多效唑?qū)釁^(qū)土壤細菌和真菌的影響及網(wǎng)絡互作分析

陳麗君，周彥妤，靳曉拓，宋 禹，吳春蕊，趙洪偉*

(1.海南省植物保護總站，海南 ?？?570100；2.海南省熱帶生態(tài)環(huán)境修復工程研究中心&海南省農(nóng)林環(huán)境過程與生態(tài)調(diào)控重點實驗室，海南大學生態(tài)與環(huán)境學院，海南 ?？?570228)

多效唑(PBZ)是一種三唑類化合物，具有調(diào)節(jié)植物生長兼廣譜殺菌作用[1]。多效唑通常通過噴施或者直接應用于土壤中，會對作物的生長和土壤微生物活性造成不同程度的影響[2-3]。細菌和真菌群落是土壤微生物中的重要功能群，它們可以通過不同方式來提高土壤養(yǎng)分利用效率[4]。細菌與真菌間的相互作用在土壤環(huán)境中十分重要[5]，細菌和真菌之間的協(xié)同作用不僅利于土壤中有機污染物的生物降解，而且能提高植物抵御環(huán)境脅迫的能力[6-7]。以往的研究強調(diào)了多效唑的過量使用會對土壤微生物有一定負面影響[8-9]，然而這些研究只關(guān)注于評估多效唑?qū)毦鄻有院腿郝浣M成變化等的影響，常忽視微生物間的相互作用分析。但微生物各類群之間有一定的關(guān)聯(lián)性，會形成復雜的相互作用網(wǎng)絡。微生物網(wǎng)絡分析可以揭示微生物群落的復雜性和群落成員之間的相互關(guān)系[10]。本文研究了多效唑?qū)ν寥兰毦驼婢挠绊?，在此基礎上，采用共現(xiàn)網(wǎng)絡分析方法，分析了在不同時間下不同濃度多效唑處理對土壤細菌和真菌相互作用網(wǎng)絡變化的影響，以評估其對土壤細菌和真菌的不利影響，以期為合理使用多效唑提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 95%多效唑原藥，二甲基亞砜，分析級乙腈，土壤DNA 提取試劑盒，DNA膠回收試劑盒。本試驗采用海南大學試驗基地紅壤土。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 根據(jù)多效唑施用推薦用量(2～4mg/kg)和調(diào)研海南省三亞與樂東地區(qū)15個芒果園農(nóng)民實際用量(20～50mg/kg)，設置0、3和30mg/kg 3個處理濃度。施藥前先用DMSO配置濃度為3和0.3mg/mL的多效唑母液。采集土壤并過40目篩后稱取100g土壤于棕色小瓶內(nèi)培養(yǎng)，取出20g土壤，D3處理組加入1.0mL 0.3mg/mL多效唑原藥標準溶液，D30處理組加入1.0mL 3mg/mL多效唑原藥標準溶液，空白組加入1.0mL的DMSO，立即混勻，隨后倒入剩余土壤[11]，反復混勻5min，使其對應的土壤中施藥濃度為0、3、30mg/kg。稱取各瓶的重量并記錄，將土壤樣品置于25℃的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗期間用恒重法給各土樣補充蒸餾水以穩(wěn)定保持土壤含水量為50%。于施藥處理3d(T1)、10d(T2)、60d(T3)、150d(T4)的各采集2份土壤樣品，一份用于多效唑原藥殘留量的測定，一份用于提取DNA用于土壤真菌和細菌高通量測序分析。

1.2.2 樣品預處理 用天平稱取施藥處理3、10、60、150d的土樣3g，每個樣品3個重復，加入3mL蒸餾水、30mL乙腈，放入搖床室溫振蕩2～3h(rpm：230)，振蕩結(jié)束后靜置3h，隨后將上清液倒入比色管中，每份樣品加入1g左右氯化鈉，搖勻直至分層，取上層溶液15mL于棕色瓶進行氮吹，氮吹結(jié)束后加入色譜乙腈1mL定容，過0.22μm有機濾膜后上機檢測。

1.2.3 高效液相色譜分析 使用安捷倫1260高效液相色譜儀(DAD檢測器)測定；C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相為乙腈/水=55/45(V/V)；流速1.0mL/min；多效唑原藥檢測波長：222nm；柱溫30℃；進樣量10.0μL[12]。

1.2.4 DNA提取和測序分析 土壤DNA的提取采用試劑盒(PowerSoil?DNA Isolation kit)；土壤細菌PCR擴增引物：515F(GTGCCAGCMGCCGCG-GTAA)和907R(CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)，土壤真菌PCR擴增引物：ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)'和引物ITS2R (GCTGCGTTCTTCATCGATGC)。PCR擴增引物設計、反應體系與反應條件參考文獻進行[3，13]。樣品DNA的PCR質(zhì)量驗證滿足要求后，委托北京百邁克生物科技有限公司進行細菌16s rRNA測序分析和真菌ITS測序分析，測序平臺為Illumina HiSeq2500，使用百邁克云平臺進行數(shù)據(jù)分析。本研究的統(tǒng)計分析均采用 SPSS v16.0軟件進行分析。

1.2.5 共現(xiàn)網(wǎng)絡構(gòu)建 運用R語言的‘psych’數(shù)據(jù)包[14]Corr.test計算樣品相關(guān)性矩陣并執(zhí)行檢驗不同菌群所有物種間的Pearson相關(guān)性系數(shù)，得到相關(guān)性系數(shù)矩陣和P值矩陣，確定物種間存在相互作用關(guān)系的閾值(ρ>0.8，P-Value<0.05)，利用Gephi 0.9.2軟件進行網(wǎng)絡繪制和計算拓撲性質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多效唑HPLC分析方法 用標準曲線法依次測定了不同濃度多效唑原藥標準樣品的峰面積。多效唑濃度與峰面積線性關(guān)系良好 (相關(guān)系數(shù)R≥0.999)，回歸方程為y = 253.85x-2.386 2，R2= 0.999 8，可滿足多效唑檢測分析要求以實現(xiàn)多效唑的定量分析。添加回收率試驗表明，該方法添加多效唑0～3mg/kg(0、0.03、0.3、3mg/kg)，回收率在96.38%～108.72%之間，變異系數(shù)在2.27%～3.14%之間，滿足試驗分析要求。

2.2 多效唑的降解 (表1)可知土壤中多效唑原藥的殘留量不斷減少，多效唑原藥的降解率隨時間的延長而不斷升高，在施藥處理150d表現(xiàn)出最高降解率。

表1 土壤多效唑原藥降解率

2.3 微生物群落組成 在門水平上，(圖1A)可知T1～T3時期相對豐度>1%的細菌菌門中主要有變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)等，T4時期主要的優(yōu)勢細菌菌門是厚壁菌門(Firmicutes)，CK組(36.42%)、D3處理組(16.99%)、D30處理組(25.54%)。T1～T3時期，與CK組相比，D30處理組中綠彎菌門(Chloroflexi)相對豐度分別增加7.6%、6.7%、7.2%，而酸桿菌門(Acidobacteria)相對豐度分別降低1.5%、7.0%、5.9%。T4時期，與CK組相比，D3處理組綠彎菌門(Chloroflexi)豐度降低5.3%，D3和D30處理組放線菌門(Actinobacteria)相對豐度分別降低37.58%、43.71%，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)相對豐度分別增加6.58%、10.60%。T4時期，擬桿菌門(Bacteroidetes)在CK、D3、D30 處理組中占相對豐度>1%的細菌菌門的11.59%、20.10%、29.60%，處理組相對豐度上升。(圖1C)可知相對豐度>1%的土壤真菌菌門有子囊菌門(Ascomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)。與CK組相比，T1時期D3和D30處理組子囊菌門(Ascomycota)相對豐度分別增加9.63%、21.58%，T4時期分別降低33.80%、7.39%。T2時期D30處理組壺菌門(Chytridiomycota)較CK組相對豐度增加1.82倍，T4時期降低 68.74%。T4時期D3及D30處理組的擔子菌門(Basidiomycota)相對豐度分別比CK組降低55.54%和12.90%。

在屬水平上，(圖1B)可知，相對豐度>1%的細菌菌屬為假諾卡氏菌屬(Sphingomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、諾卡菌屬(Nocardioides)等，T1時期，CK、D3、D30 處理組中的假諾卡氏菌屬(Sphingomonas)，占相對豐度>1%的細菌菌屬的11.00%、10.87%、10.80%，T4時期僅占5.79%、6.06%、5.30%。(圖1D)可知相對豐度>1%的真菌菌屬有Spizellomyces屬、鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉菌屬(Aspergillus)等。T4時期，CK、D3、D30處理組中未分類菌屬和其他菌屬分別占相對豐度>1%的真菌菌屬的86.04%、91.08%、92.84%。T4時期，曲霉屬(Aspergillus)相對豐度分別為2.68%、0.78%、154%，鐮刀菌屬(Fusarium)相對豐度分別為5.80%、4.27%、2.76%，多效唑處理組曲霉屬、鐮刀菌屬相對豐度均下降。在T3時期中，CK組的Spizellomyces屬相對豐度為16.60%，D3處理組(13.68%)和D30處理組(15.42%)的相對豐度均低于CK組。多效唑處理組細菌和真菌群落物種相對豐度與CK組相比，發(fā)生明顯變化，表明多效唑處理對土壤細菌和真菌群落的物種組成有一定影響。

2.4 α多樣性和β多樣性分析 α多樣性是反映細菌和真菌群落多樣性和豐富度的綜合指標，比較樣品的α多樣性指數(shù)，(表2)和(表3)可知，T2時期D3處理和D30處理組Simpson指數(shù)相較于CK組分別顯著降低了38.05%和24.77%，說明多效唑處理在一定程度上促進土壤細菌多樣性增加。T4時期，與CK組相比，D3處理組土壤細菌Shannon指數(shù)顯著下降9.14%，表明隨著時間的延長，低濃度多效唑處理降低土壤細菌菌群多樣性。不同濃度多效唑處理對土壤真菌的多樣性影響不同，T2時期真菌菌群Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)沒有顯著區(qū)別，T4時期D3處理組土壤真菌Shannon指數(shù)顯著增加22.75%，表明隨著時間的延長，低濃度多效唑處理促進土壤真菌菌群多樣性增加。

表2 細菌α多樣性指數(shù)

表3 真菌α多樣性指數(shù)

T2時期，與CK組相比，D3和D30處理組土壤細菌ACE指數(shù)分別顯著降低1.06%和0.52%，土壤真菌ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)無顯著區(qū)別。T4時期，與CK組相比，土壤細菌ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)無顯著區(qū)別，土壤真菌菌群D3處理組ACE 指數(shù)和Chao1指數(shù)相較于CK組分別增加了33.19%和43.54%，D30處理組ACE 指數(shù)和Chao1指數(shù)相較于CK組分別顯著增加了58.24%和73.50%，處理后期土壤真菌豐富度表現(xiàn)出增高趨勢。

對細菌和真菌β多樣性進行分析。土壤細菌的PCoA分析結(jié)果(圖2A)所示，T1至T3時期，各處理組與CK組距離不大，群落結(jié)構(gòu)相似性高，T4時期處理組和CK組距離較遠。說明處理前期，多效唑?qū)毦郝浣Y(jié)構(gòu)影響不大，T4時期多效唑改變了細菌群落結(jié)構(gòu)，同時D30處理組和CK組在主成分2軸區(qū)分，說明隨處理時間增加，高濃度多效唑處理對細菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響。土壤真菌的PCoA分析結(jié)果(圖2B)所示，T1時期處理組兩個樣本與CK組距離不大，說明此時處理組與CK組群落結(jié)構(gòu)相似。T2、T3兩個時期的CK組與多效唑處理組有一定距離，說明土壤真菌群落結(jié)構(gòu)正在發(fā)生改變，T4時期處理組的樣本均分布在主成分1軸的負軸，CK組分布在主成分2軸的正軸，多效唑處理組與CK組的真菌群落相似性不高，表明處理組和CK組土壤真菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯。

2.5 微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡 基于Pearson在科水平上的相關(guān)性構(gòu)建了土壤細菌和真菌互作網(wǎng)絡(圖3)。拓撲特性通常用于描述細菌和真菌相互關(guān)系的復雜模式[15]。在不同處理時期，不同的多效唑處理下，細菌和真菌的互作網(wǎng)絡圖節(jié)點和連接數(shù)發(fā)生了變化。T2時期，CK組網(wǎng)絡共現(xiàn)圖中節(jié)點數(shù)為318，而在D3和D30處理組中觀察到307和315個節(jié)點(表4)。相比之下，CK組網(wǎng)絡更復雜、連接更緊密。多效唑處理組網(wǎng)絡的正相關(guān)比例降低，網(wǎng)絡密度和網(wǎng)絡圖平均度也均

表4 拓撲特性

3 討論

通過多效唑在熱區(qū)土壤中降解率變化研究表明：多效唑具有較長的半衰期，可長期存在于土壤中。Bhattacherjee等人研究發(fā)現(xiàn)，當多效唑在土壤中的殘留量為3.51mg/kg時，處理初期降解較快，后期逐漸變慢，其在土壤中殘留可長達300d[16]，與本文研究結(jié)果相似。施藥150d后，低濃度多效唑處理組降解率低于高濃度多效唑處理組。多效唑在土壤中的降解率可能受到多種因素的影響。土壤微生物對多效唑的降解起重要作用，一些微生物可以降解多效唑，利用其作為碳源維持自身生長，微生物的組成和數(shù)量可以改變微生物降解土壤中多效唑速度[17-19]。當土壤中多效唑殘留濃度較低時，微生物對多效唑的利用效率較低，可能利用其它有機物維持生長[20]。

土壤微生物在調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分循環(huán)、能量流動方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[21]，微生物活性、多樣性對土壤肥力和植物生長有一定影響[22-23]。研究多效唑?qū)ν寥牢⑸锶郝涞挠绊懀瑢釁^(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。土壤微生物彼此之間存在復雜的關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡[24]，單一分析土壤細菌或真菌的群落結(jié)構(gòu)變化和多樣性不能全面評估施用多效唑?qū)ν寥牢⑸锶郝涞挠绊?。本文采用高通量測序技術(shù)研究了多效唑?qū)釁^(qū)土壤細菌和真菌的影響，同時構(gòu)建土壤細菌和真菌互作網(wǎng)絡，進一步分析了施用多效唑?qū)ξ⑸锘プ骶W(wǎng)絡的影響。物種組成分析表明，經(jīng)多效唑處理后，土壤細菌和真菌優(yōu)勢菌門和屬的相對豐度發(fā)生變化，不同處理時期，變化程度和趨勢不同。子囊菌門、壺菌門、擔子菌門相對豐度都隨著施藥處理時間的延長而降低。施用多效唑150d后，放線菌門相對豐度均下降，芽單胞菌門、擬桿菌門相對豐度均增加。處理組曲霉菌屬相對豐度隨著處理時間的增加逐漸降低。Xu等[25]報道了曲霉屬是對農(nóng)藥有降解作用的真菌屬，曲霉菌屬相對豐度升高，可能對多效唑原藥起到一定降解作用。相對豐度>1%的土壤真菌優(yōu)勢菌屬中包含鐮刀菌屬，伴隨著一些有防治病害功能的菌屬相對豐度降低，鐮刀菌屬的存在有可能會引起植物萎焉、根腐、穗腐等各種類型的植物病害發(fā)生[26]。但隨著施藥時間的延長，處理組鐮刀菌屬相對豐度下降，表明施用多效唑可能會減少作物受鐮刀菌屬侵害。

微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡越復雜代表微生物可利用的養(yǎng)分越高，微生物間相互作用加強，有助于菌群更有效地利用養(yǎng)分[27]。低濃度多效唑處理10d時促進了土壤細菌多樣性增加，對真菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)沒有顯著影響，同時降低了土壤細菌和真菌互作網(wǎng)絡復雜程度。表明多效唑影響了微生物間相互作用，此外，網(wǎng)絡圖平均度下降、平均聚類系數(shù)的減少和平均路徑長度的增加進一步證明了多效唑?qū)е挛⑸镏g的相互作用減弱，可能會阻礙養(yǎng)分的有效運輸[28]。處理150d后，細菌菌群多樣性降低，真菌菌群的多樣性上升，微生物群落結(jié)構(gòu)都發(fā)生變化，芽單胞菌門相對豐度增加，芽單胞菌門偏向于在營養(yǎng)不良的土壤中生存[15]，表明此時可能土壤養(yǎng)分失衡，土壤養(yǎng)分變化導致了細菌和真菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[29]。處理后期細菌和真菌互作網(wǎng)絡逐漸恢復，土壤細菌和真菌相互聯(lián)系增加，真菌界與細菌界間相互作用的優(yōu)勢菌門屬可能均發(fā)生改變。

高濃度多效唑處理持續(xù)影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，可能由于多效唑在結(jié)構(gòu)上與三唑類殺菌劑類似，對真菌影響較大[8]。處理前期，土壤細菌和真菌互作網(wǎng)絡復雜性降低，微生物之間的相互作用減弱，酸桿菌門相對豐度持續(xù)降低，酸桿菌門在與其它微生物互作中發(fā)揮著重要的作用[30]，這些重要菌屬的相對豐度改變，表明此時互作微生物可能正在發(fā)生較大改變?；プ骶W(wǎng)絡圖中正相互作用減少，施用多效唑可能影響土壤微生物協(xié)同作用，引起不同群落對土壤養(yǎng)分競爭[31]。其他研究也發(fā)現(xiàn)，施用高劑量多效唑會對土壤養(yǎng)分有負面影響[32]。處理150d后，土壤細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，真菌菌群豐富度顯著上升，高濃度多效唑長期脅迫可能導致部分微生物死亡，進而成為碳源促進真菌生長[33]。隨著施藥時間的延長，高濃度多效唑?qū)毦驼婢郝溟g相互作用的干擾不斷減少，細菌和真菌互作網(wǎng)絡逐漸恢復到CK組水平，正相互作用增加，土壤細菌和土壤真菌菌群協(xié)同作用加強，可能利于土壤中多效唑的降解。也有其他研究發(fā)現(xiàn)，細菌和真菌的協(xié)同作用可促進土壤環(huán)境中多環(huán)芳烴降解[34]。細菌在土壤微生物群落中所占的比例較大，群落結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，其通過與真菌直接或間接的相互作用可能會促進微生物群落的恢復。

4 結(jié)論

施用多效唑會改變土壤細菌和真菌群落組成，如能改變變形菌門、酸桿菌門、子囊菌門、壺菌門的相對豐度。多效唑處理可降低土壤細菌和真菌互作網(wǎng)絡的復雜度。隨著處理時間的延長，低濃度處理會降低土壤細菌菌群多樣性，并導致土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)都發(fā)生變化；高濃度多效唑處理對真菌群落結(jié)構(gòu)會造成一定影響，同時也對細菌和真菌互作網(wǎng)絡造成干擾，影響細菌和真菌的相互作用。施用推薦濃度和高濃度的多效唑都可能會在土壤中長期殘留，導致土壤微生物多樣性和微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。