心臟疾病標(biāo)志物cTnT和H-FABP聯(lián)合檢測微流體測試卡的開發(fā)及評(píng)價(jià)*

孫雪梅，許 強(qiáng)，孫曉萌，王軼鵬，呂衍民，孫曉艷，孟凡達(dá)

山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/山東第一醫(yī)科大學(xué)，山東濟(jì)南 250062

心臟疾病發(fā)病時(shí)急且危重，嚴(yán)重時(shí)會(huì)危及到患者的生命，心臟疾病生物學(xué)標(biāo)志物應(yīng)用于心臟疾病患者的早期檢測能夠幫助臨床醫(yī)生快速而準(zhǔn)確地診斷，從而做出進(jìn)一步的治療決策，挽救患者的生命[1-7]。在心臟疾病發(fā)展的不同階段患者血清中存在相應(yīng)的標(biāo)志物，直接或間接反映疾病狀況。心肌肌鈣蛋白(cTn)被視為心臟疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，廣泛用于心臟疾病的診斷中[8-9]，cTn具有T、I、C 3種亞型，其中cTnT和cTnI是心肌特異性蛋白，但是，在心臟疾病患者胸痛發(fā)作后4～6 h內(nèi)其反應(yīng)敏感性相對(duì)較差。心型脂肪酸結(jié)合蛋白(H-FABP)在發(fā)生心肌缺血或損傷時(shí)能夠迅速穿透細(xì)胞膜釋放到血液中，早期診斷靈敏度高[10]。臨床上，進(jìn)行cTn與H-FABP的聯(lián)合檢測能夠結(jié)合2種標(biāo)志物的優(yōu)勢，極大提高診斷的靈敏度和特異度。

即時(shí)檢測(POCT)能夠?qū)崿F(xiàn)床旁診斷，在采樣現(xiàn)場即刻進(jìn)行分析，快速得到檢測結(jié)果。微流體技術(shù)與POCT檢測方法相結(jié)合在心臟疾病的臨床診斷上已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[11-15]。POCT應(yīng)用于心臟疾病標(biāo)志物的快速檢測可輔助醫(yī)生對(duì)患者采取及時(shí)的治療措施，對(duì)個(gè)性化治療的發(fā)展、醫(yī)療水平的提高、醫(yī)療費(fèi)用的減控有重要意義。因此，建立一種低成本的，能夠同時(shí)進(jìn)行多種靶標(biāo)快速檢測的，靈敏度較高的心臟疾病標(biāo)志物檢測方法意義重大。

本研究建立了一種在自驅(qū)動(dòng)微流體測試卡上快速聯(lián)合檢測心臟疾病標(biāo)志物cTnT和H-FABP的方法。本研究建立的檢測方法有特異性良好、檢測時(shí)間短、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了心臟疾病標(biāo)志物的聯(lián)合檢測，能夠滿足臨床需求，有良好的應(yīng)用前景?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 激光切割機(jī)購自美國Universal公司；Nano-Plotter超微量點(diǎn)樣儀購自德國GeSim公司；鼓風(fēng)干燥箱購自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；冷凍離心機(jī)購自德國Sigma公司；多模式微孔板分析儀購自德國PerkinElmer公司；高聚合度有機(jī)玻璃板PMMA(1 mm)購自深圳鴻年金屬材料有限公司；3M雙面膠(100 μm)購自深圳凱誠興科技有限公司。H-FABP抗原標(biāo)準(zhǔn)品、捕獲抗體F2和標(biāo)記抗體F1(2種不同的抗H-FABP單克隆抗體)、cTnT抗原標(biāo)準(zhǔn)品、捕獲抗體T2和標(biāo)記抗體T1(2種不同的抗cTnT單克隆抗體)均購自芬蘭Hytest公司；羧基修飾Eu時(shí)間分辨熒光微球(200 nm)購自上海微測生物科技有限公司；吐溫-20、硼酸、硼砂、氯化鈉、無水碳酸鈉、碳酸氫鈉、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)、1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺(EDC)、戊二醛、小牛血清均購自北京欣經(jīng)科生物科技有限公司；聚苯乙烯接枝馬來酸酐、甲苯購自北京藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司；海藻糖購自日本林原公司；其他未提及試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2緩沖溶液、稀釋液等溶液的配制 (1)碳酸鹽緩沖液的配制：稱取無水碳酸鈉1.59 g，碳酸氫鈉2.93 g，用超純水溶解至900 mL，使用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為9.60后，定容至1 000 mL。(2)捕獲抗體點(diǎn)樣緩沖液的配制：稱取海藻糖1 g，使用pH值為9.60的碳酸鹽緩沖液溶解至10 mL。(3)2-N-嗎啉代-乙基磺酸(MES)緩沖液的配制：稱取MES 10.6 g，用超純水溶解至450 mL，使用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為5.80后，定容至500 mL。(4)硼酸緩沖液的配制：稱取硼酸4.02 g，硼砂3.34 g，氯化鈉0.95 g，用超純水溶解至450 mL，用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8.20后，定容至500 mL。(5)標(biāo)記抗體微球稀釋液的配制：稱取蔗糖2 g，牛血清清蛋白0.20 g，吐溫-20 100 μL，使用pH值為8.20硼酸緩沖液溶解至10 mL。

1.3時(shí)間分辨微球的標(biāo)記 取50 μL熒光微球，使用pH值為5.80的MES緩沖溶液清洗，11 000 r/min離心5 min去除上清液，將微球使用500 μL MES緩沖液超聲重懸；加入10 μL EDC(50 mg/mL)溶液，室溫反應(yīng)20 min；11 000 r/min離心5 min去除上清液，使用pH值為8.20的硼酸緩沖液超聲重懸微球至500 μL；加入50 μg標(biāo)記抗體，室溫振蕩反應(yīng)2 h；加入50 μL含10% 牛血清清蛋白的硼酸緩沖液，封閉反應(yīng)1 h；11 000 r/min離心5 min去除上清液，使用1 mL標(biāo)記抗體微球稀釋液超聲重懸微球，4 ℃儲(chǔ)存。

1.4測試卡的設(shè)計(jì)及組裝 使用激光切割機(jī)分別將PMMA切割成上蓋和底板，將3M雙面膠切割成通道結(jié)構(gòu)。上蓋使用等離子表面活化后，使用pH值為2.00硫酸溶液浸泡處理后，烘干備用；底板使用等離子表面活化后，APTES溶液浸泡10 min，N2吹干后浸泡于戊二醛溶液中10 min，N2吹干后分別在指定區(qū)域固定捕獲抗體及標(biāo)記微球，按步驟組裝成微流體測試卡。

1.5免疫反應(yīng)流程 檢測時(shí)，直接向加樣區(qū)滴加80 μL血清，固定在通道中的標(biāo)記微球首先與標(biāo)本中待測抗原反應(yīng)形成抗原-標(biāo)記微球復(fù)合物；在標(biāo)本流經(jīng)捕獲抗體固定區(qū)時(shí)，抗原-標(biāo)記抗體復(fù)合物與固定在檢測區(qū)的捕獲抗體反應(yīng)，形成捕獲抗體-抗原-標(biāo)記微球復(fù)合物；檢測區(qū)微球的捕獲量與標(biāo)本中抗原濃度相關(guān)。在激發(fā)波長340 nm、發(fā)射波長615 nm、延遲時(shí)間600 μs條件下使用多模式微孔板分析儀測定檢測區(qū)熒光強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)本中待測抗原的定量。整個(gè)檢測過程能夠在10 min以內(nèi)完成。見圖1。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)測量3次，建立與標(biāo)準(zhǔn)濃度之間的參考曲線，使用origin進(jìn)行線性擬合并計(jì)算相關(guān)系數(shù)。進(jìn)行方法學(xué)比較時(shí)，每個(gè)實(shí)際血清樣本測試1次，并將測試結(jié)果與商業(yè)化平臺(tái)測試結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，使用origin進(jìn)行線性關(guān)系對(duì)照，并計(jì)算兩者之間的線性相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1捕獲抗體點(diǎn)樣濃度優(yōu)化 分別使用不同濃度的捕獲抗體進(jìn)行點(diǎn)樣，測定不同cTnT和H-FABP濃度的標(biāo)本，考察捕獲抗體點(diǎn)樣濃度對(duì)免疫反應(yīng)的影響。對(duì)于2種抗原的檢測，當(dāng)捕獲抗體的點(diǎn)樣濃度達(dá)到50 μg/mL時(shí)，檢測的熒光信號(hào)值均不再隨點(diǎn)樣抗體濃度的增加而增加。在測試卡制作時(shí)，針對(duì)2種標(biāo)記物的檢測捕獲抗體點(diǎn)樣濃度均確立為50 μg/mL。見圖2。

圖1 免疫分析反應(yīng)流程圖

注：A為不同捕獲抗體濃度檢測cTnT；B為不同捕獲抗體濃度檢測H-FABP。

2.2標(biāo)記抗體使用量優(yōu)化 分別使用不同體積標(biāo)記微球固定在通道內(nèi)，測定不同cTnT和H-FABP濃度的標(biāo)本，考察標(biāo)記抗體使用量對(duì)免疫反應(yīng)的影響。當(dāng)標(biāo)記微球使用量達(dá)到1 μL時(shí)，檢測的熒光信號(hào)值達(dá)到飽和值。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)2種標(biāo)志物檢測標(biāo)記微球使用量均選擇1 μL。見圖3。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線 在設(shè)定好的檢測條件下，建立cTnT在0.1～100.0 ng/mL范圍的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(n=3)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)>0.99，檢出限為0.02 ng/mL(s/n=3)；建立H-FABP在0.5～100.0 ng/mL范圍的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(n=3)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)>0.99,檢出限為0.05 ng/mL(s/n=3)。針對(duì)2個(gè)指標(biāo)檢測的線性關(guān)系均良好，可以滿足臨床標(biāo)本的定量檢測的需求。

2.4穩(wěn)定性 考察了組裝好的測試卡在37 ℃放置一定時(shí)間后的檢測性能，其中cTnT和H-FABP的濃度均為10 ng/mL。在37 ℃放置7 d后，測試卡對(duì)2種標(biāo)志物的檢測均能保持良好的檢測性能，說明測試卡的穩(wěn)定性良好。見圖4。

注：A為不同標(biāo)記抗體量檢測cTnT；B為不同標(biāo)記抗體量檢測H-FABP。

2.5特異性 考察了cTnT和H-FABP的濃度均為10 ng/mL時(shí)，在待測標(biāo)本中分別加入1、10 μg/mL的C-反應(yīng)蛋白、50 ng/mL的降鈣素原，測試不同濃度、不同類別干擾物對(duì)檢測結(jié)果的影響，結(jié)果顯示干擾物的加入對(duì)2種抗原的檢測沒有影響，說明該測試卡對(duì)2種標(biāo)志物的檢測特異性良好。見圖4。

注：A為測試卡穩(wěn)定性；B為測試卡特異性。

2.6血清測試方法學(xué)比較 利用建立起的微流體熒光免疫測試卡，檢測了31份cTnT的臨床血清標(biāo)本，將這些標(biāo)本的檢測結(jié)果與羅氏公司的cobas?e411電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀的測試結(jié)果進(jìn)行比較。R2=0.981 4，說明兩者測試結(jié)果一致，系統(tǒng)之間相關(guān)性良好；利用建立起的微流體熒光免疫測試卡，檢測了33份H-FABP的臨床血清標(biāo)本，將這些標(biāo)本的檢測結(jié)果與酶標(biāo)試劑盒的測試結(jié)果進(jìn)行比較。R2=0.957 5，說明兩者測試結(jié)果一致，系統(tǒng)之間相關(guān)性良好。

2.7聯(lián)合檢測性能評(píng)估 使用添加法配制cTnT和H-FABP的混合血樣，利用測試卡進(jìn)行了人血清中2種靶標(biāo)的聯(lián)合檢測。測試卡對(duì)2種標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測時(shí)，平均回收率>90%，批內(nèi)精密度<15%，說明該方法有良好的檢測效果，能夠滿足臨床上的檢測需求。見表1。

表1 2種標(biāo)志物聯(lián)合檢測性能評(píng)估(n=4)

3 討 論

臨床上，幾種生物學(xué)標(biāo)志物的聯(lián)合檢測能夠極大地提高診斷的穩(wěn)定性及特異性，多靶標(biāo)同時(shí)檢測可減少標(biāo)本的使用量，減輕患者的痛苦；傳統(tǒng)的免疫比濁法、酶聯(lián)免疫吸附測定、免疫側(cè)向的方法難以滿足多靶標(biāo)同時(shí)檢測的要求。微流體技術(shù)與免疫測定技術(shù)相結(jié)合，使用時(shí)間分辨熒光的方式進(jìn)行標(biāo)記，能夠綜合幾種方法的優(yōu)勢，極大地降低熒光檢測中背景熒光的干擾，提高檢測的穩(wěn)定性和特異性。

本研究建立了一種能夠?qū)崿F(xiàn)心臟疾病標(biāo)志物cTnT和H-FABP聯(lián)合檢測的微流體測試卡，為了使測試卡的性能達(dá)到最佳，本研究分別對(duì)捕獲抗體點(diǎn)樣濃度和標(biāo)記抗體使用量進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，捕獲抗體點(diǎn)樣濃度達(dá)到50 μg/mL時(shí)，免疫反應(yīng)達(dá)到飽和；標(biāo)記微球使用量1 μL時(shí)，免疫反應(yīng)達(dá)到飽和；加急反應(yīng)顯示測試卡在37 ℃放置7 d仍能保持較高的反應(yīng)性。在設(shè)定好的反應(yīng)條件下，該測試卡在10 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)2種心臟疾病標(biāo)志物的聯(lián)合檢測，cTnT在0.1～100.0 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，檢出限為0.02 ng/mL；H-FABP在0.5～100.0 ng/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，檢出限為0.05 ng/mL。針對(duì)于2種標(biāo)志物的檢測，該方法回收率為94.0%～109.5%，批內(nèi)精密度均<15%，呈現(xiàn)出良好的精密度和重現(xiàn)性。同時(shí)，進(jìn)行血清檢測時(shí)，與商業(yè)化的檢測方法比較，相關(guān)系數(shù)均>0.95，測試結(jié)果一致，相關(guān)性良好。

該測試卡可以應(yīng)用于腫瘤、過敏原等其他標(biāo)志物的檢測，與電化學(xué)等傳感器平臺(tái)集成，能夠?qū)崿F(xiàn)更廣泛的應(yīng)用，從而更適用于臨床的快速檢測。

綜上所述，本研究建立了微流體測試卡對(duì)心臟疾病標(biāo)記物cTnT和H-FABP的聯(lián)合檢測方法，與臨床上使用的商業(yè)化儀器和方法比較一致性良好；使用添加法進(jìn)行了cTnT和H-FABP的聯(lián)合檢測，回收率、精密度均能滿足臨床要求，說明該檢測方法能夠應(yīng)用于心臟疾病標(biāo)志物的檢測。同時(shí)，該檢測方法檢測成本低、制作方法簡單、操作簡便、能夠在10 min內(nèi)完成相關(guān)標(biāo)志物的檢測，檢測特異性和檢測范圍均能滿足臨床檢測的需求。