HPLC法同時(shí)測定薔薇紅景天7個(gè)黃酮類化合物的含量

劉雪瀅，張珂，李歡歡，楊璐，潘馨慧，王航宇*，王金輝,3

(1 石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子，832002；2 新疆林業(yè)科學(xué)院/新疆林業(yè)資源與利用國家林草局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊，830052；3 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150081)

薔薇紅景天(RhodiolaroseaL.)是景天科紅景天屬(Rhodiola)植物多年生草木或灌木，主要生長在高寒、缺氧、晝夜溫差大、高海拔的高山礫石和巖石縫隙中，具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力和生命力，被譽(yù)為“高原人參”、“雪山仙草”。紅景天屬植物與人參、刺五加具有相似的功效，是傳統(tǒng)藥食同源植物，多以根、根莖或全草入藥，被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及保健品等領(lǐng)域[1-2]。隨著對紅景天研究的不斷深入，紅景天中黃酮類化合物的藥理活性被逐漸發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物療效顯著，應(yīng)用范圍廣，毒副作用小，具有很多生物活性，如抗氧化、清除自由基、抗缺氧、抗疲勞、調(diào)節(jié)血脂血糖和防治心血管疾病等，在身體保健，疾病預(yù)防和治療方面有很好的效果，也引起了越來越多的關(guān)注[3-4]。

薔薇紅景天的有效成分含量較高，主要活性成分為黃酮類化合物、有機(jī)酸類化合物、苯烷基苷類化合物、多糖類化合物和香豆素類化合物[5]。目前紅景天屬植物中已鑒定了近80種黃酮類化合物，主要有山奈酚、槲皮素、棉黃素、草質(zhì)素、小麥黃素及其苷類化合物，是紅景天藥材中一類重要活性物質(zhì)[6-7]。研究表明山奈酚具有抗氧化、抗癌和預(yù)防心血管疾病等多種藥理活性[8]，草質(zhì)素苷有具有抗氧化和抗炎等藥理活性[9]?！吨袊幍洹?015年版將紅景天苷作為紅景天的指標(biāo)性成分，卻未對黃酮類成分作限定要求，但紅景天中黃酮類化合物含量較高，也是判斷紅景天生藥及其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)[10]。一些定量方法毛細(xì)管區(qū)帶電泳法[11-12]、色譜法[13]、熒光分光光度法[14]已經(jīng)被開發(fā)出來，用于測定紅景天及其產(chǎn)品的活性成分，然而關(guān)于高效液相色譜法同時(shí)測定紅景天中多種黃酮類化合物的研究卻很少，因此我們建立一種高效液相色譜法，同時(shí)測定本實(shí)驗(yàn)室從薔薇紅景天根和根莖中分離得到的7個(gè)黃酮類成分，為薔薇紅景天的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

本研究中，我們建立了高效液相色譜法同時(shí)測定了薔薇紅景天中的7個(gè)黃酮類化合物，如圖1中(1)山奈酚，(2)山柰酚-7-O-α-L-鼠李糖苷，(3)草質(zhì)素-7-O-α-L-鼠李糖苷，(4)山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷，(5)山柰酚-3-O-β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷，(6)草質(zhì)素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷，(7)山奈酚-4'-O-α-L-鼠李糖-3-O-β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷。該方法旨在簡單高效，適合常規(guī)分析和評估薔薇紅景天的質(zhì)量。

圖1 薔薇紅景天中7個(gè)黃酮類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀(Waters 2998型檢測器，Empower 2.0色譜工作站)；KQ3200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DV215CD型十萬分之一電子分析天平(美國Ohaus公司)；QL-861型漩渦混勻器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；TGL-16臺式低速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；FW-100型高速萬能粉碎機(jī)(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

1.1.2 試藥

薔薇紅景天采自于新疆塔城，由譚勇教授(石河子大學(xué))鑒定為薔薇紅景天(RhodiolaroseaL)的干燥根莖。本實(shí)驗(yàn)室從薔薇紅景天的根和根莖中分離出1-7類黃酮化合物的標(biāo)準(zhǔn)品，其結(jié)構(gòu)是根據(jù)光譜分析與參考數(shù)據(jù)進(jìn)行比較而建立的，通過峰面積歸一化法用HPLC-DAD進(jìn)行檢測并通過LC-ESI-TOF-MS和NMR光譜進(jìn)行證實(shí)，得到這7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的純度均在98%以上。甲醇、乙腈為色譜純(J.K Baker 公司，美國)；水為超純水；磷酸為分析純(武漢化學(xué)試劑廠)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna C18 (150 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相A為甲醇-乙腈(1∶1)，流動相B為0.1%的磷酸水溶液，梯度洗脫(0～15 min：20% A→22%A、15～43 min：22% A→35% A、43～55 min：35% A→35% A、55～65 min：35%A→46% A)，流速：1.0 mL·min-1，檢測波長：365 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：5 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品1、2、3、4、5、6、7適量，分別置于5 mL容量瓶中，色譜甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，配制成濃度分別為876、872、884、406、432、810、878 μg·mL-1的對照品儲備溶液。

分別精密吸取化合物1、2、3、4、5、6、7對照品儲備溶液適量至2 mL容量瓶中，色譜甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，即得濃度為29.08、4.36、51.71、11.37、69.12、76.14、22.17 μg·mL-1的混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備

精密稱定薔薇紅景天樣品細(xì)粉1.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱定質(zhì)量后超聲提取30 min，放冷后再次稱定質(zhì)量，缺失的重量加入甲醇補(bǔ)足，搖勻后以4000 r·min-1離心10 min，用0.2 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

精密吸取薔薇紅景天供試品溶液和混合對照品溶液，在“1.2.1”色譜條件下進(jìn)樣分析，樣品色譜中與對照品色譜的相同保留時(shí)間處有色譜峰，7個(gè)黃酮類化合物的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對稱因子均在0.95～1.05之間，理論塔板數(shù)均大于5 000，色譜圖見圖2。

A：從上到下依次是山奈酚、山柰酚-7-O-α-L-鼠李糖苷、草質(zhì)素-7-O-α-L-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、山柰酚-3-O-β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷、草質(zhì)素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、山奈酚-4'-O-α-L-鼠李糖-3-O-β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-葡萄糖苷、混合對照品；B：從上到下依次是薔薇紅景天供試品，混合對照品

2.2 線性關(guān)系的考察

精密吸取“1.2.2”中混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，在“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以混合對照品溶液中各對照品的濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和線性范圍，回歸方程及線性范圍見表1。

表1 薔薇紅景天中7個(gè)分析物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.3 精密度試驗(yàn)

按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取同一混合對照品溶液注入高效液相色譜儀分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得1、2、3、4、5、6、7這7種成分峰面積的RSD分別為1.7%、1.2%、0.4%、1.0%、0.8%、0.6%、0.7%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性考察

取在室溫下放置的同一份薔薇紅景天供試品溶液，并在0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣，依照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣含量測定，結(jié)果顯示上述7種成分峰面積的RSD分別為1.2%、1.0%、1.2%、1.6%、0.5%、1.3%、1.2%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號薔薇紅景天供試品6份，按“1.2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，依照“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測定，結(jié)果顯示上述7種成分峰面積的RSD分別為1.4%、1.6%、1.3%、1.4%、1.5%、1.9%、1.8%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的薔薇紅景天粉末0.5 g，平行稱取6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入適量各對照品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備樣品，以“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，并計(jì)算被測各成分的回收率及RSD。測得上述7種成分的平均加樣回收率分別為97.3%、102.6%、104.1%、103.0%、101.2%、104.8%、97.5%，RSD分別為1.4%、1.0%、1.0%、1.0%、0.8%、1.7%、1.8%，表明采用該方法測定薔薇紅景天7個(gè)黃酮類化合物的含量具有較好的準(zhǔn)確性和可靠性(表2)。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品的含量測定

分別精密稱取5批紅景天樣品粉末約0.5 g，平行3份，按“1.2.3”項(xiàng)下的方法制備樣品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。

并用回歸方程計(jì)算5批紅景天樣品中7個(gè)黃酮類化合物的含量，結(jié)果見圖3和表3。

A:青海 R.kirilowii Maxim；B:新疆 Rhdiola rosea L.(1)；C:新疆Rhdiola rosea L.(2)；D:新疆 Rhdiola rosea L.(3)；E:新疆Rhdiola rosea L.(4)；F:混合對照品

表3 紅景天樣品中7種活性成分的測定 n=3

3 討論

3.1 波長的選擇

參照2015版《中華人民共和國藥典》和本研究相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，將7個(gè)對照品溶液在190 nm～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，以待測化合物紫外吸收為特征，最終確定檢查波長為365 nm，該檢測波長下待測化合物均有良好吸收，能兼顧薔薇紅景天各個(gè)組分的檢測，基線比較平穩(wěn)且干擾峰較少，靈敏度高，具有良好的代表性。

3.2 流動相的選擇

為了使薔薇紅景天7個(gè)黃酮類化合物有更好地分離效果，且不受其他溶劑和組分的干擾，在色譜條件的方法建立過程中，我們對流動相的組成及比例進(jìn)行了考察，對比了不同的流動相系統(tǒng)甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-磷酸水的分離效果，通過優(yōu)化確定甲醇-乙腈-0.1%磷酸水為流動相，梯度洗脫65 min，所測化合物各峰均能達(dá)到較好分離，峰形對稱，試驗(yàn)結(jié)果理想。

3.3 提取方法的選擇

在薔薇紅景天的提取方法上，通過比較回流和超聲兩種方法，發(fā)現(xiàn)超聲提取效率高、穩(wěn)定可靠、操作簡便、可重復(fù)性高。采用超聲提取的基礎(chǔ)上，以薔薇紅景天7個(gè)黃酮類化合物的含量為指標(biāo)，選擇了不同濃度的甲醇提取溶劑(50%甲醇溶液、70%甲醇溶液、甲醇)，并設(shè)置不同提取時(shí)間(15、30、45 min)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)提取溶劑為甲醇，超聲提取30 min時(shí)7個(gè)黃酮類化合物的提取效果最好。

3.4 含量測定

紅景天作為傳統(tǒng)的常用補(bǔ)益類中藥，是近年來的研究熱點(diǎn)之一，但紅景天的種類繁多，不同產(chǎn)地和采收季節(jié)化學(xué)成分差異大，隨著中藥用藥的安全性、有效性和規(guī)范性的問題日益得到重視，建立高品質(zhì)高質(zhì)量的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以保證藥材的質(zhì)量是一項(xiàng)長期而艱巨的任務(wù)[15]。本實(shí)驗(yàn)對來自新疆的和青海的5份樣品進(jìn)行研究，以7個(gè)黃酮類成分含量作為指標(biāo)，結(jié)果表明這5份樣品中7個(gè)黃酮類化合物的含量都有一定差距，新疆薔薇紅景天中黃酮類化合物的含量遠(yuǎn)高于青海狹葉紅景天。以產(chǎn)自新疆的不同采收季節(jié)的薔薇紅景天為研究對象，不同采收季節(jié)的薔薇紅景天中黃酮類化合物的含量也存在顯著差異，進(jìn)一步說明了不同品種和不同采收季節(jié)的紅景天中黃酮類化合物的含量有較大差異，這主要與藥材的產(chǎn)地、野生或栽培、生長年限、取藥部位等因素有關(guān)。本研究結(jié)果表明，該分析方法簡便快速、準(zhǔn)確可靠，可以為薔薇紅景天的質(zhì)量評價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。