亞甲基丁二酸在雄性C57BL/6J 小鼠體內(nèi)半數(shù)致死量和半衰期的測定

郭陽陽 ，雷和花 ，王玉蘭

1. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049；2. 中國科學(xué)院精密測量科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新研究院波譜與原子分子物理國家重點實驗室武漢磁共振中心，武漢430071；3. 新加坡表型中心，李光前醫(yī)學(xué)院，生命科學(xué)院，南洋理工大學(xué)，新加坡639646

亞甲基丁二酸（itaconic acid，ITA）又名衣康酸、甲叉琥珀酸，是一種不飽和二元有機酸，因其具有活潑的化學(xué)性質(zhì)，是化學(xué)工業(yè)的重要原料[1]。目前，大多數(shù)的ITA 是由土壤真菌土曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的[1]。在生物體內(nèi)，ITA是由三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物順烏頭酸經(jīng)順烏頭酸脫羧酶（cis-aconiticacid decarboxylase，CAD）催 化 生 成[2]。在哺乳動物體內(nèi)CAD 就是免疫應(yīng)答基因-1 蛋白（immuneresponsive gene 1 protein，IRG1）[2]，IRG1 是哺乳動物體內(nèi)一種重要的免疫蛋白，是免疫代謝中的關(guān)鍵成分，是產(chǎn)生ITA 的關(guān)鍵酶。已有研究[3]證明ITA 可以抑制細菌體內(nèi)的乙醛酸循環(huán)中的異檸檬酸裂合酶而達到其抗菌的效果。ITA 在巨噬細胞的線粒體合成后，可以抑制琥珀酸脫氫酶的活性[4]。與此同時ITA 也可以分泌到胞漿中抑制KEAP1的活性，從而激活核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2），導(dǎo)致IFN γ 和IL-1β 的含量降低[4]，使機體的炎癥反應(yīng)減輕。急性毒理實驗可以初步了解外源化學(xué)物質(zhì)急性毒性強度，從而評價外源化學(xué)物質(zhì)的安全性[5]。藥物半衰期（half-life）是外源性藥物在體內(nèi)代謝的重要參考[6]。因此，本文測定了ITA 的半數(shù)致死量（half-lethal dose，LD50）來評價其安全性，同時測定了半衰期來作為ITA 在體內(nèi)代謝的一個參數(shù)，為動物實驗給藥的劑量和時間提供重要的依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 試劑與儀器

ITA 購于薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司，生產(chǎn)批號BH290028；生理鹽水購于武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責任公司，生產(chǎn)批號1905300801；HPLC 級別甲醇、甲酸、乙腈購于美國Thermo Fisher Scientific 公司，生產(chǎn)批號19045130。Agilent 6460 UPHLC-ESI-QqQ 儀器購于美國Agilent 公司。

1.2 實驗動物

8 周齡SPF 級C57BL/6J 小鼠購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證編號SCKK（湘）2016-0002]，飼養(yǎng)于中國科學(xué)院精密測量科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新研究院小洪山園區(qū)SPF 級實驗動物中心動物房[實驗動物使用許可編號SYXK（鄂）2015-0051]。適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周，小鼠自由攝取食物和水。溫度21 ～25℃，濕度45%～70%，換氣次數(shù)30 ～50 次/h，光照/黑暗的自動切換時間12 h。半數(shù)致死量實驗中LD0和LD100組每組6 只小鼠，共分為7 組，LD50組每組12 只小鼠，共分為6 組。本研究經(jīng)中國科學(xué)院精密測量科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新研究院倫理委員會 批準。

1.3 色譜質(zhì)譜實驗

取50 μL 小 鼠 血 漿 樣 品，100 μL 甲 醇，50 μL 超 純水，混勻后離心取上清。上清液用0.45 μm 濾頭過濾至進樣瓶中。使用超高效液相色譜系統(tǒng)和QQQ 串聯(lián)質(zhì)量分析器的Agilent 6460 三重四極桿系列采集數(shù)據(jù)，超高效液相色譜系統(tǒng)是配備了G4220A 二元泵和G4226 自動進樣器的Agilent 1290 系列。流動相A 是水+0.01%甲酸，流動相B 是乙腈。色譜柱使用Zorbax Eclipse Plus C18（1.8 μm，50 mm×2.1 mm）。色譜條件：流速0.25 mL/min；溫度40℃；進樣量 0.5 μL。質(zhì)譜采用單離子檢測（single ion monitoring，SIM）負離子模式。

1.4 半衰期和半數(shù)致死量實驗

經(jīng)尾靜脈將ITA 注射進小鼠體內(nèi)。注射完成后開始計時，并于注射后0.5 h 和2 h 時采集小鼠眼底靜脈叢血液，4 ℃靜止4 h，取上清制成血漿樣品待測。小鼠經(jīng)尾靜脈注射不同濃度的ITA 后連續(xù)觀察14 d 小鼠的狀態(tài)和存活情況并記錄，將記錄的數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 軟件計算得出半數(shù)致死量和半衰期。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ITA LD50 的測定

ITA 經(jīng)尾靜脈注射入C57BL/6J 雄性小鼠體內(nèi)，觀察14 d 后小鼠的存活情況。通過注射5、50、500 mg/kg 的劑量確定受試濃度應(yīng)該在50 ～500 mg/kg（表1）。隨后，通過注射100、200、300、400 mg/kg 的劑量確定合適的受試濃度應(yīng)在200 ～400 mg/kg（表2）。最后，在合適濃度范圍內(nèi)設(shè)置了5 個濃度進行實驗（表3）。

表1 ITA 對C57BL/6J 雄性小鼠的LD0 和LD100Tab 1 LD0 and LD100 of ITA in C56BL/6J male mice

表2 ITA 對C57BL/6J 雄性小鼠的LD0 和LD100Tab 2 LD0 and LD100 of ITA in C56BL/6J male mice

表3 ITA 對C57BL/6J 雄性小鼠的LD50Tab 3 LD50 of ITA in C56BL/6J male mice

根據(jù)以上數(shù)據(jù)利用SPSS 18.0 軟件計算出ITA 的LD50=258.263 mg/kg，95%CI 為（258.263±2.412） mg/kg。

2.2 ITA 半衰期的測定

ITA 經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，注射劑量根據(jù)之前LD50的結(jié)果，選擇100 mg/kg，分別于注射后0.5、2 h 眼底靜脈叢取約500 μL 的全血制成血漿待測。稱取1.000 0 g ITA 溶于超純水，梯度稀釋，依次配置濃度為0、0.001、0.002、0.01、0.1、0.2、0.5 μg/mL 的標準品溶液。標準溶液的色譜圖（圖1）和質(zhì)譜圖（圖2）中，ITA 的峰形良好，無雜質(zhì)被檢測到，濃度（x）和峰面積（y）線性回歸方程為y=53 055.467 880×x（R2=0.994 892 91）。共測定3只C57BL/6J 雄性10 周齡小鼠的ITA 半衰期（表4）。

圖1 ITA 的色譜圖結(jié)果Fig 1 Chromatographic results of ITA

圖2 ITA 濃度為0.02 μg/mL 的質(zhì)譜圖結(jié)果Fig 2 Mass spectrum of ITA at 0.02 μg/mL

表4 ITA 在C57BL/6J 雄性小鼠體內(nèi)的半衰期Tab 4 Half-life of ITA in C57BL/6J male mice

半衰期的計算公式為：

其中，t0、t1為采樣的2 個時間點，c0、c1為對應(yīng)的濃度。

以上結(jié)果得出ITA 在C57BL/6J 小鼠體內(nèi)的半衰期 t1/2=0.485 5 h =29.13 min，由此可見ITA 在 C57BL/6J 小鼠體內(nèi)循環(huán)的半衰期很短。

3 討論

ITA 通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)之后，低劑量組別的小鼠沒有任何明顯的癥狀表現(xiàn)，達到致死劑量的小鼠出現(xiàn)呼吸加深、連續(xù)抽搐等癥狀，并在30 min 內(nèi)死亡。根據(jù)本實驗的結(jié)果，ITA 在小鼠體內(nèi)屬于代謝速率較高的一種藥物。如果要通過體外注射的方法來增加ITA 的濃度來研究其作用，需要頻繁給藥，從而使得多次操作刺激，增加實驗成本，實驗結(jié)果可信度降低。本實驗所用的ITA 的色譜質(zhì)譜檢測方法，線性良好，無雜質(zhì)被檢出，結(jié)果可信。ITA 作為一種具有抗炎效果的物質(zhì)[3]，其抗炎的具體機制還沒有被完全闡明，本實驗的結(jié)果為今后ITA 的研究奠定了基礎(chǔ)。

本實驗條件下得出來的ITA 的LD50為258.263 mg/kg， 我國現(xiàn)行的急性毒性分級標準并沒有靜脈注射方式的標準，但是通過對比其他文獻[7]的結(jié)果，ITA 的LD50屬于較為安全的等級。在實驗中，小鼠的死亡都發(fā)生在注射后的30 min 內(nèi)，按照標準的方法觀察14 d 未見小鼠繼續(xù)死亡[7]，由此可見ITA 的毒性會在很短的時間內(nèi)發(fā)作。根據(jù)半衰期的長短，可將ITA 歸于超快速消除類（t1/2≤ 1 h），這類藥物一般不會在機體內(nèi)大量蓄積，并且會很快被代謝或者排泄出體內(nèi)[8]。超快速消除類藥物要達到作用的血藥濃度需要增加給藥次數(shù)或者使用靜脈滴注的方式給藥。當機體受到病原體入侵產(chǎn)生炎癥時，巨噬細胞在激活的狀態(tài)下產(chǎn)生ITA[9]，使得體內(nèi)的ITA 能維持在一定水平。ITA可以由機體細胞產(chǎn)生，所以將來的研究可探索如何刺激體內(nèi)的細胞產(chǎn)生更多的ITA。

參·考·文·獻

[1] Huang XN, Chen M, Li JJ, et al. Establishing an efficient gene-targeting system in an itaconic-acid producing Aspergillus terreus strain[J]. Biotechnol Lett, 2016, 38(9): 1603-1610.

[2] Campe R, Langenbach C, Leissing F, et al. ABC transporter PEN3/PDR8/ABCG36 interacts with calmodulin that, like PEN3, is required for Arabidopsis nonhost resistance[J]. New Phytol, 2016, 209(1): 294-306.

[3] Michelucci A, Cordes T, Ghelfi J, et al. Immune-responsive gene 1 protein links metabolism to immunity by catalyzing itaconic acid production[J]. PNAS, 2013, 110(19): 7820-7825.

[4] Kobayashi EH, Suzuki T, Funayama R, et al. Nrf2 suppresses macrophage inflammatory response by blocking proinflammatory cytokine transcription[J]. Nat Commun, 2016, 7: 11624.

[5] 李雪健, 張謙, 邢玉舒,等. 急性毒性實驗的研究進展及缺陷[C]// 中國藥物毒理學(xué)會.2017 年(第七屆)藥物毒理學(xué)年會論文集.山西.

[6] 李聯(lián)營. 試分析藥物半衰期與合理用藥[J]. 中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用, 2014, 8(7): 247-248.

[7] 李寅超, 王隨華, 郭琰, 等. 冬凌草二萜類成分半數(shù)致死量的測定[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2011, 31(2): 163-164.

[8] 李大猷. 青霉素靜脈滴注的藥物動力學(xué)及配伍禁忌[J]. 青海醫(yī)藥雜志, 1989, 19(1): 37-39.

[9] Strelko CL, Lu WY, Dufort FJ, et al. Itaconic acid is a mammalian metabolite induced during macrophage activation[J]. J Am Chem Soc, 2011, 133(41): 16386-16389.