ALG3 異常的先天性糖基化疾病相關突變蛋白活性的檢測

羅冰潔，李盛陶，王 寧，高曉冬

江南大學生物工程學院糖化學與生物技術教育部重點實驗室, 無錫 214122

先天性糖基化疾?。╟ongenital disorder of glycosylation，CDG）是由糖鏈合成缺陷引起的先天性新陳代謝紊亂遺傳病，可能會導致嚴重的精神運動遲緩和多器官衰竭[1-2]，大多數CDG 由糖基轉移酶功能的異常引起。

α-1,3-甘露糖轉移酶（α-1,3-mannosyltransferase，ALG3）基因編碼的蛋白存在于內質網（endoplasmic reticulum，ER）腔內，具有多個跨膜域，以多萜醇磷酸甘露糖（dolichylphosphomannose，Dol-P-Man） 為 供 體、Dol-PPGlcNAc2-Man5（DP-Gn2-M5）為受體[3]，在N-糖鏈α-1,6 連接的甘露糖上添加α-1,3 連接的甘露糖殘基，是蛋白N-糖基化前體多萜醇寡糖（dolichol-linked oligosaccharide，DLO）合成途徑中的重要蛋白。人體ALG3 蛋白發(fā)生突變會使DLO 合成受阻，積累糖鏈中間體GlcNAc2-Man5（Gn2-M5）而導致蛋白糖基化異常，引起ALG3-CDG。ALG3-CDG 患者的共同臨床特征包括畸形特征（小頭畸形、面部畸形等）、精神運動遲緩、癲癇和體質量增加緩慢[4-6]、肌張力異常和舞蹈病等[6-7]。研究[4-5,8-9]發(fā)現，不同ALG3-CDG 患者表現出的疾病嚴重程度，包括患者的壽命等均存在差異，其根本原因是ALG3 蛋白發(fā)生突變的位點不同而導致酶活性下降的程度不同。

DLO 合成途徑在幾乎所有真核生物內質網中具有保守性，因此可以使用酵母作為模板研究人類CDG 相關ALG 突變蛋白的致病性。將酵母ALG 基因突變或敲除后，由于蛋白合成過程異常會導致酵母出現溫度敏感的生長缺陷，再將CDG 相關的人ALG 突變體轉入生長缺陷的酵母中，根據其能否回補酵母的生長缺陷來確定此突變位點是否具有致病性[10-11]。然而研究者發(fā)現，ALG3 基因敲除的酵母菌沒有明顯生長缺陷，需要同時敲除寡糖基轉移酶（oligosaccharyl transferase，OST）的一個亞基，才能使酵母出現一定的溫度敏感生長缺陷，再通過回補實驗來衡量ALG3 突變蛋白的活性與ALG3-CDG 疾病嚴重程度的相關性[12-15]。此方法操作復雜且靈敏度低，導致許多ALG3-CDG 相關突變的致病性尚未得到確認[4-5,16]，因此開發(fā)一種直觀、簡潔的檢測方法具有非常重要的意義和應用 前景。

本實驗室前期研究[17]利用大腸埃希菌（Escherichia coli，E. coli）表達了酵母ALG1 蛋白及其突變體，開發(fā)了體外ALG1 蛋白活性的液相色譜-質譜聯用技術（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS） 定 量檢測方法，并利用該方法對ALG1-CDG 患者的疾病嚴重程度進行了分析。隨后為了探究ALG3-CDG 患者ALG3突變蛋白活性與疾病的關系，首先在釀酒酵母來源的ALG3 蛋白N-端引入相對分子質量約13 000 的Mistic 標簽，促進其異源表達[18]，然后在大腸埃希菌體系中表達了Mistic-ALG3 重組蛋白，并利用LC-MS 的方法測定了該蛋白的活性[19-20]。在此基礎上，本研究根據文獻[4-5,8-9]報道的ALG3-CDG 患者的蛋白突變情況對釀酒酵母ALG3 中的對應保守性氨基酸進行了定點突變，探究突變蛋白活性與ALG3-CDG 疾病嚴重程度之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及菌株

PrimeSTAR GXL DNA 聚合酶、限制性核酸內切酶、DNA Ligation Kit（Mighty Mix）、2×Taq Master Mix 購于寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，PCR 產物純化試劑盒、DNA 膠回收試劑盒、柱式質粒DNA 小量提取試劑盒、卡那霉素、氯霉素、脫脂奶粉、異丙基-β-D-硫代 半 乳 糖 苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG） 購于生工生物工程（上海）股份有限公司，SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（增強型）、Immun-Star ? HRP 化學發(fā)光試劑盒、固相萃取空柱管（6 mL）購于上海碧云天生物技術有限公司，DNA 標志物（1 kb plus DNA ladder）、蛋白標志物（blue plus Ⅱ protein marker）、一抗（anti-His mouse monoclonal antibody）、辣根過氧化物酶偶聯的二抗[goat anti-mouse IgG（H+L） HRP conjugate]購于北京全式金生物技術有限公司，固相萃取填料（supelclean ENVI-carb slurry）購于美國Sigma-Aldrich 公司，GDP-甘露糖（GDP-Man）購于青島糖科學生物技術有限公司，其他常用試劑及培養(yǎng)基購于國藥集團化學試劑有限公司?；瘜W合成中使用到的蛋白質均由本實驗室前期合成[17,20-21]。

大腸埃希菌生長培養(yǎng)基為LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基和TB（Terrific-Broth）培養(yǎng)基，均由本實驗室自行配置?？剐耘囵B(yǎng)基是在上述滅菌培養(yǎng)基冷卻至55 ℃以下后，額外添加50 μg/mL 卡那霉素和/或34 μg/mL 氯霉素獲得。

本研究所用到的大腸埃希菌XL-10 Gold 和Rosetta（DE3）均為本實驗室保藏菌株。質粒pET28a-Mistic-ALG3 由本實驗室構建[19]。

1.2 主要儀器

PCR 儀（T100 Thermal Cycler）、SDS-PAGE 凝 膠 電泳儀（Mini-PROTEAN Tetra System）、蛋白轉膜儀（Trans-Blot Turbo）均購于美國Bio-Rad 公司，凝膠成像系統(tǒng)（Tanon-5200Multi）購于上海天能科技有限公司，高速冷凍離心機（CT15RE）購于日本HITACHI 公司，超高效液相色譜酰胺柱（UPLC BEH Amide Column）購于美國Waters 公司，超高效液相色譜儀（Dionex Ultimate 3000 UPLC）、三重四級桿液質聯用儀（TSQ Quantum Ultra EMR）購于美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 突變位點的確定 收集文獻[4-5,8-9]已報道的ALG3-CDG 患者ALG3 蛋白6 個突變位點（I69T、W71R、G96R、M157K、R171Q 和M209T），用Clustal X 軟件對人源ALG3突變蛋白與釀酒酵母ALG3 進行同源比對，發(fā)現這6 個突變位點均在釀酒酵母ALG3 中保守，氨基酸序列比對結果見圖1。并以此為依據設計了對應的釀酒酵母ALG3 突變體（I70T、Y72R、G98R、L157K、R171Q 和M221T）。

圖1 釀酒酵母和人源ALG3 氨基酸序列同源比對Fig 1 Alignment of ALG3 in Saccharomyces cerevisiae (Sc) and Homo sapience (Hs)

1.3.2 融合PCR 構建點突變質粒 本研究所有突變質粒的構建參照文獻[22]所述的融合PCR 方法。根據QuikChange Primer Design 網站在線設計突變引物，以質粒pET28a-Mistic-ALG3 為模板進行第1 次PCR。將第1次PCR 產物經純化后作為引物，進行第2 次PCR。所得PCR 產物按照常規(guī)方法進行后續(xù)純化、酶切、連接、轉化、挑取單克隆提質粒測序驗證。Mistic-ALG3 突變蛋白的引物見表1。

表1 Mistic-ALG3 點突變引物Tab 1 Primers of mutations for Mistic-ALG3

1.3.3 蛋白表達及大腸埃希菌菌膜成分的制備 將pET28a-Mistic-ALG3 質粒及各突變質粒轉化到感受態(tài)大腸埃希菌Rosetta（DE3）中，37 ℃培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落接種至5 mL 抗性LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min 搖床過夜培養(yǎng)（約12 h）后，按照體積的1%接種于抗性TB 培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min 搖床培養(yǎng)至吸光度[D （600 nm）]為0.6 ～1.0，待培養(yǎng)基溫度降至16 ℃后添加終濃度為0.1 mmol/L 的IPTG 誘導培養(yǎng)20 h，收集菌體于離心管中，用適量預冷的緩沖液[25 mmol/L Tris/HCl（pH 8.0）、150 mmol/L NaCl] 吹打混勻菌體；將離心管置于冰水混合物中超聲破碎，4 000×g、4 ℃離心15 min 后，取上清液于100 000×g、4 ℃離心，用提膜緩沖液[50 mmol/L 2- （N-嗎啉代）乙磺酸（MES，pH 6.5）、30%甘油]重懸沉淀，使之成為均一溶液即得到含Mistic-ALG3 及其突變蛋白的大腸埃希菌菌膜成分[19]。

1.3.4 Western blotting 檢測 取合適濃度的蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混合煮5 min，高速離心5 ～10 min 后取上清液上樣于12% SDS-PAGE 凝膠，200 V 恒壓電泳1 h。電泳結束后半干法轉膜，封閉1 h 后加入一抗（抗His 標簽）（1:2 000），室溫孵育2 h，TBST 清洗3 次后加入二抗（1:5 000），室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次，最后用化學發(fā)光法顯色。

1.3.5 Mistic-ALG3 突變蛋白活性的測定 ①底物受體Phytanyl-PP-GlcNAc2-Man5（PP-Gn2-M5）的制備[21]：以Phytanyl-PP-GlcNAc2（PP-Gn2）為底物受體，GDP-Man為糖基供體，用純化的Alg1ΔTM、含有TRX-Alg2 的大腸埃希菌菌膜和純化的Alg11ΔTM 進行催化。反應體系：PP-Gn2（50 μmol/L）、GDP-Man（2 mmol/L）、Alg1ΔTM（80 ng/mL）、含有TRX-Alg2 的大腸埃希菌菌膜（200 μg/mL）、反應緩沖液40 μL，30 ℃靜止反應12 h 后，加入純化的Alg11ΔTM（100 μg/mL），繼續(xù)在30 ℃靜止反應12 h，得到ALG3 的反應底物PP-Gn2-M5。② 糖基供體Phytanyl-Phosphate-Mannose（Phy-P-Man）的制備[19]：以Phytanyl-Phosphate（Phy-P）為底物受體，GDP-Man 為糖基供體，用含有長萜基磷酸-甘露糖轉移酶多肽1（dohchylphosphate mannosyltransferase polypepfide 1，DPM1） 的大腸埃希菌菌膜進行催化。反應體系：50 mmol/L Tris/HCl（pH 7.5）、10 mmol/L MgCl2、1% NP-40、20 mmol/L Phy-P、50 mmol/L GDP-Man、含有DPM1 的大腸埃希菌菌膜（100 mg/mL），30 ℃靜止反應12 h 后，用薄層色譜（TLC）檢測Phy-P 是否完全轉化為Phy-P-Man。③Mistic-ALG3 及突變蛋白的酶活測試：以PP-Gn2-M5 為底物受體，Phy-P-Man 為糖基供體，提取含有Mistic-ALG3或突變蛋白的大腸埃希菌菌膜進行催化反應。反應體系：在生成PP-Gn2-M5 的體系中加入2 mmol/L Phy-P-Man、10 mmol/L MnCl2、含Mistic-ALG3 或突變蛋白（20 mg/mL） 的大腸埃希菌菌膜，30 ℃靜止反應20 h。

1.3.6 糖鏈的純化 參照文獻[19,21]的方法，在酶活測試的反應體系中加入40 mmol/L HCl 300 μL，100 ℃ 1 h 終止反應。用1 mL 固相萃取柱純化糖鏈，步驟如下：分別用甲醇4 mL、100%乙腈4 mL、50%乙腈4 mL、2%乙腈10 mL 平衡柱子；取2%乙腈0.7 mL 加入到反應體系中震蕩混合均勻，高速離心1 min，取上清液上樣于固相萃取柱，重復該步驟1 次；之后用2%乙腈15 mL 分3 次洗脫雜質；最后用1.4 mL 30%乙腈洗脫得到目的糖鏈，收集到的溶液經真空冷凍干燥后，加入40 μL 去離子水溶解。

1.3.7 LC-MS 檢測條件 采用LC-MS 的方法檢測產物糖鏈[20]，其中流動相A 為乙腈、B 為超純水，使用超高效液相色譜酰胺柱分離，柱溫40 ℃。液相條件為：0 ～2 min，20% B；2 ～15 min，20%～50% B；15 ～18 min，50% B。 流速為0.2 mL/min。質譜條件為陽離子模式，質荷比（m/z） 檢測范圍為400 ～2 000。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 7 軟件進行統(tǒng)計分析。定量資料用±s 表示，將7 位患者按照存活時間分為小于1 年組和大于1 年組，比較2 組突變蛋白酶活性，組間比較采用t 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大腸埃希菌表達的釀酒酵母來源重組Mistic-ALG3 的活性定量檢測

首先用化學-酶法合成DP-Gn2-M5 類似物PP-Gn2-M5和Dol-P-Man 類似物Phy-P-Man，再在大腸埃希菌表達釀酒酵母Mistic-ALG3，利用其在體外催化反應生成Phytanyl-PP-GlcNAc2-Man6（PP-Gn2-M6）；同時以僅轉化了空質粒pET28a 的菌株（空載質粒）作為對照。反應結束后，采用LC-MS 的方法檢測產物，定量分析酶活性。由圖2 可知，加入表達Mistic-ALG3 的大腸埃希菌菌膜的樣品出峰時間為15.2 min 和15.3 min，對應的質荷比為1 419.57，指示反應生成的產物為Gn2-M6；而加入空載質粒的樣品出峰時間為14.5 min 和14.6 min，對應的質荷比為1 257.48，指示仍為反應底物Gn2-M5。

圖2 釀酒酵母重組Mistic-ALG3 的活性分析Fig 2 Activity analysis of recombinant yeast Mistic-ALG3

2.2 ALG3-CDG 患者對應重組釀酒酵母ALG3 突變蛋白的原核表達

構建的6 個ALG3 突變的大腸埃希菌表達載體，經過測序驗證后，分別轉化到Rosetta（DE3）菌株誘導表達，超聲破碎后提取大腸埃希菌菌膜成分，通過Western blotting 確認蛋白的表達。結果（圖3）顯示，上述6 個突變蛋白在大腸埃希菌體系中的表達量與野生型（wild type，WT）ALG3 蛋白基本一致。

圖3 酵母Mistic-ALG3 突變蛋白的原核表達Fig 3 Prokaryotic expression of yeast Mistic-ALG3 mutants

2.3 定量分析6 個突變蛋白的相對活性

通過LC-MS 對6 個突變體的活性進行測定，并與野生型ALG3 比較，計算突變蛋白的相對活性。結果（圖4） 顯示，I70T 突變蛋白相對活性為2.8%，Y72R 突變蛋白相對活性為4.9%，G98R 突變蛋白相對活性為4.5%，L157K突變蛋白相對活性為17.2%，R171Q 突變蛋白相對活性為4.8%，M221T 突變蛋白相對活性為22.3%。

圖4 酵母Mistic-ALG3 突變蛋白的活性分析Fig 4 Activity analysis of yeast Mistic-ALG3 mutants

2.4 突變蛋白活性與患者臨床特征分析

將突變蛋白的相對活性與ALG3-CDG 患者的臨床特征匯總后，結果見表2。生存時間較長的患者均為雜合突變，且至少有1 個突變蛋白保留了一定的酶活性。將7 位患者按照存活時間分為小于1 年和大于1 年2 組，雜合突變患者以較高的酶活性為準，比較發(fā)現生存期大于1 年患者對應的突變蛋白活性顯著高于小于1 年的患者（圖5，P=0.002）。

表2 ALG3-CDG 患者突變位點與酵母對應Mistic-ALG3 突變蛋白的活性Tab 2 Mutation sites of ALG3-CDG patients and relative activity of conserved yeast Mistic-ALG3 mutants

Continued Tab

圖5 不同生存期患者對應突變蛋白活性的比較Fig 5 Comparison of activities of corresponding mutations between the patients with different survival periods

3 討論

真核生物ALG3 的天然底物中含有多萜醇（dolichol）結構，但多萜醇水溶性差且不易大量制備[23]，因此本實驗室前期研究中以化學-酶法制備了ALG3 底物類似物PPGn2-M5 和糖基供體類似物Phy-P-Man，并在大腸埃希菌體系表達了釀酒酵母重組Mistic-ALG3 蛋白，利用含有該蛋白的大腸埃希菌菌膜成分催化生成PP-Gn2-M6[19-21]。Mistic-ALG3 屬于多次跨膜蛋白，純化極其困難；而大腸埃希菌沒有DLO 合成途徑，也沒有與ALG3 功能相似的同源蛋白，因此直接利用含有Mistic-ALG3 重組蛋白的大腸埃希菌膜成分催化反應是可行的[20]。在本研究中，參照上述反應體系，定量檢測釀酒酵母重組Mistic-ALG3 的活性，結果確認了大腸埃希菌表達體系得到的釀酒酵母重組Mistic-ALG3 具備較高的反應活性。

本研究進而對ALG3-CDG 相關的酵母保守性Mistic-ALG3 突變蛋白的活性進行了研究。首先確認了6 個ALG3-CDG 相關酵母重組ALG3 突變蛋白在大腸埃希菌體系中蛋白表達量與野生型基本一致，因此在測量它們的活性時，反應中加入相同的總蛋白量即可對突變體和野生型蛋白進行相對活性的比較。

將本研究LC-MS 定量檢測的突變蛋白相對活性與文獻報道的ALG3-CDG 患者臨床特征匯總后發(fā)現：患者1[4]、 患者6 和患者7[9]為純合子突變，即患者ALG3 基因所在的2 條染色體有相同的突變位點。患者1 的突變?yōu)镽171Q，測得其對應的釀酒酵母突變蛋白R171Q 的相對活性僅為4.8%；患者6 和7 的突變?yōu)镚96R，測得其對應的釀酒酵母突變蛋白G98R 的相對活性僅為4.5%，均與3位患者較短的生存期相吻合[9]。

患者2、患者3[5]、患者4 和患者5[8]為復合雜合子突變，即患者ALG3 基因所在的2 條染色體上具有不同突變，疾病嚴重程度往往受活性高的突變體影響較大。患者2 和患者3 的突變位點相同，為W71R 和M157K，測得其對應的釀酒酵母突變蛋白Y72R 的相對活性為4.9%，而L157K 的相對活性為17.2%；同樣地，患者4 和患者5 的突變位點相同，為I69T 和M209T，測得其對應的釀酒酵母突變蛋白I70T 的相對活性為2.8%，而M221T 的相對活性為22.3%。因4 位患者均有一條染色體上的突變位點對應的ALG3 蛋白保留了一定的活性，在報道[5,8]時均依然存活，為7 ～21 歲[8]。

綜上所述，本研究為后續(xù)ALG3-CDG 診斷方法及疾病嚴重程度的預測提供了理論依據。

參·考·文·獻

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