油菜素內(nèi)酯應(yīng)用于甘蔗組織培養(yǎng)快繁的研究

張婭 顧明華 朱可針 梁瓊月 龔銀花 何冰 何麗珊

摘 ?要：為了研究油菜素內(nèi)酯（brassinolide， BL）對(duì)甘蔗組織培養(yǎng)的影響，本研究以“植物器官?gòu)念^再生”“體細(xì)胞胚再生”2種組培快繁體系為基礎(chǔ)，通過添加適宜濃度的2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-epibrassinolide， 2，4-EBL）于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，設(shè)計(jì)了6套適用于甘蔗快繁的組合培養(yǎng)基方案。并于不同誘導(dǎo)階段（不定根誘導(dǎo)、愈傷組織誘導(dǎo)、成苗誘導(dǎo)）對(duì)接種材料的形態(tài)特征及內(nèi)源植物激素（油菜素內(nèi)酯、玉米素核苷、生長(zhǎng)素、脫落酸）的含量變化進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)與測(cè)定，探討了油菜素內(nèi)酯應(yīng)用于甘蔗組織培養(yǎng)快繁技術(shù)的可行性。結(jié)果表明，將不定根培養(yǎng)基MS + 0.2 mg/L 2，4-D + 0.2 mg/L LFS與成苗培養(yǎng)基MS + 0.5 mg/L KT +（0.2 mg/L IBA / 0.2 mg/L 2，4-EBL）+ 300 mg/L Pro進(jìn)行組合，為甘蔗組培快繁的較優(yōu)方案，油菜素內(nèi)酯可應(yīng)用于甘蔗組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，且體細(xì)胞胚再生成苗優(yōu)于愈傷組織再生成苗，成苗時(shí)間可縮短至32 d。

關(guān)鍵詞：甘蔗;組織培養(yǎng);油菜素內(nèi)酯;植物激素

中圖分類號(hào)：S566.1 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Based on two tissue culture and rapid propagation systems of “plant organ de novo regeneration” and “so-matic embryo regeneration”， six combinations of medium were designed by adding appropriate concentration of 2，4-epibrassinolide into the basic medium to explore the effects of brassinolide （BL） on sugarcane tissue culture. The morphological characteristics of different induction stages， including adventitious root induction， callus induction and seedling induction， were analyzed. The content changes of endogenous plant hormones （brassinolide， zeatin riboside， indole 3 acetic acid， abscisic acid） were determined. The feasibility of brassinolide application in sugarcane tissue cul-ture and rapid propagation was discussed. The combination of adventitious root medium MS+0.2 mg/L 2.4-D+0.2 mg/L LFS and seedling medium MS + 0.5 mg/L KT+（0.2 mg/L IBA / 0.2 mg/L 2，4-EBL）+ 300 mg/L Pro was the better scheme for sugarcane tissue culture and rapid propagation. Brassinolide could be used in tissue culture and rapid propagation of sugarcane. The regeneration time of somatic embryo was better than that of callus， which could be shortened to 32 days.

Keywords： sugarcane; tissue culture; brassinolide; phytohormone

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.014

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是我國(guó)重要的糖料作物，產(chǎn)糖量占我國(guó)食糖總產(chǎn)量的90%以上[1]，同時(shí)，甘蔗作為C4高光效及同源多倍體遺傳研究的模式植物，具有重大的科研價(jià)值[2]。受限于遺傳背景復(fù)雜且全基因組測(cè)序未完成的阻礙，甘蔗的育種進(jìn)程緩慢[3]?，F(xiàn)今的甘蔗傳種方式以農(nóng)民自留種為主，且多為第三年蔗，因其易攜帶宿根矮化病、黑穗病、花葉病及黃葉病等病害，導(dǎo)致種苗的質(zhì)量差，常對(duì)后續(xù)甘蔗的生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響[4]?；诟收嵊啄劢M織的全能性，利用莖尖生產(chǎn)脫毒苗不失為最有效的繁種方式[5-6]。大田研究數(shù)據(jù)表明，應(yīng)用甘蔗脫毒健康種苗可使甘蔗增產(chǎn)15.1%～52.0%，蔗糖糖分提高0.12%～ 1.71%[4]。

油菜素甾醇（brassinosteroids， BRs）是一類在植物中廣泛存在、含多羥基的甾醇類化合物的統(tǒng)稱，油菜素內(nèi)酯（brassinolide， BL）是植物體內(nèi)BRs中生物活性最強(qiáng)的一種[7]。近些年，伴隨有關(guān)BRs合成途徑、信號(hào)通路及其與其他激素互作調(diào)控機(jī)制的研究取得顯著進(jìn)展[8-10]，使得BL及其類似物在組培快繁領(lǐng)域的應(yīng)用成果也快速積累。于中草藥（甘肅貝母）[11]、林木（桉樹、胡楊）[12-13]、蔬菜（馬鈴薯）[14]及水果（香蕉、五指毛桃）[15-16]等材料的再生培養(yǎng)試驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)，BL及其類似物對(duì)不定根誘導(dǎo)和再生培養(yǎng)體系構(gòu)建的促進(jìn)效果明顯，且當(dāng)BL的應(yīng)用劑量小于1 mg/L時(shí)效果更佳。有關(guān)BL在甘蔗組培中的應(yīng)用研究，Chavan等[17]將2～7 mg/L濃度梯度的BL添加于培養(yǎng)基中，以探究其對(duì)甘蔗Co.86032莖尖繁殖效率的影響。該研究發(fā)現(xiàn)：在添加5 mg/L BL培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的材料獲得比對(duì)照更強(qiáng)的生命力及更高的成活率。但遺憾的是該研究并未對(duì)BL與其他激素的互作關(guān)系進(jìn)行探討。

目前將BL及其類似物應(yīng)用于甘蔗組培快繁的研究較少，基于BL具有低量高效的促生長(zhǎng)特性，本研究以植物器官?gòu)念^再生、體細(xì)胞胚再生2種組培快繁體系[18]為基礎(chǔ)，通過添加適宜濃度的BL于MS培養(yǎng)基中，共設(shè)計(jì)6套適用于甘蔗快繁的培養(yǎng)基組合方案，旨在為BL應(yīng)用于甘蔗組培快繁技術(shù)提供一定理論研究基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

實(shí)驗(yàn)材料：‘德蔗03-83’，采自廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)田。試驗(yàn)相關(guān)激素：靈發(fā)素（lingfasu， LFS， PGR-08， 99%）、2，4-表油菜素內(nèi)酯（2，4-epibras?si?n?o-lide， 2，4-EBL， 99%）、萘乙酸（naphthaleneacetic acid， NAA， 99%）、激動(dòng)素（kinetin， KT， 99%）、吲哚丁酸（indole butyric acid， IBA， 99%）、脯氨酸（proline， Pro， 99%），上述試劑均購(gòu)于南寧市科杰生物試劑經(jīng)營(yíng)部。激素含量測(cè)定試劑盒：油菜素內(nèi)酯（brassinolide， BL）、玉米素核苷（zeatin riboside， ZR）、生長(zhǎng)素（indole 3 acetic acid， IAA）、脫落酸（abscisic acid， ABA）酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京北農(nóng)天一生物技術(shù)有限公司。

1.2 ?方法

1.2.1 ?外植體的獲取及不定根的誘導(dǎo) ?于連續(xù)晴朗的艷陽天上午9：00?10：00，砍下健壯成熟的甘蔗莖尖。剝離大部分外層組織后，在超凈工作臺(tái)中繼續(xù)剝離剩余外層組織直至獲得最幼嫩莖尖。將莖尖置于無菌鋁盤上，并用無菌刀截去頭尾后切成1～2 cm的小段，隨后接入不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（表1），每瓶接種4個(gè)外植體，以每10瓶為1個(gè)重復(fù)，設(shè)3個(gè)重復(fù)共計(jì)接種30瓶。材料置于恒溫培養(yǎng)室（26±2）℃內(nèi)避光培養(yǎng)11 d后，將光照時(shí)間重新設(shè)定為12 h光/12 h暗，光照強(qiáng)度設(shè)為1000 lx。觀察統(tǒng)計(jì)外植體存活率及不定根發(fā)生率[19]。

1.2.2 ?愈傷組織的誘導(dǎo) ?待不定根誘導(dǎo)完成后，將不定根從外植體上切下，分別轉(zhuǎn)接至方案O1/O2及方案O3/O4對(duì)應(yīng)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（表1），每瓶接種3條不定根，以每5瓶為1個(gè)重復(fù)，每處理共接種15瓶。置于（26±2）℃恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光照時(shí)間設(shè)定為12 h光/12 h暗，光照強(qiáng)度為1000 lx，每2周繼代1次，定期統(tǒng)計(jì)愈傷組織發(fā)生率[19]。

1.2.3 ?成苗誘導(dǎo) ?比較“植物器官?gòu)念^再生”“體細(xì)胞胚再生”2種組培快繁體系的成苗效率，即分別將經(jīng)方案O1、O2、O3、O4誘導(dǎo)生成的愈傷組織（1～2 cm的小團(tuán)塊）轉(zhuǎn)接至各方案對(duì)應(yīng)的成苗培養(yǎng)基，或直接將方案S1、S2誘導(dǎo)的不定根分別轉(zhuǎn)接到各方案對(duì)應(yīng)的成苗培養(yǎng)基中（表1）。每瓶接種4團(tuán)愈傷組織或4條不定根，以每3瓶為1個(gè)重復(fù)，每處理共接種9瓶。所有材料均置于（26±2）℃恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光照時(shí)間為12 h光/12 h暗，光照強(qiáng)度為1000 lx，統(tǒng)計(jì)各方案的成苗率[19]。

1.2.4 ?甘蔗無菌苗的激素測(cè)定 ?分別采集6套培養(yǎng)方案所培育的生根苗鮮樣0.5 g，每個(gè)處理重復(fù)3次，共計(jì)12個(gè)樣品（方案O1、O2處理均無成苗），迅速浸過液氮后置于?80 ℃冰箱中保存，參照間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析法（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay， ic-ELISA）[20]測(cè)定樣品中植物內(nèi)源激素BL、ZR、IAA與ABA的含量。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用2019版Excel軟件整理數(shù)據(jù)，SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（anova），Origin 2019軟件作圖。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不定根誘導(dǎo)情況（初代培養(yǎng)）

接種甘蔗莖尖于不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+ 0.2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L LFS上，7 d左右外植體膨大，由白色轉(zhuǎn)為微淺褐色（圖1A），11 d后結(jié)束暗室培養(yǎng)，膨大組織上長(zhǎng)出嫩白短須的根狀物，即為不定根（圖1B），待不定根長(zhǎng)約3～5 cm時(shí)可轉(zhuǎn)入下一階段進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。除個(gè)別外植體發(fā)生污染及褐化壞死外，在結(jié)束初代培養(yǎng)時(shí)，外植體存活率為99%，不定根發(fā)生率為77%（圖2A）。

2.2 ?愈傷組織誘導(dǎo)情況

將初代培養(yǎng)階段誘導(dǎo)的不定根切下，分別接種到方案O1/O2（MS+0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA），方案O3/O4（MS+0.2 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L 2，4-EBL）的2種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)的第19 天，2種培養(yǎng)基中均觀察到不定根誘導(dǎo)出了愈傷組織（圖1C）。接種20 d后，添加激素2，4-EBL的培養(yǎng)基其愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生率達(dá)到最大，發(fā)生率為17%;接種37 d后，添加激素NAA的培養(yǎng)基其愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)生率達(dá)到最大，發(fā)生率為39%（圖2B）。

2.3 ?成苗誘導(dǎo)情況

將方案O1、O2、O3、O4中由不定根誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織，及方案S1、S2初代培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定根分別接種于各方案所對(duì)應(yīng)的成苗培養(yǎng)基中。培養(yǎng)21 d后，觀察6種培養(yǎng)基組合方案的成苗誘導(dǎo)情況。

方案O1、O2誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織接種于成苗培養(yǎng)基后不能誘導(dǎo)成苗，方案O3、O4誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織均能誘導(dǎo)成苗，其生長(zhǎng)表現(xiàn)為：苗株單叢、莖部纖弱嫩白、無葉展開（圖1D）。方案O3成苗培養(yǎng)基（含0.2 mg/L IBA）的誘導(dǎo)出苗率為58.3%，方案O4成苗培養(yǎng)基（含0.2 mg/L 2，4-EBL）的誘導(dǎo)出苗率為24.7%，方案O3較O4的誘導(dǎo)成苗率增加了33.6%（表2）。

方案S1、S2初代培養(yǎng)階段誘導(dǎo)的不定根分別接種于成苗培養(yǎng)基后皆能誘導(dǎo)成苗（圖1E，圖1F），方案S1成苗培養(yǎng)基（含0.2 mg/L IBA）誘導(dǎo)的苗株其莖部粗壯濃綠、葉展開，苗株單叢;方案S2成苗培養(yǎng)基（含0.2 mg/L 2，4-EBL）誘導(dǎo)的苗株其莖部纖細(xì)淡綠、葉呈蜷曲狀;培養(yǎng)的第7天，方案S1、S2相應(yīng)的出苗率分別為97.3%、87%，S1誘導(dǎo)出苗率較S2增加10.3%。培養(yǎng)的第14天，方案S1、S2的出苗率均可達(dá)100%（表2）。

可見，方案S1、S2（甘蔗體細(xì)胞胚再生成苗體系）的成苗率優(yōu)于方案O3、O4（器官?gòu)念^再生成苗體系）（表2）。同為添加0.2 mg/L IBA的成苗培養(yǎng)基處理，方案S1的誘導(dǎo)成苗率較方案O3提高41.7%，同為添加0.2 mg/L 2，4-EBL成苗培養(yǎng)基處理，方案S2較方案O4的誘導(dǎo)成苗率提高75.2%。

2.4 ?誘導(dǎo)苗株的內(nèi)源BL、ZR、IAA與ABA含量分析

分別測(cè)定方案O3、O4（經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)）、方案S1、S2（不定根直接誘導(dǎo)）苗株內(nèi)源激素BL、ZR、IAA及ABA的含量變化。在外源IBA或2，4-EBL的處理下，激素BL的含量在2種再生成苗體系中的表現(xiàn)基本相同（圖3A）。而經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)成苗時(shí)，與0.2 mg/L IBA處理相比，添加0.2 mg/L 2，4-EBL可將內(nèi)源ZR、IAA與ABA的含量水平分別降低65.2%、42.8%、83.1%。通過不定根直接誘導(dǎo)成苗時(shí)，與0.2 mg/L IBA處理相比，添加0.2 mg/L 2，4-EBL可將內(nèi)源ZR的含量水平顯著降低63.2%;但I(xiàn)AA、ABA含量水平顯著上升，分別提高97.2%、88.2%（圖3B、圖3C、圖3D）。

3 ?討論

通過將6套組合培養(yǎng)基方案對(duì)甘蔗莖尖的快繁效果進(jìn)行比較，體細(xì)胞胚再生成苗快繁體系（方案S1、S2）優(yōu)于器官再生成苗快繁體系（方案O3、O4），而方案S的IBA處理又優(yōu)于2，4-EBL處理，即快繁方案的比較結(jié)果應(yīng)為：S1> S2> O3 > O4。

植物的離體器官再生，是IAA以類似于側(cè)根發(fā)生的方式，即通過誘導(dǎo)中柱鞘類細(xì)胞分化產(chǎn)生愈傷組織[21-23]。側(cè)根發(fā)生時(shí)，高濃度的BL可激活I(lǐng)AA阻遏基因表達(dá)從而負(fù)調(diào)控IAA信號(hào)，抑制側(cè)根發(fā)生;低濃度的BL則調(diào)控IAA的運(yùn)輸與再分配，促進(jìn)側(cè)根形成[24]。由此猜測(cè)，2，4-EBL對(duì)不定根所起的作用，可能是以類似方式對(duì)IAA實(shí)現(xiàn)負(fù)調(diào)控，進(jìn)而影響愈傷組織的發(fā)生及分化。在本研究的愈傷組織誘導(dǎo)階段，考慮到材料對(duì)所添加的0.5 mg/L 2，4-EBL并未完全代謝，導(dǎo)致轉(zhuǎn)接至方案O4所對(duì)應(yīng)的成苗培養(yǎng)基（添加0.2 mg/L 2，4-EBL）后，造成材料中2，4-EBL的作用效應(yīng)高度累積，抑制了IAA的分泌，致使愈傷組織不能正常分化，方案O4的成苗效率弱于方案O3（添加0.2 mg/L IBA）。

體細(xì)胞胚的再生過程受到IAA、ZR及ABA等3種植物激素的協(xié)同調(diào)控。其中，IAA以其在愈傷組織中的濃度梯度為信號(hào)，誘導(dǎo)并維持莖端分生組織干細(xì)胞的產(chǎn)生[18];ZR作為細(xì)胞分裂素的主要活性成分，其響應(yīng)因子能直接激活干細(xì)胞維持基因的表達(dá)，從而調(diào)控莖尖干細(xì)胞的活性[25]。IAA與ZR對(duì)分生組織的產(chǎn)生及活性起著直接作用。而ABA則通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)于IAA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生的調(diào)控[26]。本研究中，方案S2通過低量0.2 mg/L 2，4-EBL的添加，IAA的含量水平大幅升高，雖生根苗的ZR含量稍有下降，ABA水平上升，但并未影響分生組織干細(xì)胞的正常產(chǎn)生，苗株得以生長(zhǎng);方案S1通過添加0.2 mg/L IBA，生根苗內(nèi)源IAA、ABA含量水平下降，雖分生組織干細(xì)胞發(fā)生受阻，但ZR含量升高，仍能激活干細(xì)胞維持基因的表達(dá)，細(xì)胞得以分裂，苗株實(shí)現(xiàn)正常生長(zhǎng)。

4 ?結(jié)論

通過篩選比較6套甘蔗快繁成苗方案，證明油菜素內(nèi)酯可應(yīng)用于甘蔗組織培養(yǎng)快繁過程，且選擇體細(xì)胞胚再生成苗培養(yǎng)體系優(yōu)于愈傷組織再生成苗培養(yǎng)體系，即通過甘蔗莖尖誘導(dǎo)不定根，再由不定根直接誘導(dǎo)成苗，經(jīng)32 d連續(xù)培養(yǎng)可得到甘蔗無菌苗植株。同時(shí)，較優(yōu)的培養(yǎng)基組合方案為，不定根培養(yǎng)基：MS+0.2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L 08，成苗培養(yǎng)基：MS+0.5 mg/L KT+0.2 mg/L IBA（0.2 mg/L 2，4-EBL）+300 mg/L Pro。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)