高而增強。Cu2+、Mn2+、Fe3+和吐溫80 在低濃度條件下對mdAchE 活性完全抑制；2.16×105mol/L 和2.14×105mol/L 的乙醇對mdAchE 活性具有輕微的抑制作用，相對活性分別為52.8%和34.8%；1.0×104mg/L 的SDS 對mdAchE 活性具有較強的抑制作用，抑制了將近80%的酶活力；而1.0×105mg/L 的SDS 對mdAchE 活性完全抑制；4 mol/L 尿素對mdAchE 活性具有輕微抑制作用，相對活性為56.7%；6 mol/L 尿素對mdAchE 活性具有較強的抑制作用，抑制作用為84.2%。

2.6 重組乙酰膽堿酯酶mdAchE 對農(nóng)藥敏感性的應(yīng)用試驗

目前多數(shù)文獻[5，11，17]都用抑制中濃度IC50來評價mdAchE 對農(nóng)藥的敏感性，IC15表示mdAchE 可以檢測到農(nóng)藥濃度的最低限，并且IC50越低，mdAchE 敏感性越強。根據(jù)1.3.5 節(jié)試驗方法進行重組乙酰膽堿酯酶mdAchE 對農(nóng)藥的敏感性的應(yīng)用試驗，結(jié)果見表3。

表3顯示，mdAchE 的活性對農(nóng)藥濃度在一定區(qū)間內(nèi)呈正相關(guān)。不同農(nóng)藥對mdAchE 活性抑制存在差異，7 種有機磷和8 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥對mdAchE 的IC50由小到大順序為：馬拉硫磷＜仲丁威＜克百威＜葉蟬散＜倍硫磷＜速滅威＜西維因＜涕滅威＜抗蚜威＜殘殺威＜久效磷＜敵敵畏＜樂果＜草甘磷＜毒死蜱。7 種有機磷農(nóng)藥對mdAchE 的IC50差異較大，而氨基甲酸酯類農(nóng)藥對mdAchE 的IC50差異較小，其中mdAchE 對馬拉硫磷的敏感性最強，IC50為3.9×10-8μg/mL，而對草甘磷和毒死蜱的敏感性很弱，IC50分別為1.96×109μg/mL 和1.51×1022μg/mL。根據(jù)IC15可以進一步說明mdAchE 可以用于多種低濃度有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的檢測。

表3 有機磷和氨基甲酸類農(nóng)藥抑制mdAchE 的IC50 值比較Table 3 Comparison of IC50 values of organophosphorus and carbamate pesticides inhibiting mdAchE

3 討論

乙酰膽堿酯酶具有較高的應(yīng)用價值，但在天然宿主菌和原核表達體系中表達量很低，如王棟[18]曾利用大腸桿菌作為宿主菌表達家蠅乙酰膽堿酯酶，雖能檢測到活性，但表達量極低。巴斯德畢赤酵母基因表達系統(tǒng)經(jīng)過近十年發(fā)展，以其高效、實用、簡便，表達量高并保持產(chǎn)物生物學(xué)活性的優(yōu)點脫穎而出，已高效表達了HBsAg、TNF、EGF、破傷風(fēng)毒素片段、基因工程抗體等多種外源基因[19]。密碼子優(yōu)化已被廣泛和成功地用于提高外來蛋白質(zhì)的表達水平，在巴斯德畢赤酵母中已有很多成功應(yīng)用的實例[20-22]?；谝陨蟽牲c，在本研究中，根據(jù)巴斯德畢赤酵母密碼子使用的偏好性優(yōu)化設(shè)計了編碼家蠅乙酰膽堿酯酶mdAchE 的基因，基因中大多數(shù)密碼子是從巴斯德畢赤酵母中最常用的密碼子中復(fù)制的，以防止編碼相同氨基酸的tRNA潛在耗盡[23]。結(jié)果表明，根據(jù)表達宿主的密碼子偏好進行的修飾是有效的，改造后的家蠅乙酰膽堿酯酶在畢赤酵母GS115 中實現(xiàn)了mdAchE 的分泌表達。

本研究利用畢赤酵母表達的mdAchE 具有良好的酶學(xué)特性：重組酶mdAchE 最適pH 值為8.5，而抑制試驗中所用的中磷酸鹽緩沖液的pH 值為8.0，因此重組酶mdAchE 更適用于農(nóng)藥敏感性測定；重組酶mdAchE 最適溫度為60 ℃，這就使得mdAchE 在對酶溫度要求較高的食品、化學(xué)制品應(yīng)用方面具有更好的優(yōu)勢[24]。不同濃度的金屬離子對mdAchE 酶活力的影響差異顯著，抑制作用Mg2+＞Ca2+＞Zn2+＞Cu2+＞Mn2+＞Fe3+，1 mmol/L Fe3+相對酶活力最低，隨著離子濃度的增大，相對酶活力基本呈下降趨勢；隨著有機溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大，它們（尿素、乙醇、丙酮）對酶活力的抑制作用增強，其原因可能是一方面酶的“柔性”因含水量的下降而減小[25]，導(dǎo)致酶抵抗失活的能力減弱，另一方面有機溶劑的分子會介入酶分子的內(nèi)部，改變了酶微環(huán)境的極性，從而降低酶的催化活性[26]。

mdAchE 對本研究中檢測的15 種有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥中的10 種表現(xiàn)出高度敏感性。其中對敵敵畏、馬拉硫磷和樂果等有機磷農(nóng)藥的最低檢測限均低于正在實施的國家標(biāo)準(zhǔn)[27]；對克百威、仲丁威等氨基甲酸酯類農(nóng)藥的最低檢出限低于李艷芳等[28]采用液相色譜-質(zhì)譜法測定的農(nóng)藥最低檢測限；與李純睿[29]獲得的擬環(huán)紋豹蛛AchE相比，重組酶mdAchE 對多數(shù)有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥表現(xiàn)出更高的敏感性。

本研究將密碼子優(yōu)化后的家蠅乙酰膽堿酯酶基因，在畢赤酵母中進行異源表達，并探究了重組酶mdAchE 的性質(zhì)，其對于多數(shù)有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的最低檢測濃度在0.05～0.1 μg/mL，有些濃度甚至低于2.5×10-7μg/mL，低于多種檢測方法測得的最低檢測濃度[30-32]，降低了農(nóng)藥殘留檢測的最低濃度閾值。這些結(jié)果都表明重組酶mdAchE在有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢測方面具有很強的應(yīng)用潛力。雖然重組酶mdAchE 在畢赤酵母中成功表達，但其表達量不高（酶的比活力為47.16 U/mg），一些氨基酸結(jié)構(gòu)[33]、稀有密碼子[34]的選用對蛋白質(zhì)在外源表達系統(tǒng)的表達量也有很大的影響，在之后的試驗中將對此進行更加深入的研究，以期提高家蠅乙酰膽堿酯酶的表達量。