響應面法優(yōu)化超聲輔助提取黃瓜多酚工藝及其對酪氨酸酶的抑制作用

陳建福 林洵 陳仲巍

摘? ? 要：為確定超聲輔助提取黃瓜多酚的最佳工藝條件，并評價黃瓜多酚對酪氨酸酶的抑制作用，以黃瓜為原料，以多酚提取率為響應值，對影響響應值的超聲時間、液料比、乙醇含量和超聲溫度4個因素進行單因素和響應面優(yōu)化試驗，并考察了黃瓜多酚對酪氨酸酶的抑制作用。結果表明，所考察的各工藝條件對黃瓜多酚提取率影響的順序為：超聲溫度>乙醇含量>液料比>超聲時間。提取工藝的最佳條件：超聲時間為30 min，液料比為27 mL·g-1、乙醇含量（φ，下同）為64%、超聲溫度為68 ℃，在此條件下，黃瓜多酚提取率為11.33 mg·g-1。黃瓜多酚對酪氨酸酶具有一定的抑制作用，且多酚濃度與酪氨酸酶抑制率存在量效關系，表明黃瓜多酚可作為天然的酪氨酸酶抑制劑，是一種潛在的天然美白添加劑，為黃瓜多酚的提取與開發(fā)提供新的方向。

關鍵詞：黃瓜;多酚;超聲輔助提取;酪氨酸酶;抑制

中圖分類號：S642.2 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）12-016-07

Abstract： The aim was to determine the best process conditions of ultrasound-assisted extraction of cucumber polyphenols， and to evaluate the inhibitory activities of cucumber polyphenols on tyrosinase. The single factor experiment and response surface methodology were performed on the four factors involving ultrasonic time， liquid-to-material ratio， ethanol concentration and ultrasonic temperature using cucumber as raw material and the extraction yield of polyphenols as the response value. Inhibition effect of cucumber polyphenols on tyrosinase was also examined. The results showed that the significant order of the effects of the investigated technological conditions on the extraction yield of cucumber polyphenols was as follow： ultrasonic temperature， ethanol concentration， liquid-material ratio and ultrasonic time. The optimal conditions for the extraction process were： ultrasonic time 30 min， liquid-material ratio 27 mL·g-1， ethanol concentration 64% and ultrasonic temperature of 68 ℃. Under these conditions， the cucumber polyphenol extraction yield was11.33 mg·g-1. Cucumber polyphenols had a good inhibitory effect on tyrosinase and there was a dose-effect relationship between the concentration of polyphenols and the tyrosinase inhibition rate. It indicated that cucumber polyphenol could be a natural tyrosinase inhibitor and a potential natural whitening additive， which provided a new direction for the extraction and development of cucumber polyphones.

Key words： Cucumber; Polyphenol; Ultrasonic-assisted Extraction; Tyrosinase; Inhibitory

黃瓜（Cucumis sativus L.），又名青瓜、刺瓜、胡瓜等，為葫蘆科黃瓜屬一年蔓生或攀緣草本植物，是世界十大蔬菜作物之一[1-2]。黃瓜果肉脆爽，水分充足，生食解膩清爽，在我國果蔬市場上占有不可替代的地位。黃瓜中含有的蛋白質、葫蘆素C、胡蘿卜素、多酚、多糖等天然有效成分，具有清熱排毒、提高人體免疫力、加速人體新陳代謝等作用[3-4]。其中，多酚是一種存在于植物體內(nèi)結構復雜、化學性質活潑的多羥基類化合物，在化妝品領域具有美白、防曬、抗衰老、收斂、保濕等作用[5-6]。

酪氨酸酶是一種含有雙銅離子的金屬氧化酶，是與人體合成黑色素密切相關的限速酶，因此，可以通過抑制酪氨酸酶的活性來達到美白的作用[7]。隨著人們生活水平的提高，具有天然美白活性成分的化妝品越來越受到國內(nèi)外消費者的青睞，開發(fā)天然新型的酪氨酸酶抑制劑成為研究熱點[8]。超聲波輔助提取法是一項新型的天然產(chǎn)物輔助溶劑提取技術，能大大提高有效成分的提取率，同時具有耗時短、操作簡便、有效成分損失少等優(yōu)點，具有良好的應用前景。筆者以黃瓜為材料，考察了超聲時間、液料比、乙醇含量和超聲溫度等工藝因素對黃瓜多酚提取率的影響，并用Box-Behnken對工藝過程進行設計，優(yōu)化得到最佳的工藝條件，并考察了黃瓜多酚對酪氨酸酶的抑制作用，以期為黃瓜多酚的開發(fā)與利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗于2019年10—12月于福建省漳州市漳州職業(yè)技術學院成業(yè)樓食品工程實驗室進行。黃瓜為上海種都種業(yè)科技有限公司選育的密刺型黃瓜亮美1號;乙醇為食品級，由河南鑫河陽酒精有限公司提供;蘑菇酪氨酸酶，由Worthington公司提供（700 U·mg-1）;沒食子酸由天津市瑞金特化學品有限公司提供（分析純）;曲酸，由德國Ruibio公司提供;L-酪氨酸由國藥集團化學試劑有限公司提供;其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 多酚含量的測定 采用福林-酚法[9]，以沒食子酸作為標準物質，測定多酚的含量，配制100 mg·L-1沒食子酸標準溶液，在10 mL的比色管中分別加入一定體積的沒食子酸標準溶液，然后各加入0.5 mL福林-酚試劑和1.5 mL質量分數(shù)為20%的碳酸鈉溶液，搖勻后定容，后于75 ℃水浴環(huán)境中反應10 min，取出冷卻，測定出765 nm處溶液的吸光度。以吸光值為縱坐標，沒食子酸質量濃度（mg·mL-1）為橫坐標，作圖并線性回歸得：Y=85.196X+0.01（R2=0.999 1）。

1.2.2 黃瓜多酚的提取工藝 把黃瓜用清水浸泡10 min清洗，再用蒸餾水進行清洗，濾干后去皮去籽，在50 ℃烘箱中烘烤干，磨成粉后備用。將質量為m（g）的黃瓜粉末裝入燒瓶中，按照所考察的工藝條件加入乙醇溶液，然后置于超聲波中進行提取，結束后過濾、定容。

1.2.3 黃瓜多酚提取率的測定 在定容體積為V（mL）的提取液中，用移液槍準確移取一定量的黃瓜提取液，按1.2.1中多酚含量的測試方法，測定出765 nm處黃瓜多酚溶液的吸光值，代入沒食子酸標準曲線，計算出多酚的質量濃度ρ（mg·mL-1），用下式計算得出單次黃瓜多酚提取率，每個試驗3次重復，計算均值，即得黃瓜多酚提取率。

黃瓜多酚提取率/（mg·g-1）=[b×Vm]。

1.3 試驗設計

1.3.1 單因素試驗設計 超聲時間的影響：稱量1.000 0 g的黃瓜粉末5份，加入到裝有冷凝回流裝置的100 mL圓底燒瓶中，后加入60%的乙醇25 mL，設置超聲時間為10、20、30、40和50 min，再放入70 ℃的超聲波反應器中，結束后過濾、定容，分別測定黃瓜多酚提取率。

液料比的影響：稱量1.000 0 g的黃瓜粉末5份，加入到裝有冷凝回流裝置的100 mL圓底燒瓶中，后依次加入15、20、25、30和35 mL濃度為60%的乙醇，然后放到70 ℃的超聲波反應器中超聲提取30 min后，過濾、定容，分別測定黃瓜多酚提取率。

乙醇含量的影響：稱量1.000 0 g的黃瓜粉末5份，加入到裝有冷凝回流裝置的100 mL圓底燒瓶中，后依次加入25 mL濃度（φ，下同）為40%、50%、60%、70%和80%的乙醇，設置超聲提取時間30 min，70 ℃超聲后，過濾、定容，分別測定黃瓜多酚提取率。

超聲溫度的影響：稱量1.000 0 g的黃瓜粉末5份，加入到裝有冷凝回流裝置的100 mL圓底燒瓶中，需要放到60、65、70、75和80 ℃的超聲波反應器中超聲提取，依次加入25 mL濃度為60%的乙醇，提取30 min后，過濾、定容，分別測定黃瓜多酚提取率。

1.3.2 響應面試驗設計 根據(jù)所考察的單因素對多酚提取率的影響，在篩選出的最佳工藝條件基礎上，為了獲得最合適的提取工藝。選擇4個單因素為自變量，以黃瓜多酚提取率為指標，利用Box-Behnken設計進行優(yōu)化，因素和水平見表1。

1.3.3 黃瓜多酚對酪氨酸酶的抑制作用 用pH=6.85的磷酸鹽緩沖液將黃瓜多酚和曲酸（對照）配置成不同濃度的溶液，備用。另用pH=6.85的磷酸鹽緩沖液配制1.5 mmoL·L-1的L-酪氨酸溶液和100 U·mL-1的酪氨酸酶溶液，備用。分別按表2方案，配制以下4種溶液。

試驗時，于10 mL的比色管中分別加入a、b、c、d 4組溶液，然后分別加入0.5 mL的L-酪氨酸溶液，于37 ℃保溫反應14 min，并分別在15 min時測定溶液在475 nm處的吸光度Aa、Ab、Ac、Ad，則通過下式可計算得單次酪氨酸酶的抑制率，每個試驗3次重復，計算均值，即酪氨酸酶的抑制率：

酪氨酸酶抑制率/%=[1-（Ac-Ad）/（Aa-Ab）]×100。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 超聲時間對黃瓜多酚提取率的影響 從圖1可以看出，多酚提取率呈現(xiàn)出隨超聲時間延長先上升后下降趨勢，在超聲水浴中提取30 min時達到最大值，且30、40、50 min多酚的提取率均顯著高于10、20 min，而30、40、50 min之間多酚的提取率無顯著差異。這是因為超聲時間太短，黃瓜顆粒中的多酚還沒有完全溶解到溶劑中;當超聲時間超過30 min時，黃瓜顆粒中的多酚已基本溶出，但超聲時間過長，部分多酚類物質中不穩(wěn)定成分會發(fā)生降解，從而使得多酚提取率下降，因此最佳超聲時間為30 min。

2.1.2 液料比對黃瓜多酚提取率的影響 由圖2可以看出，多酚提取率呈現(xiàn)出隨液料比升高先上升后下降趨勢，在液料比為25 mL·g-1時達到最大值，且液料比為25、30 mL·g-1的多酚提取率均顯著高于其他液料比，而25 mL·g-1和30 mL·g-1液料比之間多酚提取率無顯著差異。這是因為料液比增大，溶劑量變得更大，促進了多酚的溶出，使得提取率增大，但液料比超過25 mL·g-1后，過多的溶劑，會導致過濾、濃縮等過程中多酚損失增大，從而使得多酚提取率下降。因此最佳液料比為25 mL·g-1。

2.1.3 乙醇含量對黃瓜多酚提取率的影響 由圖3可以看出，多酚提取率呈現(xiàn)出隨乙醇含量升高先上升后下降趨勢，在乙醇含量為60%時達到最大值，且乙醇含量為60%、70%多酚提取率均顯著高于其他乙醇含量，而60%和70%乙醇含量之間多酚提取率無顯著差異。這是因為多酚在植物細胞中與蛋白質、多糖等以氫鍵等疏水鍵形式結合，要使多酚充分浸出，需破壞疏水鍵，當乙醇含量較低時，溶劑極性較高，較難破壞分子間的氫鍵，而乙醇含量過大時，黃瓜顆粒中醇溶性雜質會過多地溶出，并與多酚類物質競爭溶劑，多酚提取率較低。因此，最佳乙醇含量為60%。

2.1.4 超聲溫度對黃瓜多酚提取率的影響 由圖4可以看出，多酚提取率呈現(xiàn)出隨超聲溫度升高先上升后下降趨勢，在超聲溫度為70 ℃時達到最大值，70 ℃多酚提取率顯著高于其他處理。這是因為隨著超聲溫度的升高，分子間的運動更加劇烈，使溶劑更容易進入細胞，有利于多酚的分離與溶出。但超聲溫度過高時，多酚中部分不穩(wěn)定的結構會發(fā)生變化，使得多酚的提取率降低。因此，最佳超聲溫度為70 ℃。

2.2 響應面優(yōu)化工藝

2.2.1 響應面設計及分析 以黃瓜多酚提取率為響應值，在單因素的基礎上，對影響黃瓜多酚提取率的工藝因素進行響應面優(yōu)化，并利用Design Expert 8.05b軟件進行Box-Benhnken試驗設計與分析，結果見表3。

由表3試驗結果，通過Design Expert 8.05b軟件分析，得到以黃瓜多酚提取率（Y）為響應值，用字母（A、B、C、D）分別替代超聲時間、液料比、乙醇含量和超聲溫度為自變量的四元二次回歸模型：

Y=11.21+0.020A+0.38B+0.39C-0.49D- 0.13AB-0.012AC-0.15AD+0.17BC+0.16BD- 0.15CD-0.15A2-0.46B2-0.73C2-0.69D2。

由表4可知，該回歸模型F=51.75，P<0.000 1，表明這個模型已經(jīng)達到極顯著水平。相關系數(shù)R2=0.981 0，表明四元二次回歸模型的預測值與試驗值具有較高的相關性，超過98%的試驗值可以利用該四元二次回歸模型來進行預測與解釋;失擬項F=3.82，P=0.104 4>0.05，由此可以看出該失擬項不顯著;變異系數(shù)為1.35%<5%，表明該回歸模型的重現(xiàn)性好，準確性和可信度高。根據(jù)F及P值分析可以得到各工藝條件對黃瓜多酚提取率影響的順序為：超聲溫度>乙醇含量>液料比>超聲時間。響應值與所考察的各工藝之間不是單純的線性關系，其中對響應值影響極顯著的有液料比一次項、乙醇含量一次項、超聲溫度一次項，超聲時間的二次項、液料比的二次項、乙醇含量的二次項、超聲溫度的二次項;對響應值影響顯著的有超聲時間和超聲溫度的二次交互項、液料比和乙醇含量的二次交互項、液料比和超聲溫度的二次交互項、乙醇含量和超聲溫度的二次交互項，其他項對響應值影響不顯著。

2.2.2 響應面分析 圖5～10左邊是黃瓜多酚提取率的響應面圖，右邊是黃瓜多酚提取率的等高線圖。圖中反映了試驗設計中的4個單因素中有2個因素取零水平時，另2個因素的交互作用對提取黃瓜多酚的影響程度，從圖中就可以清晰地看出曲線的陡度和等高線的形狀得到所考察的變量之間的交互作用。從圖中可以看出，響應面曲線最陡的是液料比和乙醇含量，其等高線偏離圓形也最大，由此可知，液料比和乙醇含量之間的交互作用的影響程度是最顯著的;在響應面曲線陡度和等高線偏離圓形的程度大小中，也可以看出影響液料比和超聲溫度兩者之間的交互作用次之，表明液料比和超聲溫度的交互作用對黃瓜多酚的影響程度次之，根據(jù)上述，可得到各因素交互作用對黃瓜多酚提取率影響的顯著性順序為BC>BD>AD>CD>AB>AC。

2.2.3 最佳工藝驗證 通過分析軟件對回歸模型進行擬合分析，得到黃瓜多酚的最佳提取工藝為：超聲時間30.13 min，液料比27.05 mL·g-1、乙醇含量63.51%、超聲溫度68.27 ℃，預測的多酚提取率的最大值為11.44 mg·g-1。為確定擬合的最佳提取工藝的準確性與可靠性，結合實際試驗操作，將各工藝條件修正為：超聲時間30 min，液料比27 mL·g-1、乙醇含量64%、超聲溫度68 ℃，進行3次平行驗證性試驗，黃瓜多酚提取率為11.33 mg·g-1，與模型試驗的預測值11.44 mg·g-1相比，兩者相對誤差為0.96%，表明了該模型具有較好的擬合性。因此，利用響應面法對黃瓜多酚優(yōu)化所得的提取工藝參數(shù)預測準確，數(shù)據(jù)可靠，具有一定的實用價值，為黃瓜多酚的提取與開發(fā)提供新的方向。

2.3 黃瓜多酚對酪氨酸酶的抑制作用

由圖11可以看出，隨著對照曲酸濃度的增加，曲酸對酪氨酸酶的抑制率迅速增加，在質量濃度為60 mg·L-1時，抑制率達80%以上;隨著黃瓜多酚濃度的增加，黃瓜多酚對酪氨酸酶的抑制率逐漸提高，在質量濃度為200 mg·L-1時，抑制率達76.35%，表明黃瓜多酚對酪氨酸酶有一定的抑制作用，且多酚濃度與酪氨酸酶抑制率存在量效關系，但其對酪氨酸酶的抑制率小于曲酸。表明黃瓜多酚對酪氨酸酶具有一定的抑制作用，可作為天然的酪氨酸酶抑制劑，是一種潛在的天然美白添加劑。

3 討論與結論

具有美白功效的護膚品受到了人們的喜愛，但其往往含有熊果苷、曲酸等化學合成的酪氨酸酶抑制劑，這些抑制劑的安全性已受到人們的廣泛關注。一些研究結果表明，天然植物多酚具有一定的酪氨酸酶抑制作用，與化學合成酪氨酸酶抑制劑相比，天然植物多酚更加安全、溫和與穩(wěn)定。劉東茹等[10]比較了蘋果幼果多酚及根皮苷對酪氨酸酶的抑制作用，結果表明，蘋果多酚可通過抑制酪氨酸羥化生成多巴及抑制多巴氧化成多巴醌來減少黑色素的合成，蘋果幼果多酚對酪氨酸酶活性的抑制效果優(yōu)于根皮苷，有望開發(fā)應用于美白產(chǎn)品中。宋見喜等[11]對地榆多酚的純化工藝進行研究，并進一步研究了地榆多酚對酪氨酸酶活性的抑制作用，結果表明，地榆多酚對酪氨酸酶具有較好且穩(wěn)定的抑制效果，可以作為一種天然的抑制劑應用到美白護膚品中。黃瓜中含有多酚等天然有效成分，常被人們切片后直接敷于面部，具有美容、護扶、養(yǎng)顏和抗衰老等功效，與蘋果幼果多酚對酪氨酸酶的抑制率（85.81%）相比，黃瓜多酚的抑制率僅為76.35%，但強于地榆多酚（最大僅為64.30%）。植物中有效成分的提取方法能直接影響到目標產(chǎn)物對酪氨酸酶的抑制活性，目前，從植物中提取多酚的常見方法有水提法、微波輔助法、超聲波輔助法、酶解法和超臨界法等[12]，其中，超聲波屬于機械振動波，其空化、剪切和機械效應能在不破壞多酚活性成分的前提下，將植物多酚有效地從細胞內(nèi)部分離出來，具有提取時間短、耗能低、提取率高等優(yōu)點[13]。筆者以黃瓜為原料，考察了各工藝因素對黃瓜多酚超聲提取工藝的影響，并利用響應面法對提取工藝進行了優(yōu)化，建立了四元二次回歸方程：

Y=11.21+0.020A+0.38B+0.39C-0.49D- 0.13AB-0.012AC-0.15AD+0.17BC+0.16BD- 0.15CD-0.15A2-0.46B2-0.73C2-0.69D2，該回歸模型準確性和可信度高，可用于黃瓜多酚提取分析與預測。黃瓜多酚提取的最佳工藝為：超聲時間30 min、液料比27 mL·g-1、乙醇含量64%和超聲溫度68 ℃，黃瓜多酚提取率為11.33 mg·g-1，與模型預測值（11.44 mg·g-1）相比，其相對誤差為0.96%，表明了該模型具有較好的擬合性。黃瓜多酚對酪氨酸酶有一定的抑制作用，且多酚濃度與酪氨酸酶抑制率存在量效關系，可作為天然的酪氨酸酶抑制劑，是一種潛在的天然美白添加劑，該工藝為黃瓜多酚的提取與開發(fā)提供新的方向。

參考文獻

[1] SUI X，NIE J，LI X，et al.Transcriptomic and functional analysis of cucumber（Cucumis sativus L.）fruit phloem during early development[J].The Plant Journal，2018，96（5）：982-996.

[2] LI H，HE J，YANG X，et al.Glutathione-dependent induction of local and systemic defense against oxidative stress by exogenous melatonin in cucumber（Cucumis sativus L.）[J].Journal of Pineal Research，2016，60（2）： 206-216.

[3] SUSANTI L，WIDODO S，AINI Q，et al.Antibacterial activity from Cucumber（Cucumis sativus L.）ethanol extract in deodorant roll on dosage form[J].Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology，2017（S1）：15-22.

[4] 賁昊璽，陸大東，卞寧生，等.黃瓜化學成分的提取與研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20（3）：388-394.

[5] PAPAEVGENIOU N，CHONDROGIANNI N.Anti-aging and anti-aggregation properties of polyphenolic compounds in C. elegans[J].Current Pharmaceutical Design，2018，24（19）：2107-2120.

[6] DAVINELLI S，BERTOGLIO J C，POLIMENI A，et al.Cytoprotective polyphenols against chronological skin aging and cutaneous photodamage[J].Current Pharmaceutical Design，2018，24（2）：99-105.

[7] ZOLGHADRI S，BAHRAMI A，HASSANKHAN M T，et al.A comprehensive review on tyrosinase inhibitors[J].Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry，2019，34（1）：279-309.

[8] MASUM M N，YAMAUCHI K，MITSUNAGA T.Tyrosinase inhibitors from natural and synthetic sources as skin-lightening agents[J].Reviews in Agricultural Science，2019，7（4）：41-58.

[9] 陳建福，林洵，陳俊堯，等.響應面法優(yōu)化超聲波輔助提取柚葉多酚的工藝研究[J].河南工業(yè)大學學報（自然科學版），2016，37（3）：47-54.

[10] 劉東茹，任亞梅，伯繼芳，等.根皮苷及蘋果幼果多酚對酪氨酸酶活性的抑制作用[J].現(xiàn)代食品科技， 2019，35（8）：107-113.

[11] 宋見喜，閆運開，張詩朦，等.地榆多酚的分離純化及其對酪氨酸酶活性的抑制[J].東北林業(yè)大學學報，2019，47（9）：85-90.

[12] AMEER K，SHAHBAZ H M，KWON J H.Green extraction methods for polyphenols from plant matrices and their byproducts： A review[J].Comprehensive Reviews in Food Science & Food Safety，2017，16（2）：295-315.

[13] NATOLINO A，PORTO C D.Kinetic models for conventional and ultrasound assistant extraction of polyphenols from defatted fresh and distilled grape marc and its main components skins and seeds[J].Chemical Engineering Research and Design，2020，156：1-12.