鈣和維生素D膳食補充對大鼠踝關(guān)節(jié)骨折創(chuàng)傷模型破骨細胞活性和骨量的影響分析

彭亮楊鵬劉沖楊金豐馬三輝

(定州市人民醫(yī)院骨科，河北定州 073000)

踝關(guān)節(jié)骨折是臨床上常見的手足創(chuàng)傷疾病，鈣和維生素(Ca/VitD)缺乏可能是影響創(chuàng)傷后骨折愈合的重要因素[1]。VitD通過影響腸鈣吸收、腎鈣再吸收和破骨細胞骨吸收來調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)[2]。VitD缺乏和低鈣供應都會通過骨吸收增加而維持血液中的鈣，從而降低骨量和質(zhì)量[3]。此外，Ca/VitD缺乏癥也可能導致踝關(guān)節(jié)骨折患者中常見的骨折愈合并發(fā)癥[4]，因為鈣對骨折-愈傷組織礦化是必不可少的。但是目前Ca/VitD在手足創(chuàng)傷踝關(guān)節(jié)骨折愈合中的作用仍未得到很好的研究，補充Ca/VitD是否有助于手足創(chuàng)傷骨折愈合也存在爭議[5]。最近，有團隊研究了由次氯酸鈉引起的鈣吸收不良的大鼠骨折愈合，發(fā)現(xiàn)骨折后骨愈合不受影響，而骨骼破骨細胞活性顯著增加[6]。這些結(jié)果表明，當骨吸收不符合愈傷組織礦化的要求時，創(chuàng)傷后骨吸收增強。與此結(jié)果一致，臨床研究中觀察到骨折后全身骨丟失，其表現(xiàn)為骨密度(BMD)降低高達15%[7]。創(chuàng)傷后骨丟失可顯著增加繼發(fā)性骨折的風險[8]。因此得出假設，創(chuàng)傷后骨丟失可能在Ca/VitD缺乏的情況下發(fā)生，然而目前缺乏相關(guān)研究。

因此，本研究采用手足創(chuàng)傷踝關(guān)節(jié)骨折大鼠模型，研究飲食中Ca/VitD缺乏是否會損害骨修復。此外還探討了從踝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷的時間點開始在飲食中補充Ca/VitD對Ca/VitD缺乏飲食者破骨細胞活性和骨量的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

24只清潔級雄性SD大鼠，8周齡，體重約為220 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2015-0004】。飼養(yǎng)于定州市人民醫(yī)院動物實驗室【SYXK(冀)2015-0018】。飼養(yǎng)期間各組大鼠自由飲水，提供足夠飼料。飼養(yǎng)環(huán)境：濕度恒定，溫度控制在22～25℃。所有操作均符合定州市人民醫(yī)院實驗動物管理和使用委員會要求(審批號：DZPH-DW2018003)。

1.1.2 主要試劑與儀器

RNAlaterTM(Sigma-Aldrich)，大鼠抗小鼠FGF23(MAB26291，R＆D Systems Inc，美國)，兔抗小鼠FGFR1/CD331(PA5-25979， Invitrogen， Thermo Fisher Scientific，美國)，生物素偶聯(lián)的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)(B2770，Invitrogen，美國)和生物素偶聯(lián)的山羊抗大鼠IgG(A10517，Invitrogen，美國)。

高分辨率臺式CT(Skyscan 1172，比利時)，倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯，IX73，日本)，低溫高速離心機(Eppendorf，德國)，TP600 型 PCR 儀(TaKaRa，日本)。

1.2 方法

1.2.1 實驗設計

將大鼠隨機分為三組。對照組C組標準喂食(Ca 0.5%，VitD 2000 IU/kg)，而D組和S組則接受Ca/VitD缺乏飲食(Ca 0.25%，VitD 0 IU/kg)。8周后，所有大鼠均接受手術(shù)構(gòu)建大鼠手足創(chuàng)傷踝關(guān)節(jié)骨折模型。手術(shù)后立即將S組轉(zhuǎn)入補充Ca/VitD的飲食(Ca 2.0%，VitD 2000 IU/kg)。第10天和第23天處死大鼠(n＝8)，并評估手足創(chuàng)傷術(shù)后踝關(guān)節(jié)骨折愈合情況。本研究動物實驗經(jīng)倫理委員會的審核批準。

1.2.2 手術(shù)

踝關(guān)節(jié)骨折手術(shù)采用2%異氟烷全麻下進行。為了鎮(zhèn)痛，大鼠在手術(shù)前1 d至術(shù)后3 d飲用水中加入25 mg/mL鹽酸曲馬多。手術(shù)前，所有大鼠均皮下注射抗生素克林霉素-2-二氫磷酸酯(45 mg/kg)。對踝關(guān)節(jié)進行無菌處理后，將大鼠仰臥臥位，右側(cè)髖關(guān)節(jié)外展90°。右膝關(guān)節(jié)彎曲90°。然后在內(nèi)踝處做1 cm縱行切口，鈍性分離皮下筋膜及肌腱，暴露內(nèi)踝。小骨鑿與角度固定器(37°)組合后置于脛骨遠端，中等力度將骨鑿敲入內(nèi)踝，然后采用縫線縫合，術(shù)后允許其自由活動。

1.2.3 血清分析

在給予手術(shù)創(chuàng)傷時(眼眶取血)和實施安樂死當天(心臟穿刺)獲得大鼠血液樣本。I型膠原C端端肽(CTX)、I型前膠原N端肽(PINP)、甲狀旁腺激素(PTH)和成纖維細胞生長因子23(iFGF23，完整和C末端)血清水平采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測定。

1.2.4 微型計算機斷層掃描(μCT)分析

在第23天，采用μCT掃描設備以8 μm的分辨率，50 kV的電壓和200 μA的電壓對踝關(guān)節(jié)進行成像。使用μCT圖像在兩個垂直平面上評估了每個愈傷組織橋接皮質(zhì)的數(shù)量。當觀察到每個愈傷組織≥3個橋接皮質(zhì)時，該骨折被認為“已成功治愈”。

1.2.5 組織形態(tài)計量學和免疫組化

將第10、23天的踝關(guān)節(jié)植入甲基丙烯酸甲酯或石蠟中。采用番紅O染色法進行組織形態(tài)學分析，用圖像分析軟件測定整個愈傷組織中骨、軟骨和纖維組織的相對數(shù)量。第23天采用抗酒石酸磷酸酶染色后，根據(jù)ASBMR指南評估骨細胞參數(shù)[9]。利用圖像分析軟件，在踝關(guān)節(jié)骨折愈傷組織中間1.8 mm×0.9 mm區(qū)域進行成骨細胞和破骨細胞計數(shù)。采用抗體和稀釋液對踝關(guān)節(jié)(D23)的石蠟包埋切片進行FGF23和成纖維細胞生長因子受體1(FGFR1)進行免疫組織化學染色。

1.2.6 骨折愈傷組織的基因表達分析

在第23天，收集踝關(guān)節(jié)愈傷組織并在4℃下儲存在RNAlater中。去除RNAlater后，將斷裂愈傷組織在液氮中快速冷凍，并在振動磨中以30 Hz的頻率粉碎1.5 min。采用試劑盒分離總RNA，將1 μg分離的RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進行定量聚合酶鏈反應(qPCR)。引物序列如下：堿性磷酸酶(ALP，F(xiàn)： 5′-GCTGATCATTCCCACACTTTT-3′和 R： 5′-GAGCCAGACCAAAGATGGAG-3′)，維生素 D 受體(VDR，F(xiàn)：5′-GGGCTTCCACTTCAACGCTA-3′和 R：5′-CATGCTCCGCCTGAAGAAAC-3′)，X 連鎖磷酸鹽調(diào) 節(jié) 基 因 (Phex， F： 5′-TTCCCCAGAGTTTGAC TGGCTG-3′和 R： 5′-TCTCCGAGGGACCAATGTCT-3′)， FGF23(F： 5′-ACAGGAGCCATGACTCGAAG-3′和 R：5′- 將 GCAATTCTCTGGGCTGAAGT-3′) 和FGFR1(F：5′-TGACGACGACGATGACTCCT-3′和 R：5′-AGCTACAGGCCTACGGTTTG-3′)，管家基因 β-2-微球蛋白(F：5′-ATACGCCTGCAGAGTTAAGCA-3′和R：5′-TCACATGTCTCGATCCCAGT-3′)。

1.3 統(tǒng)計學分析

本研究采用GraphPad Prism 6軟件對數(shù)據(jù)進行整理及分析。數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標準差()。當三組相互比較時，通過單因素方差分析(ANOVA)和事后Fishers LSD分析數(shù)據(jù)的顯著性，采用t檢驗比較兩組樣本的顯著性。通過卡方檢驗分析骨折愈合數(shù)據(jù)。P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 手足創(chuàng)傷前大鼠血清及μCT分析結(jié)果

手足創(chuàng)傷前在未骨折(D組和S組)大鼠和對照組(C組)大鼠之間，血清、μCT和組織形態(tài)學參數(shù)差異無顯著性(P＞0.05)(表1)。

2.2 飲食中Ca/VitD缺乏對骨折愈合的影響

為評估Ca/VitD缺乏飲食對大鼠手足創(chuàng)傷術(shù)后骨折愈合的影響。創(chuàng)傷后第10天，未觀察到Ca/VitD缺乏對愈傷組織的顯著影響。到第23天，與C組大鼠相比，D組大鼠的骨折愈傷組織中的BMD顯著降低(P＜0.05)，BV/TV沒有顯著性差異(P＞0.05)，而在組織形態(tài)計量學中，D組大鼠在新形成的愈傷組織中骨量顯著減少(P＜0.001)，纖維組織量顯著增加(P＜0.05)(見表2，圖1A，1B)，而在骨折的愈傷組織中，D組大鼠破骨細胞的數(shù)量和表面顯著增加(P＜0.01)，D組的成骨細胞活性沒有顯著性差異(圖1C)。這些結(jié)果表明在D組大鼠中骨含量略有減少，說明在Ca/VitD缺乏飲食組中手足創(chuàng)傷術(shù)后骨愈合受到了中度干擾。

2.3 飲食中Ca/VitD補充對骨折愈合的影響

Ca/VitD補充劑S組在骨折后10 d無明顯影響。到第23天，S組在踝關(guān)節(jié)愈傷組織中的BMD略有增加，但沒有顯著增加。與D組相比，S組大鼠的愈傷組織中的骨量顯著增加(P＜0.01)，而纖維組織部分顯著減少(P＜0.05)。此外，S組表現(xiàn)出較高的骨折愈合率(P＜0.05)(表3)。

與D組相比，手足創(chuàng)傷術(shù)后23 d，S組大鼠的骨痂成骨細胞標志物ALP mRNA表達顯著增加(P＜0.05)，血清PTH水平顯著降低(P＜0.001)，和C組相比骨吸收標記物CTX的血清水平降低，但骨形成標記PINP的血清水平差異無顯著性(P＞0.05)。這些結(jié)果表明，在手足創(chuàng)傷術(shù)后開始的Ca/VitD補充減少甚至補償了慢性Ca/VitD缺乏的負面影響(表3)。

與此同時，S組iFGF23及cFGF23的血清水平均顯著升高，與D組，C組相比較具有顯著性差異(P＜0.05)。但iFGF23：cFGF23三組無顯著性差異(P＞0.05)說明飲食中補充Ca/VitD對骨折愈傷組織中的iFGF23，cFGF23表達水平具有關(guān)聯(lián)性。與D組的相比，S組中 Phex mRNA表達顯著增加(P＜0.05)，證實了FGF23運轉(zhuǎn)率提高，見表3。

表1 手足創(chuàng)傷前大鼠μCT及血清分析結(jié)果(n＝8)Table 1 CT and serum analysis results of rats before hand and foot trauma(n＝8)

表2 創(chuàng)傷后第23天大鼠骨折愈傷組織μCT分析結(jié)果(n＝8)Table 2 CT analysis of callus of rat fracture on day 23 after trauma(n＝8)

表3 骨折后第23天大鼠骨折愈合參數(shù)及血清分析結(jié)果(n＝8)Table 3 Fracture healing parameters and serum analysis results of rats on 23 d after fracture(n＝8)

圖1 大鼠踝關(guān)節(jié)的組織形態(tài)學分析結(jié)果Note.A.Percentage of bone， cartilage and fibrous tissue in the fracture callus at 10 d.B.Percentage of bone， cartilage and fibrous tissue in fracture callus at 23 d.C.Ankle callus stained with safflower O and tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP).Figure 1 Histomorphological analysis results of rat ankle joint

3 討論

本研究研究了Ca/VitD在手足創(chuàng)傷術(shù)后骨折愈合中的作用。慢性膳食Ca/VitD缺乏大鼠踝關(guān)節(jié)骨折后血清PTH水平明顯升高，破骨細胞活性增加。踝關(guān)節(jié)骨折創(chuàng)傷術(shù)后補充Ca/VitD可促進愈合。因此，本研究證明了在手足創(chuàng)傷術(shù)后骨折愈合過程中充足的Ca/VitD的供應可減少Ca/VitD缺乏飲食者破骨細胞活性和增加骨量，改善骨修復，在臨床上具有高度的相關(guān)性。

由于鈣在骨再生過程中對愈傷組織礦化至關(guān)重要，因此，本研究研究了Ca/VitD缺乏是否影響骨修復。D組表現(xiàn)出中等程度的骨折愈合，骨折愈傷組織中骨含量減少及破骨細胞數(shù)量增加。D組的PTH水平高可能是愈傷組織中破骨細胞活性顯著增加的原因。關(guān)于Ca/VitD缺乏對骨愈合的影響，目前對大鼠的研究數(shù)量有限，已有少量研究報道了對愈傷組織礦化和生物力學骨特性的相互矛盾的影響[10-11]。與本研究結(jié)果一致，愈合受損和不愈合的患者與正常愈合的患者相比，血清維生素D水平較低[12]。此外，本研究證明了補充Ca/VitD可以消除先前缺乏飲食的負面影響，這一點可以通過骨折愈傷組織中骨量增加得到證明。

VitD對骨再生的積極作用主要是通過其對鈣穩(wěn)態(tài)的內(nèi)分泌作用間接發(fā)揮作用，從而增加骨折愈傷組織礦化的鈣供應。然而，維生素D對骨骼的直接影響也被廣泛討論，因為成骨細胞表達VDR，其在這些細胞上的表達直接受生物活性1，25(OH)2D3調(diào)控[13]。體外研究表明1，25(OH)2D3和VDR可增強成骨細胞分化和礦化，表現(xiàn)為成骨細胞分化標志物ALP活性增加[14]。本研究證明了補充Ca/VitD大鼠手足創(chuàng)傷術(shù)后骨折愈傷組織中VDR和ALP的表達增加?；谶@些結(jié)果，可以說明增強的1，25(OH)2D3/VDR信號在骨折愈傷組織中的局部作用可能也有助于Ca/VitD治療誘導的骨折愈合改善。然而，需要進一步的研究探討其確切機制。

此外，本研究還研究了FGF23，是礦物質(zhì)和VitD代謝的調(diào)節(jié)劑，對有效的骨愈合非常重要。在S組大鼠中，iFGF23和cFGF23血清水平均顯著增加，表明FGF23周轉(zhuǎn)率提高。但是，iFGF23：cFGF23的比例未改變，可能表明其生物活性FGF23不變。與此一致，骨折愈傷組織中的FGF23和FGFR1表達不受Ca/VitD補充的影響，表明局部FGF23信號不受影響。骨折愈傷組織中的內(nèi)肽酶Phex mRNA表達增加，表明FGF23裂解支持大鼠中FGF23更新。但是，需要進一步的研究來證實。

總之，本研究表明，Ca/VitD補充劑在踝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷術(shù)后可減少Ca/VitD缺乏飲食者破骨細胞活性和增加骨量，改善骨修復，可減少患者發(fā)生繼發(fā)性骨折的風險。