甲氨蝶呤PLGA微球制備工藝及體外釋藥性能考察

任澤宇，姜宏，許燕，石永芳

(1 新疆大學機械工程學院，新疆 烏魯木齊 830047；2 新疆醫(yī)科大學醫(yī)學工程技術學院，新疆 烏魯木齊 830011)

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，約占原發(fā)性惡性骨腫瘤42%，每年發(fā)病率約為2～3/100萬/年，多發(fā)于兒童和青少年之間，具有生長迅速與早期轉移等特點[1-2]。目前主要是以術前化療—手術摘除瘤段—術后化療的治療模式[3]。骨肉瘤輔助化療藥物有阿霉素、異環(huán)磷酰胺和甲氨蝶呤(MTX)，其中MTX在遏制骨肉瘤的生長療效最佳[4]，是近30年作為骨肉瘤化療的常用藥。但術后服用甲氨蝶呤等藥物，由于MTX具有毒性，會導致骨組織自身硬度大且病灶區(qū)域藥物濃度較低，若提高患者服用劑量，毒副作用大，患者體內(nèi)易產(chǎn)生耐藥性[5]。現(xiàn)有研究將MTX與生物可降解高分子材料復合制備抗骨肉瘤藥物的骨組織工程支架，使藥物可直接作用于病灶肉瘤組織，殺死殘留腫瘤細胞，大大降低口服MTX的毒副作用[6-7]。但藥物與可降解高分子材料的直接復合，易突釋，造成短時內(nèi)局部藥物濃度過高，釋藥不穩(wěn)定。為實現(xiàn)藥物在病灶區(qū)域的穩(wěn)定和長期持續(xù)釋放，本研究以甲氨蝶呤為藥物，聚乳酸-羥基乙酸共聚物為藥物載體，制備載藥率、包封率以及緩釋性能均良好的載藥微球，為解決骨肉瘤問題提供新的治療方式。

目前，制備載藥微球多采用乳化劑揮發(fā)法，超聲加工制備載藥微球，但超聲加工易出現(xiàn)弊端：一是若超聲時間短，會使大量有機溶劑殘留在微球體內(nèi)，微球質(zhì)量下降；二是若超聲時間長，微球受力不均，會使微球表面凹陷甚至破損，使得微球的載藥率、包封率下降，無法滿足治療目的。因此，研究制備安全，高效，可重復操作的微球加工工藝過程是實現(xiàn)一體化的最終需求。本實驗采用乳化劑揮發(fā)法，通過正交實驗優(yōu)化加工工藝參數(shù)，以微球的載藥率，包封率及其體外的藥物緩釋為評價指標，優(yōu)選微球制備的最佳工藝參數(shù)，并通過釋藥動力學方程探究生物可降解載藥微球在體內(nèi)的釋放過程。

1 材料與方法

1.1 材料

甲氨蝶呤(中國源葉生物公司)；聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA，源葉生物公司，50：50，特性黏度0.26、0.46、1.6 dl/g);聚乙烯醇(PVA，純度>99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；二氯甲烷(南京化學試劑一廠，分析純)；蒸餾水(PH=6.5-7，河南新源科技有限公司)；磁力攪拌器(萊州元茂儀器有限公司)；超速離心機(日本日立SCP85H)；DZD電子天平(天津沐恒稱重設備科技有限責任公司)；恒溫水浴振蕩箱(寧波科學儀器研究所)；UV1900PC 型雙光束紫外可見光分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 MTX-PLGA載藥微球的制備

微球采用O/W乳化劑揮發(fā)法制備[8]。稱取50 mg PLGA溶于2 mL二氯甲烷中，待充分溶解后加入5 mg MTX。按設計要求分別勻速緩慢滴加濃度為1.5%、2%及2.5%的PVA溶液。恒定溫度下，設定不同攪拌轉速，攪拌4～8 h，去除二氯甲烷。所得產(chǎn)物離心分離，去上清液，離心管中沉淀用15 mL PBS搖勻洗滌3次，冷凍干燥24 h后，即可制得MTX-PLGA載藥微球。

1.2.2 MTX-PLGA載藥微球顆粒表征

取少量凍干微球分散在導電膠上，粘牢后對樣塊進行噴金處理，以增強導電性，使用電子掃描顯微鏡，觀察在不同工藝參數(shù)下制備的載藥微球微觀形貌，隨機對樣品的不同區(qū)域進行采集圖像。從掃描電鏡圖中隨機選擇區(qū)域，并隨機挑選500顆形態(tài)完整的微球進行粒徑分布計算。

1.2.3 設計正交實驗

本次實驗在前期實驗基礎上，經(jīng)過分析，設計實驗影響因素主要有制備微球的PVA濃度(mg·mL-1)、磁力攪拌器轉速(r·min-1)、溫度、二氯甲烷劑量、滴加速度，其中前三者影響程度較大。設計正交試驗L9(34)考察多因素條件對載藥微球的載藥量及藥物釋放等影響，研究制備微球的最佳條件，繪制因素水平表1。

表1 正交因素水平表

1.2.4 MTX標準曲線的繪制

精確稱取甲氨蝶呤 25 mg，置于50 mL容量瓶中，制備250 μg·mL-1的標準儲備液，加入不同比例PBS配置5、10、15、20、25、30 μg·mL-1MTX標準溶液。UV- Vis分光光度計在306 nm處測定。MTX標準曲線為Y=23.522X+1.073 6，R2=0.998 2，如圖1所示。

圖1 甲氨蝶呤標準曲線

1.2.5 回收率測定

配置125、50、10 μg·mL-1的高、中、低3個濃度的甲氨蝶呤溶液(pH=7.4的PBS為溶劑)，分別在溶液中加入10 mg空白微球，搖勻，靜置3 min后，離心取上清液，測定其在306 nm處的吸光度A代入標準曲線方程和回收率計算公式得回收率。

(1)

1.2.6 精密度考察

取濃度分別為125、50、10 μg·mL-1的高、中、低3個濃度的甲氨蝶呤溶液，按照1.2.5步驟測定回收率，1 d之內(nèi)重復測定5次，計算平均值為日內(nèi)平均回收率，計算標準差為日內(nèi)精密度。并分別連續(xù)測定5天，計算日間平均回收率，計算標準差為日間精密度(表2)。

表2 微球含量測定方法精密度的考察結果 n=5

1.2.7 載藥量和包封率的測定

精確稱取25 mg微球，置于離心管中，加入5mL PBS緩沖液，離心3次，取上清液，后用超聲機90 W超聲30 min，24 h后再次超聲，后放入37 ℃恒溫水浴中振蕩24 h，離心，取上清液，測定吸光度，根據(jù)公式計算：

(2)

(3)

1.2.8 微球的體外釋放

精確稱取25 mg微球作為實驗組，稱取同等質(zhì)量MTX為對照組，置于透析袋中，加入2 mL PBS緩沖液，用透析夾夾緊。放入裝有50 mL PBS緩沖瓶中，37 ℃下，恒溫水浴振蕩箱振蕩，每隔一定時間取樣5 mL，同時以5 mL PBS作為補充液，所得樣品用紫外分光光度計測量Abs，計算藥物濃度，通過公式計算釋藥百分率：

釋藥率=釋放藥物的質(zhì)量/微球載有藥物質(zhì)量×100%

(4)

1.2.9 釋藥動力學方程擬合

載藥微球進行釋藥動力學的研究，主要為了實現(xiàn)釋藥速率的可控性和可預測性，藥物緩釋可控技術的重要指標是微球緩釋過程中，釋放藥物的速率和釋放量。目前，多位國內(nèi)外的學者通過搭建數(shù)學模型，模擬分析微球釋藥行為，以減少實驗周期，為同類型載藥微球的設計提供參考。

用乳化劑揮發(fā)法制備的微球，會因為有機溶劑的快速揮發(fā)導致微球表面和內(nèi)部形成大量孔隙，這些孔隙為藥物的釋放和材料的降解提供了重要的傳遞通道。而正是由于釋藥后期引發(fā)孔隙的改變，形成復雜多變的釋藥機理。本次實驗通過之前建立起的數(shù)學模型對該實驗方法下制備的載藥微球的緩釋機理進行預測和驗證。采集最優(yōu)加工工藝參數(shù)下制備的微球緩釋數(shù)據(jù)，利用表3中釋藥模型進行動力學方程擬合，推測微球釋藥機理[9]。

表3 釋藥動力學模型

2 結果

2.1 MTX-PLGA載藥微球顆粒表征

通過SEM圖2可知，轉速300 r·min-1條件下制備的載藥微球表面光滑，完整性較好。當轉速達到800 r·min-1時，載藥微球表面出現(xiàn)明顯凹陷。結果表明，磁力攪拌器轉速對微球表面形態(tài)有較大影響，其原因可能是在轉速300 r·min-1以內(nèi)時，PLGA的包裹性沒有被破壞，使微球在粒徑較小的情況下還能具有良好的機械強度，提高了微球的載藥及包封能力，以及持續(xù)且穩(wěn)定的釋藥過程。用 Nano Measure軟件分析微球粒徑分布，如表4所示。隨機挑選500個制備的微球，在電鏡下測量其粒徑，其中粒徑在15.6 μm以內(nèi)的占總個數(shù)的90%，說明通過此方法可制備粒徑較小的載藥微球。

圖2 工藝參數(shù)對載藥微球的影響

表4 載藥微球粒徑分析

2.2 正交試驗結果分析

通過對PVA濃度，轉速，溫度進行正交實驗優(yōu)化選擇制備微球最佳工藝參數(shù)，以微球載藥率和包封率為評價指標判斷微球質(zhì)量[10]。微球載藥率越高，包封效果越好，說明制備微球的加工工藝過程越好。

在制備微球的加工工藝參數(shù)中，攪拌轉速、配置水相PVA溶液的濃度、溫度都會影響載藥微球的載藥率和包封率。磁力攪拌器轉速的P<0.05，說明磁力攪拌器轉速對結果影響顯著，PVA濃度、溫度影響不顯著。因此磁力攪拌器轉速為主要因素，PVA濃度、溫度為次要因素。當PVA濃度和溫度不變時，改變磁力攪拌器轉速，載藥率隨著轉速的提升而減小，成反比關系(表6)。PVA溶液的濃度和溫度在一定范圍內(nèi)與微球的載藥率成正比，但隨溫度的升高，載藥率只會輕微升高。這可能是因為磁力攪拌器雖然可以提供穩(wěn)定持續(xù)的剪切力，但轉速改變粒徑大小的同時，也會影響微球表面的形態(tài)，高轉速會提供大的剪切力，雖然會使得制備的微球粒徑變下，但由于破壞了PLGA與藥物之間形成的化合建，使得做制備的微球表面粗糙，孔隙多且大，從而破壞了包載藥物的能力，載藥率和包封率隨之下降。PVA作為乳化劑穩(wěn)定劑也作為水相，PVA濃度不足，將導致微球粒徑增大，PLGA難以形成較小的乳滴，也會影響微球成型的穩(wěn)定性與完整性。根據(jù)文獻和單因素實驗結果，采用正交試驗綜合評分法，將載藥率和包封率進行加權求和作為評價標準，根據(jù)極差R值的大小確定影響因素的主次順序，極差值越大則對實驗指標影響越大，從表5可以看出，影響MTX載藥微球工藝參數(shù)的主次順序為攪拌轉速>PVA濃度>溫度，最優(yōu)的組合工藝為磁力攪拌器轉速在300 r·min-1，PVA濃度2 mg·mL-1，溫度30 ℃時，可制備載藥率和包封率良好的微球。按照此方案重復制備3批微球，微球形態(tài)規(guī)整，微球的載藥率為3.3%±0.16%，包封率59.64%±0.51%。

表5 甲氨蝶呤/PLGA微球制備方案正交試驗結果

表6 方差分析結果

2.3 MTX-PLGA微球體外釋放

微球的體外釋放百分比如圖3所示。釋藥第一階段，實驗一組8 h內(nèi)釋放的藥物達到39.78%，突釋現(xiàn)象明顯，這可能是高轉速下，具有較大的剪切力，破壞了微球載體與藥物結合能力，致使微球前期釋藥過快,在前8 h內(nèi)大量釋放藥物，局部藥物濃度過高，不僅會破壞正常細胞的形態(tài)，嚴重還會引起炎癥反應和免疫排斥反應。對照組中的MTX在前8 h累計釋放藥物達到30%，突釋明顯，而實驗三組所制備的微球在前期釋放緩慢，8 h內(nèi)釋放藥物含量為11.17%，說明在此方法下微球包裹性好，微球表面所含藥物含量少，藥物與微球結合能力強，根據(jù)前8 h釋放情況，沒有明顯突釋現(xiàn)象。在該方法下，PVA濃度事宜，乳滴形成過程穩(wěn)定，具有良好的包裹性。第二階段體外釋藥期為12 h后，微球的藥物釋放速率明顯減緩，但由于第一階段造成的微球壁上的藥物完全釋放，在微球體內(nèi)的藥物由于PLGA中高分子量的阻礙，使得藥物擴散減緩。假設微球不會發(fā)生溶蝕，且結構完好，微球中的藥物釋放將變得極其緩慢甚至不再發(fā)生藥物釋放，由于制備微球的材料是可降解的，體外的液體會滲透到微球內(nèi)部，致使PLGA中的分子鏈發(fā)生水解和斷裂。而MTX是疏水性藥物，體外滲透的水分子也將阻礙MTX的釋放[11]。所制備的微球在該階段均釋放緩慢。在最優(yōu)參數(shù)條件下制備的微球出現(xiàn)裂縫少，藥物與載體結合能力強，因此還能保持緩慢平穩(wěn)的釋放藥物。釋藥最后階段，伴隨微球內(nèi)部藥物的溶解釋放，微球產(chǎn)生溶蝕，在此期間藥物擴散和微球溶蝕決定藥物的釋放速率[12]。由于前期釋放孔隙的增大，藥物擴散也更加迅速，但受限于藥物濃度的影響，釋放速率減緩。至120 h時，高轉速下的第一組實驗藥物累計釋放量達97.75%，MTX累計釋藥達76%，而低轉速下的載藥微球釋放量僅為34.17%。綜上，在轉速為300 r·min-1條件下制備的微球，具有比MTX前期更平緩的釋藥速率，和更穩(wěn)定持久的的釋藥性能。

圖3 MTX-PLGA微球體外釋放曲線

2.4 釋藥動力學模型擬合

對最優(yōu)工藝參數(shù)所制備的載藥微球進行體外藥物緩釋實驗，通過表3中的數(shù)學模型進行擬合。在釋藥動力學方程擬合中，R2是決定因素，R2越趨近于1，則方程的擬合效果越好，說明越符合此釋藥機理[13]。為了更直觀地考察載藥微球的釋藥機理，將不做處理的MTX進行體外釋藥并設為對照組。通過表7可知，MTX體外釋藥曲線分別用零級、一級、Higuchi和Peppas數(shù)學模型進行擬合后，MTX的釋放更符合Peppas方程，說明未經(jīng)改性的MTX在體外釋放過程主要通過藥物本體均勻溶蝕釋放。由表8可知，包載甲氨蝶呤的PLGA載藥微球的釋放過程采用Higuchi和Peppas擬合后得到的R2接近于1，說明擴散和溶蝕是主要釋藥方式。釋藥初期，微球以表面藥物自由擴散為主。后期隨藥物不斷釋放，微球表面產(chǎn)生溶蝕凹陷，使得藥物釋放阻力減少，加快了微球的溶解。通過擬合方程可知，該制備工藝條件下的微球滿足生物可降解微球的釋藥過程，微球在釋藥初期是微球表面藥物向體外擴散，隨著擴散難度的增大，微球開始發(fā)生溶蝕現(xiàn)象，使微球體內(nèi)的藥物可以穩(wěn)定持續(xù)的釋放，此釋藥機理與擬合結果一致。同時，結合體外釋藥曲線分析，工藝參數(shù)優(yōu)化后的微球不僅更接近理想的釋藥效果，還有效地降低了MTX前期藥物突釋的風險，在相對較低的釋藥速率下，展現(xiàn)了較好的釋藥穩(wěn)定性。

表7 MTX釋藥動力學方程

表8 載藥微球釋藥動力學方程

3 討論

在制備微球的初期，將配置好的PLGA，MTX與二氯甲烷結合后作為油相滴加至PVA水相穩(wěn)定劑時，PLGA和二氯甲烷會在PVA溶液上形成大乳滴并迅速下沉，隨后即被攪拌子破碎成小液滴，時間短促，但此過程直接關系到微球的粒徑及其分布，需控制好滴加入PVA溶液的速度及時間。實驗結果表明，滴加PLGA/二氯甲烷/甲氨蝶呤油相至PVA溶液中，此階段是大乳滴將由于連續(xù)攪拌PVA溶液變成小乳滴。在最佳制備工藝下，延緩了溶蝕現(xiàn)象發(fā)生的時間，保證了在120 h內(nèi)，MTX可以平緩穩(wěn)定的釋放，這是由于低轉速下，可以形成合適的剪切力，PLGA作為油相，擁有較大的粘性，形成大的乳滴，而大的乳滴難以破碎成小乳滴。此時，增加該實驗方法中PVA的濃度，微球形成過程中，粒徑變小的速率明顯變快，可能是PVA在該實驗方案中充當乳化劑穩(wěn)定劑作用，PVA濃度越大，乳滴固化越快，微球表面越穩(wěn)定。

通過正交實驗，最終確定微球的最佳制備工藝為磁力攪拌器轉速300 r·min-1，PVA濃度2%，溫度為30 ℃，經(jīng)過優(yōu)化后的微球具有較高的載藥率和包封率，對比MTX體外釋藥，此方法制備的微球無明顯突釋現(xiàn)象，釋藥持續(xù)且穩(wěn)定。通過釋藥擬合方程可知，優(yōu)化后的微球釋藥符合Higuchi和Peppas方程，說明微球中藥物釋放是由擴散和溶蝕機理共同作用。因此本研究結果表明，利用磁力攪拌器可制備出能滿足理想生物降解條件的載藥微球，為解決骨肉瘤問題提供了一種新的治療方式。