檸檬苦素抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)基因芯片分析

凌 珺， 劉伯霞， 李 濤， 陳 靜

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏回族自治區(qū)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤外科，銀川 750004）

乳腺癌嚴(yán)重威脅女性生命健康，具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)的特征[1-2]?，F(xiàn)階段針對(duì)乳腺癌的治療方法常為手術(shù)治療和藥物治療，因其副反應(yīng)較為明顯，近幾年臨床出現(xiàn)的靶向治療[3]尤為重要。腫瘤轉(zhuǎn)移是一系列連續(xù)的過(guò)程。惡性腫瘤的典型特征是腫瘤轉(zhuǎn)移，其過(guò)程的發(fā)生不僅需要基質(zhì)蛋白酶、細(xì)胞因子和多種黏附分子的參與[4-5]，還需要相關(guān)基因及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等發(fā)生改變。有研究表明信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在癌細(xì)胞的增殖、分化中起著關(guān)鍵的作用[6-8]。柑橘內(nèi)含有的檸檬苦素對(duì)癌癥可以起到很好的預(yù)防治療效果[9-12]，且經(jīng)過(guò)體外誘導(dǎo)凋亡等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞系中（如乳腺癌、肺癌、骨肉瘤和結(jié)腸細(xì)胞等）均顯示出相應(yīng)的抗癌潛力[13-15]。

基因芯片技術(shù)現(xiàn)已成為研究人類(lèi)疾病發(fā)生中分子機(jī)制的一個(gè)主要方法[16-17]。人們常選用基因芯片技術(shù)來(lái)分析腫瘤的分型從而確定臨床下一步治療方案及靶向藥的選擇[18]?；诖?，本課題組希望利用生物信息學(xué)手段，通過(guò)分析經(jīng)檸檬苦素作用后，乳腺癌細(xì)胞基因的改變，來(lái)尋找其發(fā)揮作用的分子機(jī)制及關(guān)鍵靶標(biāo)，為檸檬苦素抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供更充分的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；4 ℃低溫離心機(jī)（Eppendorf 公司）；ABI 9700 RCR 儀（ABI 公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、Nanodrop2000、GeneChipHybridization Oven 645、GeneChipFluidics Station 450、GeneChipScanner 30007G（Thermo Fisher公司）。

1.1.2 細(xì)胞、試劑與分組 三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231（美國(guó)Type Culture Collection 公司）。細(xì)胞用含有10%胎牛血清（MultiCell Technologies公司）的RPMI-1640 培養(yǎng)基（MultiCell Technologies 公司）并且在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。檸檬苦素20 mg（limonin）（上海融禾醫(yī)藥公司）。將乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞株按照2×106的密度培養(yǎng)在直徑為10 cm 培養(yǎng)皿中；待細(xì)胞貼壁后，分別用不同濃度的檸檬苦素（0、40、60 μM）進(jìn)行處理，將收集的細(xì)胞分為對(duì)照組C（未經(jīng)檸檬苦素處理的三個(gè)對(duì)照組C1、C2、C3）及6 個(gè)實(shí)驗(yàn)組T（經(jīng)40 μM 檸檬苦素處理的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組T1、T2、T3，經(jīng)60 μM 檸檬苦素處理的三個(gè)實(shí)驗(yàn)組T4、T5、T6）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和總RNA 提取和純化 細(xì)胞經(jīng)檸檬苦素處理24 h，細(xì)胞貼壁程度達(dá)到85%～90%后，用PBS 進(jìn)行清洗，隨后加入TRIzol 反復(fù)吹打，待細(xì)胞充分裂解后，離心收集細(xì)胞。離心收集后的細(xì)胞室溫靜置5 min，使復(fù)合物充分分離。加入氯仿后，充分震蕩15 s，靜置3 min。4 ℃、12000 r·min-1離心10 min，吸取上清。加入異丙醇，上下充分顛倒混勻后，靜止10 min，4 ℃、12000 r·min-1離心10 min，棄去上清，用75%乙醇洗滌沉淀，室溫靜置5 min 充分干燥后，加入DEPC 輕彈溶解RNA，55～60 ℃放置10 min，使RNA 充分溶解。-70 ℃進(jìn)行保存。提取總RNA 濃度和質(zhì)量采用分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，總RNA 純化的詳細(xì)步驟嚴(yán)格按照3’IVT PLUS Reagent Kit 操作。

1.2.2 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理和差異基因（DEGs）的篩選 將樣本處理后的基因數(shù)據(jù)集用Robust multi-chip average（RMA）進(jìn)行統(tǒng)一性處理，通過(guò)R-package Combat 去除批次效應(yīng)（batch effects）后，利用R 語(yǔ)言中的Limma 包初篩后得出差異基因[19-20]。以校正后的P＜0.01，|log2FC|＞1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到不同檸檬苦素濃度處理后的實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組顯著上調(diào)、下調(diào)的差異基因，并以對(duì)照組的基因芯片為驗(yàn)證集，考察所篩選出來(lái)的差異基因表達(dá)值與聚類(lèi)區(qū)分度。根據(jù)樣本類(lèi)型和基因表達(dá)量，使用MEV4.9.0（multi experiment vie-wer）繪制基因聚類(lèi)熱圖。

1.2.3 GO 功能注釋和KEGG 富集分析 采用DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)GO 功能富集（gene ontology，GO）及KEGG 功能富集（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）對(duì)差異基因進(jìn)行分析[21-22]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檸檬苦素藥物處理組與對(duì)照組之間的差異采用t 檢驗(yàn)。差異基因GO 功能注釋和KEGG 富集采用超幾何分布分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因

初篩得到的差異基因中選擇服從P＜0.01、|log2FC|＞1 標(biāo)準(zhǔn)的差異基因?yàn)榇舜窝芯康哪康幕?。在?duì)照組及不同濃度檸檬苦素處理的實(shí)驗(yàn)組中，篩選出有表達(dá)差異的基因438 個(gè)，這些基因中包含81 個(gè)基因的表達(dá)顯著上調(diào)和63 個(gè)基因的表達(dá)顯著下調(diào)（差異均在2 倍以上）。聚類(lèi)熱圖用于表示這些基因在對(duì)照組和不同濃度檸檬苦素干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)的情況。檸檬苦素抑制了STAT3 及大多數(shù)下游目標(biāo)基因的表達(dá)水平，尤其人類(lèi)1 型胰島素樣生長(zhǎng)因子受體（the human type 1 insulin-like growth factor receptor，IGF-1R）、胰島素樣生長(zhǎng)因2（insulin-like growth factor-2，IGF2）、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（Cyclic AMP response element-binding protein 1，CREB1）和真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（Eukaryotic translation Initiation Factor 4E，EIF4E）的表達(dá)呈現(xiàn)明顯下調(diào)趨勢(shì)，差異值在2 倍以上，見(jiàn)圖1。

2.2 GO 富集分析和KEGG 富集分析

GO 分析顯示，下調(diào)的DEGs 顯著富集在生物學(xué)過(guò)程中包括跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控、對(duì)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)等。在分子功能中下調(diào)的DEGs 富集于細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞-底物黏附、細(xì)胞遷移的調(diào)控等，見(jiàn)圖2。GO 細(xì)胞成分分析顯示，下調(diào)的DEGs 富集于血管發(fā)育、維管系統(tǒng)發(fā)育、血管形態(tài)發(fā)生學(xué)、血管再生。同時(shí)在KEGG 通路富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異基因主要富集于血管生成途徑、胰島素受體信號(hào)傳導(dǎo)途徑和NF-κB 信號(hào)通路等，見(jiàn)圖3。

3 討論

目前基因芯片技術(shù)已用于臨床腫瘤研究，尤其在乳腺癌的研究中有了極大的進(jìn)展[23-25]，促進(jìn)了乳腺癌的分子分型，推動(dòng)了臨床的靶向治療。本研究通過(guò)基因芯片檢測(cè)未經(jīng)檸檬苦素處理的乳腺癌細(xì)胞和不同濃度檸檬苦素處理的乳腺癌細(xì)胞基因表達(dá)情況，共得到表達(dá)差異的基因438個(gè)，這些基因中包含81 個(gè)基因表達(dá)的上調(diào)和63個(gè)基因的表達(dá)下調(diào)。由于基因芯片是高通量的檢測(cè)技術(shù)，其影響因素較多，難免出現(xiàn)假陽(yáng)性。為了加強(qiáng)本次基因芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織最常見(jiàn)的惡性腫瘤[2]，其高發(fā)病率和病死率已成為危害世界女性生命健康的主要原因。目前，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率和病死率也處于逐步上升的趨勢(shì)，其中腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致死亡的重要因素。乳腺癌的轉(zhuǎn)移與其他腫瘤轉(zhuǎn)移類(lèi)似，都是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子STAT3 發(fā)揮著關(guān)鍵作用[26]。STAT3 發(fā)揮著調(diào)控細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移和血管生成的作用，同時(shí)影響著腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[27-28]。

檸檬苦素是柑橘的主要活性成分之一，現(xiàn)已被安全地用作營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)健康的膳食補(bǔ)充劑。雖然作為一類(lèi)中草藥單體化合物，但有研究[29]證實(shí)其具有的抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)。本研究通過(guò)設(shè)置對(duì)照組與不同濃度干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行基因芯片表達(dá)譜差異分析，從中篩選出關(guān)鍵的差異基因，對(duì)差異基因進(jìn)行功能注釋和通路富集分析。從基因芯片分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)檸檬苦素抑制了乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)大多數(shù)下游目標(biāo)基因的表達(dá)水平，尤其是IGF2、IGF-1R、CREB1、EIF4E 的表達(dá)均呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。有研究報(bào)道[13，30-32]，IGF2、IGF-1R、CREB1、EIF4E 與乳腺癌的轉(zhuǎn)移及其惡性進(jìn)展過(guò)程密切相關(guān)。其中，IGF2 是肝臟分泌細(xì)胞中啟到關(guān)鍵作用的基因。IGF2 在體內(nèi)可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成、DNA 的產(chǎn)生及新生血管的形成，同時(shí)還具有促進(jìn)組織生長(zhǎng)和分化的能力。IGF-1R 是一個(gè)類(lèi)似胰島素的受體，參與機(jī)體內(nèi)多種過(guò)程，包括有絲分裂、細(xì)胞存活和分化。IGF2 的非調(diào)控表達(dá)和IGF-1R 信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的激活與腫瘤干細(xì)胞的增殖、存活和自我更新的維持有關(guān)。IGF2 可以通過(guò)激活I(lǐng)GF 信號(hào)通路，導(dǎo)致STAT3 磷酸化，激活下游靶因子，從而進(jìn)一步達(dá)到促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用[33]。EIF4E 是蛋白質(zhì)翻譯的主要控制點(diǎn)，是真核起始因子4F（eukaryotic translation initiation factor 4F，EIF4F）復(fù)合物的一部分。當(dāng)EIF4E 的翻譯信號(hào)激活時(shí)就會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[34]。CREB1 在人體中是一種重要的原癌基因，在不同信號(hào)通路與下游靶基因轉(zhuǎn)錄之間起中介作用。同時(shí)在cAMP/PKA 通路中，激活的CREB1 可以與啟動(dòng)因子上保守的cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮著促進(jìn)細(xì)胞增殖分化和促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)生的作用[35]。IGF-1R 及其下游轉(zhuǎn)錄因子STAT3/CREB1 信號(hào)的結(jié)構(gòu)性和異常激活在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用，活化的STAT3/CREB1 可能移位到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)侵襲相關(guān)靶基因和血管生成基因的表達(dá)，參與基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的降解，促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和血管生成。因此猜測(cè)檸檬苦素可能通過(guò)抑制IGF2/IGFR1 介導(dǎo)的STAT3 信號(hào)通路的活性以及下調(diào)CREB1/EIF4E 相應(yīng)靶基因的激活從而達(dá)到抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，本課題組將進(jìn)一步進(jìn)行深入探究。

本研究中，利用多種生物信息學(xué)方法多角度考察了對(duì)照組和經(jīng)不同濃度檸檬苦素處理的實(shí)驗(yàn)組在基因表達(dá)及生物學(xué)過(guò)程之間的差異。從基因?qū)用嫣剿髁藱幟士嗨匾种迫橄侔┺D(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)及通路，為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的治療提供更好的方向。

綜上所述，檸檬苦素及其結(jié)構(gòu)衍生物可能是一類(lèi)具有潛在低毒性的抗癌藥物，其機(jī)制可能是部分通過(guò)IGF2/IGFR1 介導(dǎo)的STAT3 信號(hào)傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)。