連續(xù)性血液透析濾過聯(lián)合依那普利對急性重癥胰腺炎大鼠腎功能及腸功能的改善作用

劉倩，魯華，郭更新，劉靜，李娜

(1.邢臺市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 邢臺 054001；2.邢臺市人民醫(yī)院產(chǎn)科，河北邢臺 054001)

急性重癥胰腺炎具有發(fā)病急、進(jìn)展快、病情重的臨床特點，常伴有多器官功能的改變，如肺、腎、腸道等，急性重癥胰腺炎引起的多器官功能衰竭是急性重癥胰腺炎患者死亡的主要原因[1-2]。因此，及早的防治器官衰竭有重要的臨床意義。目前，針對急性重癥胰腺炎合并多器官功能障礙尚無特效療法。王鋒等[3]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)性血液透析濾過能夠有效改善急性重癥胰腺炎大鼠的腸功能障礙。依那普利是常用的降壓藥，對于腎有一定的保護作用[4]。但連續(xù)性血液透析濾過聯(lián)合依那普利用于急性重癥胰腺炎的研究較少，依那普利(enalapril)是屬于血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制類降壓藥，具有擴張血管作用，主要用于高血壓、心理衰竭等疾病[5]。故本研究聯(lián)合連續(xù)性血液透析濾過和依那普利，探討其對急性重癥胰腺炎大鼠腎功能和腸功能的影響，并初步分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

60只6～8周齡清潔級雄性的SD大鼠，體重200～240 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號【SCXK(京)2019-0002】，動物實驗室的使用許可證號【SYXK(冀)2019-0003】，實驗動物福利倫理(審批號2019A005號)。飼養(yǎng)條件：溫度20～24℃，濕度40%～60%，每12 h晝夜交錯。

1.1.2 主要試劑與儀器

依那普利，純度為97%，購自上海源葉生物科技有限公司；蘇木素、伊紅購自上海恒斐生物科技有限公司；ET試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司；ELISA試劑盒購自武漢菲恩生物科技有限公司；FITC-Dextran購自美國MCE公司；BCA試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；蛋白一抗購自美國 Life Technologies公司；標(biāo)記二抗辣根過氧化物酶兔抗蛋白購自上海優(yōu)予生物科技有限公司。iMark酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad，F(xiàn)-4600型熒光分光光度計購自日本日立。

1.2 方法

1.2.1 動物模型

腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，于上腹部正中作切口，小心分離膽胰管，夾閉肝門處胰膽管，由十二指腸前壁進(jìn)針，向胰膽管注入3%?；悄懰徕c(流速為0.1 mL/kg)。待見胰腺出現(xiàn)水腫出血時，提示急性重癥胰腺炎大鼠模型復(fù)制成功[6]。松開血管夾，逐層縫合、關(guān)腹。術(shù)后注意保溫，大鼠均自由攝食飲水。

1.2.2 分組及干預(yù)

60只SD大鼠隨機分為5組：對照組、模型組、連續(xù)性血液透析濾過組、依那普利組及連續(xù)性血液透析濾過聯(lián)合依那普利組，除對照組外均采用牛黃膽酸鈉誘導(dǎo)急性重癥胰腺炎大鼠模型，對照組處理：手術(shù)后進(jìn)翻動腸道和膽胰管，注射等量生理鹽水。術(shù)前7 d灌胃10 mg/(kg·d)的依那普利，每天1次。建模成功后立即連續(xù)性血液透析濾過4 h，具體操作如下：(1)腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，后續(xù)操作中每1～2 h追加劑量(首次劑量的1/4)，維持麻醉狀態(tài)；(2)建立靜脈通路，于頸部作切口，分離右側(cè)頸動脈，結(jié)扎頸動脈遠(yuǎn)心端，并臨時夾閉近心端，緩慢插入PE50導(dǎo)管，連接三通閥后松開動脈夾，緩慢注入肝素生理鹽水(預(yù)防凝血)，參照上述方法分離左側(cè)頸靜脈插管；(3)連續(xù)性血液透析濾過，以右側(cè)頸動脈為體外循環(huán)的流出通路，左側(cè)頸靜脈為流入通路，連接瑞典金寶AK100透析機，參數(shù)設(shè)置：置換液流速0.4～0.5 mL/h，血流速度0.8～1.0 mL/min，過程中予以肝素抗凝。對照組和模型組分別皮下注射生理鹽水，并以等量生理鹽水灌胃。

1.2.3 觀察指標(biāo)

透析處理后，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，取腹主動脈血4～5 mL，分別置于EDTA抗凝管和普通采血管中；采集大鼠胰腺、腎及腸粘膜組織，部分固定于4%甲醛中，剩余凍存于液氮罐中。

(1)組織HE染色

于4%甲醛中取出大鼠組織，脫水后行常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為4 μm，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色后，光鏡下觀察大鼠胰腺、腎及腸粘膜組織的病理變化。參照Shmidt評分[7]，以水腫、壞死、出血及炎癥細(xì)胞浸潤評價胰腺組織損傷程度，各項評分0～4分，最終評分為各項目評分之和的四分之一。參照腎病理損害標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估[8]，具體為：0分為腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常；1分為腎小球結(jié)構(gòu)正常，腎小管上皮濁腫；2分為腎小球瘀血或缺血性改變，腎小管上皮變性，細(xì)胞界限模糊，管腔出現(xiàn)變窄、閉塞或水腫；3分為在2分的基礎(chǔ)上，成片出現(xiàn)腎小管上皮壞死。參照Chiu腸粘膜損傷評分[9]，具體為：0分為腸粘膜絨毛正常；1分為絨毛頂端出現(xiàn)間隙，伴有充血；2分為上皮下間隙擴大，伴有水腫、乳糜管擴張等；3分為水腫明顯，上皮細(xì)胞變性、壞死或少數(shù)絨毛脫落；4分為上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落或部分絨毛脫落，固有層裸露，血管擴張、充血；5分為絨毛脫落、固有層崩解，出血或形成潰瘍。

(2)血指標(biāo)檢測

EDTA抗凝管中血液經(jīng)離心沉淀后，取上層血漿檢測內(nèi)毒素(ET)、D-乳酸(D-LC)的含量；普通采血管中血液經(jīng)離心沉淀后，取上層血清檢測淀粉酶(AMY)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)的含量。ET檢測為終點顯色法鱟試劑[10]，梯度配制ET標(biāo)準(zhǔn)溶液，取無熱原試管加入100 μL ET檢查用水、標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本，再混入100 μL鱟試劑，37℃孵育 1 min，加入100 μL顯色基質(zhì)，37℃孵育2 min，分別加入500 μL偶氮化試劑，混勻后靜置5 min，于545 nm處檢測各孔吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度-吸光值曲線，計算ET的含量。其余指標(biāo)檢測均為ELISA法[11]，梯度配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，將標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本(每孔100 μL)加入孔板中，封孔后37℃下孵育90 min，加入生物素化抗體工作液(每孔100 μL)，封孔后37℃下孵育60 min，加入酶結(jié)合物工作液(每孔100 μL)，封孔后37℃下孵育 30 min，加入顯色劑(每孔 100 μL)，避光處37℃下孵育 10 min，加入終止液(每孔 100 μL)，于450 nm處檢測各孔吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度-吸光值曲線，計算相應(yīng)因子的含量。

(3)腸道粘膜通透性檢測

采用改良Chen法[12]，腸腔注入FITC-Dextran溶液(25 mg/mL)0.2 mL，灌注30 min后取門靜脈血100 μL，加入 Tris緩沖液補至2 mL，以 4230 r/min 離心10 min，取上清液應(yīng)用熒光分光光度計檢測吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度-吸光值曲線，計算 FITCDextran的含量。

(4)蛋白的檢測

取適量組織(約200 mg)置于新鮮、預(yù)冷的蛋白裂解液中勻漿，冰上裂解40 min；以12 000 r/min離心10 min，分離上清液，按1：50配制BCA試劑盒中A、B工作液，并梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品蛋白液，于96孔板中分別添加標(biāo)準(zhǔn)品蛋白液、樣品(每孔20 μL)，再快速混入180 μL工作液，置于37℃下孵育30 min，應(yīng)用酶標(biāo)儀在570 nm處檢測各孔吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)品濃度-吸光值曲線，計算樣品蛋白濃度；配制10%SDS-PAGE凝膠，點樣50 μg變性蛋白在110 V電壓(約1.5 h)下進(jìn)行電泳；待蛋白完全分離時，以300 mA恒定電流電轉(zhuǎn)100 min，將凝膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜；取出PVDF膜置于封閉液中，室溫下孵育2 h；取出PVDF膜清洗后，加入一抗蛋白，4℃下孵育過夜；取出PVDF膜清洗后，加入標(biāo)記二抗辣根過氧化物酶兔抗蛋白，37℃下孵育1 h；最后滴加化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行顯影[13]。以β肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參，半定量分析腎及腸道中α血管平滑肌肌動蛋白(α-Vascular smooth muscle actin，α-SMA)、高遷移率族蛋白 B1(high mobility groupbox protein 1，HMGB1)、E鈣黏素(E-cadherin)及閉合蛋白(occludin)的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采取軟件SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用Students t檢驗或 ANOVA分析，P＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胰腺、腎和腸粘膜組織病理改變

如圖1，對照組胰腺、腎和腸粘膜組織結(jié)構(gòu)清晰，未見損傷。模型組胰腺組織結(jié)構(gòu)紊亂，間質(zhì)水腫、出血明顯，大量細(xì)胞壞死和炎性浸潤；腎組織出現(xiàn)不用程度的腎小管上皮水腫，腎小球出血或缺血性改變，間質(zhì)出血、水腫嚴(yán)重，大量上皮細(xì)胞壞死；腸粘膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死、脫落、水腫及充血。與對照組比較，模型組各組織病理評分顯著增加(P＜0.05)；與模型組比較，經(jīng)血液透析濾過、依那普利處理后，大鼠胰胰腺、腎和腸粘膜組織損傷明顯減輕，病理評分降低，且聯(lián)合處理組效果最好(P＜ 0.05)。

2.2 各組大鼠腎功能指標(biāo)水平的比較

如圖2，與對照組相比，模型組血清AMY、BUN、Cr水平顯著上升(P＜0.05)；與模型組比，血液透析濾過、依那普利處理后顯著降低AMY、BUN、Cr水平(P＜0.05)，且聯(lián)合處理組下降作用更顯著(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠腸功能指標(biāo)水平的比較

如圖3，與對照組相比，模型組血漿ET、D-LC水平顯著上升(P＜0.05)；與模型組相比，血液透析濾過、依那普利處理后顯著降低 ET、D-LC水平(P＜0.05)，且聯(lián)合處理組下降作用更顯著(P＜ 0.05)。

圖1 各組大鼠胰腺、腎和腸粘膜組織病理改變Note.Compared with control group， aP＜0.05.Compared with model group， bP＜0.05.Compared with CHDF group， cP＜0.05.Compared with enalapril group， dP＜0.05.(The same in the following figures)Figure 1 Pathological changes of pancreas，kidney and intestinal mucosa tissues of rats in each group

圖2 各組大鼠腎功能指標(biāo)水平的比較Figure 2 Comparison on the levels of renal function indexes among all groups

圖3 各組大鼠腸功能指標(biāo)水平的比較Figure 3 Comparison on the levels of intestinal function indexes among all groups

2.4 各組大鼠腸粘膜屏障功能的比較

如圖4，與對照組比，模型組腸道通透性明顯增加(P＜0.05)；與模型組比，血液透析濾過、依那普利處理后大鼠腸道通透性明顯降低(P＜0.05)，且聯(lián)合處理組降低更明顯(P＜0.05)。

2.5 各組大鼠相關(guān)蛋白水平的比較

如圖5，與對照組比較，模型組大鼠腎組織中α-SMA的表達(dá)顯著上調(diào)，E-cadherin的表達(dá)顯著下調(diào)，腸組織中HMGB1的表達(dá)顯著上調(diào)，Occludin的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)；與模型組相比，血液透析濾過、依那普利處理后α-SMA及HMGB1的表達(dá)顯著下調(diào)，E-cadherin和Occludin的表達(dá)顯著上調(diào)，且聯(lián)合作用效果更好(P＜0.05)。

圖4 各組大鼠腸粘膜屏障功能的比較Figure 4 Comparison of intestinal mucosal barrier function among all groups

3 討論

本研究采用?；悄懰徕c誘導(dǎo)大鼠，胰腺組織出現(xiàn)明顯水腫、出血癥狀，光鏡下觀察到胰腺組織不同程度的充血、水腫、壞死及炎性浸潤；同時，急性重癥胰腺炎發(fā)生過程中，由于炎癥介質(zhì)“瀑布樣”釋放，造成“二次打擊”，容易導(dǎo)致多器官組織損傷和功能障礙，本研究中模型大鼠腎和腸道也出現(xiàn)明顯損傷，表明急性重癥胰腺炎大鼠模型構(gòu)建成功。相關(guān)動物研究證實，依那普利在多種因素引起的腎病中，對大鼠腎功能均具有保護作用，可能介導(dǎo)腎素-血管緊張素系統(tǒng)，抑制足細(xì)胞凋亡，從而減輕腎細(xì)胞損傷[14]。另外，Dahlgren等[15]研究發(fā)現(xiàn)，依那普利可通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，增強大鼠腸道的防御作用。

腎是身體的主要排泄、內(nèi)分泌器官，具有排泄代謝廢物、調(diào)節(jié)代謝平衡及分泌激素等功能，有助于機體維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[16]。研究發(fā)現(xiàn)，急性重癥胰腺炎會引起有效循環(huán)血容量相對或絕對的不足，降低腎小球濾過率，引起血清AMY、BUN、Cr水平上升[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)性血液透析濾過聯(lián)合依那普利可明顯改善模型大鼠腎組織損傷，降低血清AMY、BUN、Cr的水平，與 Chen等[18]研究結(jié)果相似。表明連續(xù)性血液透析濾過聯(lián)合依那普利可有效保護模型大鼠腎功能的作用。當(dāng)腎組織出現(xiàn)損傷時，往往伴隨著腎小管間質(zhì)纖維化，其中腎小管細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是其主要的生理基礎(chǔ)；E-cadherin是細(xì)胞間維持粘附作用的主要蛋白，而α-SMA是間質(zhì)細(xì)胞中的標(biāo)志蛋白[19-20]。因此，腎出現(xiàn)損傷時，E-cadherin表達(dá)會下調(diào)，而α-SMA會上調(diào)。本研究結(jié)果顯示，連續(xù)性血液透析濾過聯(lián)合依那普利可顯著上調(diào)模型大鼠腎中E-cadherin的表達(dá)，下調(diào) α-SMA的表達(dá)，提示連續(xù)性血液透析濾過聯(lián)合依那普利可能通過抑制腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減輕腎組織損傷，從而起到保護急性重癥胰腺炎腎功能的作用。

圖5 各組大鼠相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 5 Expression of related proteins in each group

研究證實，大量炎性因子的釋放會損傷腸道屏障功能，增加其通透性，導(dǎo)致機體易繼發(fā)感染[21]，因此，急性重癥胰腺炎患者往往伴隨著腸道功能的損害。腸道通透性增加誘發(fā)細(xì)菌易位，使細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物進(jìn)入體循環(huán)，進(jìn)一步活化單核-巨噬細(xì)胞，再次放大炎癥信號，造成全身性炎癥損傷[22]。ET是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是炎癥反應(yīng)的主要觸發(fā)因素；而D-LC是細(xì)菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，體內(nèi)D-乳酸主要來源于腸道[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)性血液透析濾過聯(lián)合依那普利可明顯改善模型大鼠腸粘膜損傷，降低大鼠腸粘膜通透性，下調(diào)血清ET、DLC的水平，與Kang等[24]研究結(jié)果相似。表明連續(xù)性血液透析濾過聯(lián)合依那普利可有效保護模型大鼠腸道功能的作用。HMGB1屬于炎癥介質(zhì)，可介導(dǎo)腸黏膜屏障損傷，導(dǎo)致其通透性增加[25]。Occludin是細(xì)胞膜緊密連接蛋白，對維持腸粘膜屏障功能有著重要的作用[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)性血液透析濾過聯(lián)合依那普利可顯著上調(diào)模型大鼠腸粘膜組織中Occludin的表達(dá)，下調(diào)HMGB1的表達(dá)，提示連續(xù)性血液透析濾過聯(lián)合依那普利可能通過維持腸粘膜上皮的連接，并下調(diào)炎性介質(zhì)，起到保護急性重癥胰腺炎腸功能的作用。

綜上所述，連續(xù)性血液透析濾過聯(lián)合依那普利能夠有效改善急性重癥胰腺炎大鼠腎功能及腸功能，可能與下調(diào) α-SMA、HMGB1的表達(dá)，上調(diào) E-cadherin和Occludin的表達(dá)有關(guān)，為連續(xù)性血液透析濾過聯(lián)合依那普利臨床用于急性重癥胰腺炎的治療提供了的理論基礎(chǔ)。