蛋白酶K預(yù)處理在SARS-CoV-2核酸提取中的應(yīng)用探討*

王 念，巫麗娟，周 易，宋興勃，葉遠(yuǎn)馨，鐘慧鈺，周汶靜，陶昕彤，劉堂喻亨，宋佳佳，斯艷君，陸小軍，應(yīng)斌武

四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川成都 610041

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)的迅速傳播，已嚴(yán)重危害人類健康。早期實(shí)驗(yàn)室診斷可及時(shí)隔離新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)患者及其密切接觸者，打破傳播鏈[1-2]。同時(shí)，早期診斷和治療可使患者有更好的結(jié)局[3]。大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)對(duì)SARS-CoV-2進(jìn)行核酸檢測(cè)[4]。然而，SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的陽性率并不高。其中，核酸提取效率是影響其檢出率的重要因素之一。因?yàn)榈鞍酌窴(PK)可對(duì)生物標(biāo)本中的蛋白質(zhì)進(jìn)行消化，同時(shí)還可降解標(biāo)本中的RNA核酸酶，阻止RNA被降解，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行PK預(yù)處理可能會(huì)提高核酸的提取效率，從而降低其循環(huán)閾值(Ct值)，提高陽性檢出率。因此，本文就核酸提取前預(yù)處理是否需要加入PK進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 選取本院2020年1月25日至6月30日臨床上收集的COVID-19患者(根據(jù)SARS-CoV-2相關(guān)指南確診)[4]的核酸陽性標(biāo)本共70份，其中包括50份鼻咽拭子標(biāo)本和20份糞便標(biāo)本。

1.2儀器與試劑 鼻咽拭子含植絨拭子及3 mL保存液購自深圳海爾施生物醫(yī)藥股份有限公司；病毒RNA提取采用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統(tǒng)(購自法國生物梅里埃公司)；PK試劑購自瑞士羅氏公司；SARS-CoV-2檢測(cè)試劑購自湖南圣湘生物科技股份有限公司，采用SLAN-96P儀(購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司)進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。

1.3標(biāo)本處理與提取 所有標(biāo)本先經(jīng)過56 ℃、30 min 滅活。 鼻咽拭子標(biāo)本：取出標(biāo)本后混勻保存液，分別取2份1 mL待測(cè)標(biāo)本于1.5 mL小型離心管中，其中1份加入50 μL PK(20 mg/mL)，56 ℃下孵育30 min，另1份則直接在56 ℃下孵育30 min。糞便標(biāo)本：取黃豆般大小的大便置于15 mL離心管中，加入3 mL生理鹽水充分振蕩混勻，1 000 r/min離心 5 min，分別取2份1 mL上清液于1.5 mL 小型離心管中，其中1份加入50 μL PK(20 mg/mL)，56 ℃下孵育30 min，另1份則直接在56 ℃下孵育30 min。所有標(biāo)本的SARS-CoV-2核酸提取均采用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統(tǒng)進(jìn)行裂解、吸附和洗脫，洗脫體積為50 μL。

1.4標(biāo)本擴(kuò)增 根據(jù)試劑盒說明書對(duì)qPCR擴(kuò)增體系進(jìn)行配制，于qPCR儀上進(jìn)行SARS-CoV-2的ORF基因和N基因擴(kuò)增檢測(cè)。擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)設(shè)定：反轉(zhuǎn)錄50 ℃ 30 min；cDNA預(yù)變性95 ℃ 1 min ；變性 95 ℃ 15 s；退火、延伸及熒光采集60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。

1.5結(jié)果判讀 首先，分析內(nèi)標(biāo)VIC通道是否有擴(kuò)增曲線，且擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)是否達(dá)到設(shè)定的熒光閾值所對(duì)應(yīng)的Ct≤40。然后，再分析FAM或ROX通道是否檢測(cè)到典型的S型擴(kuò)增曲線。若Ct≤40，則判定該結(jié)果為SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽性；若FAM及ROX通道均未檢測(cè)到典型的S型擴(kuò)增曲線(未檢測(cè)到Ct)，或Ct>40，則表示SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陰性。

2 結(jié) 果

2.1鼻咽拭子標(biāo)本預(yù)處理的結(jié)果比較 在確診SARS-CoV-2患者核酸陽性的50份鼻咽拭子標(biāo)本中，結(jié)果顯示，未處理組的ORF基因的Ct值為33.92±4.42，PK組的ORF基因的Ct值為34.21±3.99，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；未處理組的N基因的Ct值為30.83±3.99，PK組的N基因的Ct值為31.12±4.31，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統(tǒng)提取SARS-CoV-2核酸時(shí)，增加PK預(yù)處理步驟對(duì)鼻咽拭子標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果沒有影響。見圖1。

2.2糞便標(biāo)本預(yù)處理的結(jié)果比較 在確診SARS-CoV-2患者核酸陽性的20份糞便標(biāo)本中，結(jié)果顯示，未處理組的ORF基因的Ct值為31.37±5.90，PK組的ORF基因的Ct值為31.08±5.71，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；未處理組的N基因的Ct值為27.74±3.47，PK組的N基因的Ct值為27.80±3.29，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統(tǒng)提取SARS-CoV-2核酸時(shí)，增加PK預(yù)處理步驟對(duì)糞便標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果沒有影響。見圖2。

注：A為鼻咽拭子SARS-CoV-2標(biāo)本ORF基因Ct值分散情況；B為鼻咽拭子SARS-CoV-2標(biāo)本N基因Ct值分散情況；C為同一鼻咽拭子標(biāo)本經(jīng)兩組平行實(shí)驗(yàn)后PCR擴(kuò)增曲線圖。

注：A為糞便SARS-CoV-2標(biāo)本 ORF基因Ct值分散情況；B為糞便SARS-CoV-2標(biāo)本N基因Ct值分散情況；C為同一糞便標(biāo)本經(jīng)兩組平行實(shí)驗(yàn)后PCR擴(kuò)增曲線圖。

3 討 論

SARS-CoV-2侵入人體宿主細(xì)胞是由細(xì)胞膜上血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2受體所介導(dǎo)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2受體廣泛存在于呼吸道、口腔、回結(jié)腸等部位的上皮細(xì)胞中。呼吸道標(biāo)本、消化道標(biāo)本、血液標(biāo)本均可作為實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)的標(biāo)本來源。由于COVID-19患者上呼吸道癥狀較弱，理論上下呼吸道標(biāo)本(深部咳痰和氣道抽取物)應(yīng)作為核酸檢測(cè)首選，但因多數(shù)患者咳痰困難，下呼吸道標(biāo)本不易獲得且存在較大的生物安全操作風(fēng)險(xiǎn)，故臨床病原體標(biāo)本主要以較易獲得的鼻拭子或口咽拭子標(biāo)本為主。因SARS-CoV-2可在人腸道上皮細(xì)胞進(jìn)行感染復(fù)制，且有研究提出糞便中SARS-CoV-2核酸檢出持續(xù)時(shí)間更長[5]。因此，糞便標(biāo)本中病毒核酸檢出率對(duì)于患者是否達(dá)到出院標(biāo)準(zhǔn)及是否存在傳染性的判斷具有重要意義。目前糞便也是主要的檢測(cè)標(biāo)本之一。因qPCR具有快速、簡便、特異度高、靈敏度高、成本較低的特點(diǎn)，已成為SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的主要檢測(cè)技術(shù)。目前，國內(nèi)有上百家企業(yè)研發(fā)了SARS-CoV-2 qPCR檢測(cè)試劑盒，其中有9個(gè)已經(jīng)獲得了國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)。在符合國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)程序的臨床試驗(yàn)中，所有試劑盒與確診病例標(biāo)本的靈敏度均超過90%。然而，在實(shí)際的臨床檢測(cè)中，患者的陽性檢出率并不高，陽性檢出率僅為30%～50%[6-8]。影響核酸陽性檢出率的因素較多，其中核酸提取效率是主要因素之一。

雖然，影響核酸提取效率的因素較多，但可以從多方面進(jìn)行改進(jìn)，從而提高核酸陽性檢出率。標(biāo)本提取前預(yù)處理是臨床上提高核酸提取效率的常用方法，其中，利用PK進(jìn)行預(yù)處理最為常見。而關(guān)于PK預(yù)處理是否可以提高核酸提取效率，國內(nèi)外所做研究報(bào)道較多，但結(jié)論并不一致。如在KHELAIFIA等[9]對(duì)糞便標(biāo)本中細(xì)菌DNA的提取一文中指出PK的預(yù)處理可提高DNA獲得率，JIKUZONO等[10]指出PK預(yù)處理可提高用液基細(xì)胞溶液固定的甲狀腺細(xì)胞的RNA回收率，但GOLDSCHMIDT等[11]則在對(duì)感染性病原體DNA提取的預(yù)處理一文中提出，在某些病原體的提取中，PK的預(yù)處理沒有必要。而造成這些結(jié)論不一的原因可能有如下幾點(diǎn)：(1)可能是PK性能存在一定差異；(2)可能是寄生蟲、細(xì)菌、病毒等不同病原體(尤其是RNA病毒)對(duì)PK的預(yù)處理效果存在差異；(3)不同的標(biāo)本類型及提取方法可能影響PK的預(yù)處理效果等。

在本研究的兩組平行實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)PK預(yù)處理的50份含有細(xì)胞保存液的鼻咽拭子標(biāo)本的核酸檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且在此次研究的20份糞便標(biāo)本中，其結(jié)果與鼻咽拭子標(biāo)本一致，PK的預(yù)處理在兩組平行實(shí)驗(yàn)中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。JEDDI等[12]關(guān)于利用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統(tǒng)對(duì)寄生蟲病和真菌病DNA提取優(yōu)化的分子診斷研究中，提出利用NucliSENS easyMAG系統(tǒng)進(jìn)行核酸提取時(shí)，由于NucliSENS easyMAG磁珠提取系統(tǒng)中裂解緩沖液具有高解離活性，使PK消化在大多數(shù)情況下是可有可無的，與本研究結(jié)果相符。但有研究表明在對(duì)甲型流感病毒、中東呼吸綜合征冠狀病毒的痰液標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理的研究中，其研究結(jié)果均顯示PK的預(yù)處理較其他預(yù)處理方法有較高的提取效率[13-14]。而導(dǎo)致這種結(jié)果差異的主要原因可能跟實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的類型不同有關(guān)。由于痰液標(biāo)本中黏液絲的影響，標(biāo)本可能不易裂解釋放病原體，在操作過程中易導(dǎo)致取樣不均，以及在進(jìn)行磁珠提取時(shí)易堵塞槍頭而無法進(jìn)行自動(dòng)提取進(jìn)而造成結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，在痰液標(biāo)本中加入PK進(jìn)行預(yù)處理尤為重要，可以提高RNA的提取效率。而在本研究中，大多數(shù)標(biāo)本為含有保存液的鼻咽拭子標(biāo)本，由于細(xì)胞保存液中緩沖劑的存在，能最大限度地保持細(xì)胞的完整性，并使之充分懸浮及分散，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統(tǒng)提取病原體時(shí)很容易釋放核酸。因此，對(duì)鼻咽拭子標(biāo)本進(jìn)行PK預(yù)處理可能并不能提高其提取效率。而對(duì)于糞便標(biāo)本，因本研究中糞便標(biāo)本僅20份，其PK預(yù)處理的結(jié)論仍需大量標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。

目前對(duì)SARS-CoV-2檢測(cè)方法的相關(guān)研究較少，其中僅有一篇文獻(xiàn)[15]提到了PK預(yù)處理在“一步法”中的研究。而在實(shí)際情況下，因“一步法”檢測(cè)陽性率較低，其僅用于提取試劑缺乏或一些緊急檢測(cè)，在常規(guī)的SARS-CoV-2臨床標(biāo)本檢測(cè)和篩查中，該方法已被禁止采用。而本研究則討論P(yáng)K預(yù)處理后，采用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統(tǒng)對(duì)核酸提取效率的影響，具有一定的創(chuàng)新性。

本研究存在一定局限。首先，樣本量有限，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)論。本研究評(píng)估了鼻咽拭子標(biāo)本和糞便標(biāo)本，未對(duì)具有較高檢出率的痰液標(biāo)本進(jìn)行研究，主要由于COVID-19患者上呼吸道癥狀較弱，痰液標(biāo)本不易獲得，且由于痰液標(biāo)本中黏液絲的影響，可能導(dǎo)致研究過程中取樣不均，從而影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，PK預(yù)處理在不同提取方法中的影響也應(yīng)考慮。

綜上所述，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統(tǒng)對(duì)含有細(xì)胞保存液的SARS-CoV-2鼻咽拭子標(biāo)本和糞便標(biāo)本進(jìn)行核酸提取時(shí)，對(duì)加PK和不加PK預(yù)處理的兩組平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較，PK的預(yù)處理對(duì)SARS-CoV-2的檢測(cè)結(jié)果沒有影響。因此，在使用NucliSENS easyMAG磁珠提取系統(tǒng)對(duì)SARS-CoV-2標(biāo)本進(jìn)行提取時(shí)，由于裂解緩沖液的高解離活性，可無需進(jìn)行PK預(yù)處理，在一定程度上節(jié)省了時(shí)間和耗材。