泛基因組研究在遺傳多樣性和功能基因組學(xué)中的應(yīng)用

向坤莉 賀文闖 鄒益 彭丹 張曉妮 廖雪竹 王杰 楊健康 武志強

摘 要：相對于單個參考基因組僅聚焦于個體遺傳信息的挖掘，泛基因組研究則能夠反映整個物種或類群全部的遺傳信息。隨著基因組測序和分析技術(shù)的不斷發(fā)展，泛基因組學(xué)逐漸成為新的研究熱點，并已在植物、動物和微生物多個物種中獲得了廣泛應(yīng)用，為全面解析物種或類群水平的遺傳變異和多樣性、功能基因組和系統(tǒng)進化重建等研究提供了強有力的工具，取得了很多顯著的研究成果。盡管如此，由于泛基因組學(xué)研究尚處于發(fā)展階段，測序費用和分析成本仍然較高，難以廣泛普及;且存在分析標(biāo)準(zhǔn)不一、數(shù)據(jù)挖掘不夠全面深入、理論難以應(yīng)用于生產(chǎn)實際等尚待解決的問題，仍有較大的發(fā)展空間。該文系統(tǒng)總結(jié)了泛基因組在生物遺傳多樣性挖掘和功能基因組學(xué)中的研究進展，主要包括其在泛基因組圖譜的構(gòu)建、基因組變異和有利基因的發(fā)掘、功能基因的多態(tài)性、群體遺傳多樣性和系統(tǒng)進化等多個領(lǐng)域中的應(yīng)用和研究，探討了其在不同領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。同時，討論了目前泛基因組研究中存在的局限性和可能的解決方法，并對其將來的發(fā)展前景進行了展望。

關(guān)鍵詞：泛基因組，結(jié)構(gòu)變異，功能基因，遺傳多樣性，系統(tǒng)進化

中圖分類號：Q943.2

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3142（2021）10-1674-09

Abstract：The pan-genome can represent all of the genetic diversities in a species or population，which is a limitation for obtaining only one single reference genome. The pan-genomics is becoming a new hot research area and being widely applicated in researches of many species in plants，animals and microorganisms，as the development of the whole genome sequencing and analysis technology. It provides powerful tools for resolving the genetic variation and polymorphism at levels of species or taxa，researches of functional genomics and reconstruction of phylogenetics，obtaining abundant of significant research achievements. However，present researches on pan-genomics still need to improve due to several problems，e.g.，extensive cost of whole genome sequencing and data analysis，inconsistent analysis standards，lack of deeper and comprehensive explanation of the obtained data，and difficulty of application of the research achievements. We summarized the research progresses of pan-genomes on exploitation of genetic diversity and functional genomics，including construction of a pan-genome map，identification of genome variations and favorable genes，polymorphism of functional genes，population genetic diversity and systematic evolution，and discussed its potential in application of different research fields. Furthermore，we discussed the limitations existed in the present studies and possible solutions，and presented the prospect in the future on pan-genomics.

Key words：pan-genome，structural variants，functional gene，genetic diversity，systematic evolution

遺傳變異是生物進化的內(nèi)在源泉，因而，研究遺傳多樣性及其演化規(guī)律是生物遺傳學(xué)及進化生物學(xué)研究中的核心問題之一。而泛基因組研究則是近年來隨著測序成本的急劇降低和分析技術(shù)的快速發(fā)展而全面反映物種遺傳變異的一種新興工具。泛基因組研究能夠從物種或類群水平廣泛發(fā)掘和利用遺傳變異多樣性，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)學(xué)中的一個前沿領(lǐng)域。其中，泛基因組（pan-genome）指一個物種或者類群的全部基因組信息的集合，包括核心基因組（core genome）和非必須基因組（dispensable genome）兩部分。核心基因指在所有個體中都存在的基因/組分集合;而非必須基因組是指在部分個體或單個個體中存在的基因/組分集合，有時也稱為可變基因組（variable genome） （圖1; Tettelin et al.，2005; Medini et al.，2005）。核心基因組由所有樣本中都存在的序列組成，往往與重要的生物學(xué)功能和表型特征相關(guān)，多數(shù)是一些管家基因（house-keeping genes），反映了物種的穩(wěn)定性;可變基因組由僅在部分樣本中存在的序列組成，一般與物種對特定環(huán)境的適應(yīng)性或特有的生物學(xué)特征相關(guān)，反映了物種的多樣性和特異性（Montenegro et al.，2017; Gordon et al.，2017; Wang et al.，2018; Zhao et al.，2018; Liu et al.，2020）。

當(dāng)前，泛基因組研究已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多個植物、動物和微生物物種中，為全面解析物種或類群水平的遺傳變異、功能基因研究和系統(tǒng)進化重建等研究提供了強有力的工具，取得了很多顯著的研究成果（付靜和秦啟偉，2012; 王婭麗等，2019; Tian et al.，2019; Chen et al.，2020; Domínguez et al.，2020; Weissensteiner et al.，2020; Liu et al.，2020）。然而，現(xiàn)有的泛基因組學(xué)研究主要聚焦于不同個體基因組序列和基因結(jié)構(gòu)的變異（Montenegro et al.，2017; Zhao et al.，2018; Gao et al.，2019; Liu et al.，2020），但對這些變異如何介導(dǎo)基因結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終影響生物表型，以及這種遺傳差異如何與環(huán)境因子互作，都未能進行深入探討。本文綜述了泛基因組學(xué)在不同物種中的研究進展，對其在群體基因組變異、功能基因的鑒定和發(fā)掘、群體遺傳多樣性和系統(tǒng)進化等多個領(lǐng)域中的應(yīng)用與研究進行了系統(tǒng)性總結(jié)，并對其應(yīng)用前景和局限性進行了探討。

1 泛基因組圖譜的構(gòu)建

最早在2005年，Tettelin et al.（2005）在對幾種鏈球菌屬細(xì)菌（GBS，group B Streptococcus）的遺傳多樣性研究中提出微生物的泛基因組概念，指出核心基因組是在所有菌株中都存在的基因;非必須基因組（可變基因組）是僅在部分菌株中存在的基因。其中GBS菌共有的核心基因組占80%，剩余20%的基因組信息為非必須基因組。隨后，2010年Li et al. （2010）通過對多個人類個體基因組進行組裝和比較基因組學(xué)分析，提出了“人類泛基因組”的概念，也就是人類群體基因組信息的總和，并從中鑒定獲得新發(fā)現(xiàn)的序列達到19～40 Mb。而隨著千人基因組計劃的提出和實施，泛基因組在人類疾病方面的研究取得了許多重大突破，為精準(zhǔn)醫(yī)療計劃提供了可能（1 000 Genomes Project Consortium，2012）。

之后，隨著越來越多的物種完成了高質(zhì)量基因組參考序列的組裝，多個動植物物種中相繼報道了泛基因組圖譜的構(gòu)建相關(guān)研究工作。例如，通過對全球12個種豬品種的基因組進行高質(zhì)量組裝，構(gòu)建了豬的泛基因組圖譜，發(fā)現(xiàn)中國的豬品種有大約9 Mb的泛序列（pan-sequences）與歐洲的豬品種存在差異，其中包括脂肪細(xì)胞脂解的必要調(diào)節(jié)因子TIG3 （Tazarotene-induced gene 3）（Tian et al.，2019）;對19個小麥品種的泛基因組分析發(fā)現(xiàn)，平均每個樣本中含有128 656個基因，核心基因有89 795個（Montenegro et al.，2017）;利用725個番茄品種的基因組信息構(gòu)建的番茄泛基因組圖譜中，整個番茄泛基因組共包含40 396個基因，其中74.2%是核心基因（Gao et al.，2019）。此外，泛基因組在水稻（Schatz et al.，2014;Yao et al.，2015; Sun et al.，2017; Wang et al.，2018; Zhao et al.，2018; Zhou et al.，2020）、大豆（Li et al.，2014; Liu et al.，2020; 祝光濤和黃三文，2020）、玉米（Hufford et al.，2012; Hirsch et al.，2014; 簡銀巧等，2017）等重要的植物物種均獲得了廣泛應(yīng)用（表1）。因此，構(gòu)建整個物種的泛基因組圖譜已成為廣泛應(yīng)用的基因組學(xué)方法，不僅能夠發(fā)現(xiàn)全面的遺傳信息，而且能為從物種和群體水平進行功能基因組學(xué)、系統(tǒng)進化和其他生物學(xué)研究提供更強有力的工具。

2 泛基因組學(xué)研究中序列結(jié)構(gòu)變

異與功能基因發(fā)掘

同一物種內(nèi)一個或幾個參考基因組能夠反映的遺傳變異是非常有限的，而泛基因組研究能夠覆蓋物種或類群中的所有變異，為研究整個物種或類群水平上的基因組序列和結(jié)構(gòu)變異提供了可能?，F(xiàn)代生物基因庫中的遺傳變異通常包括單核苷酸多態(tài)性（SNPs，single-nucleotide polymorphisms）、插入缺失（Indels，insertions and deletions）和大的結(jié)構(gòu)變異（SVs，large structural variants）。其中SVs主要包括拷貝數(shù)變異（CNVs，copy number variants）、存在/缺失變異（PAVs，presence/absence variants）、移位（translocation events）和倒置（inversion events）等，而這些變異往往和一些關(guān)鍵的農(nóng)藝性狀相關(guān)（Springer et al.，2009; Hirsch et al.，2014; Li et al.，2014; Lu et al.，2015; Zhao et al.，2018）。

通過泛基因組分析全面發(fā)掘群體基因組中的序列和結(jié)構(gòu)變異，能夠鑒定其中與有利表型相關(guān)的變異位點，為發(fā)掘和研究新的功能基因提供了重要依據(jù)。例如，利用 66個水稻高質(zhì)量基因組構(gòu)建了水稻的泛基因組，從中共鑒定到16 563 789 個SNPs、5 549 290個Indels和933 489個SVs，分析了其中與開花時間相關(guān)的基因Hd3a （Heading date 3a）、抗寒性基因COLD1 （Chilling tolerance divergence 1）、谷物重量基因GW6a （Grain weight 6a）、分蘗角度基因TAC1 （Tiller Angle Control 1）、植株高度基因Sd1 （Semi dwarf 1）在不同材料間的遺傳變異，表明SNPs變異是導(dǎo)致這些基因變異的基礎(chǔ)（Zhao et al.，2018）。而利用29個高質(zhì)量基因組構(gòu)建的大豆泛基因組圖譜，共鑒定獲得14 604 953個SNPs、12 716 823個Indels和776 399個SV（包含723 862個PAVs、27 531個CNVs、21 886個移位和3 120個倒置），發(fā)現(xiàn)有些結(jié)構(gòu)變異在重要農(nóng)藝性狀調(diào)控中發(fā)揮重要作用，如PAV、基因融合和Indels分別對種皮亮度、種皮顏色的馴化、缺鐵失綠等性狀具有重要影響（Liu et al.，2020）。

同時，在不同層次上發(fā)現(xiàn)的多個序列和結(jié)構(gòu)變異，不僅提供了更加豐富的變異信息，也為研究基因功能變異提供了更多素材。例如，通過六倍體普通小麥物種基因組間和亞基因組間的共線性分析，提出其“4A-5A-7B染色體重排”是兩次染色體易位事件的結(jié)果，并明確了重排的基因組區(qū)間的精細(xì)邊界;并且在微觀尺度上探討了小麥春化基因Vrn2 （Vernalization2）的復(fù)雜進化歷史，發(fā)現(xiàn)Vrn2同源基因在普通小麥基因組中的復(fù)雜分布是包含串聯(lián)重復(fù)、多倍化、染色體易位和基因丟失在內(nèi)的一系列事件疊加的結(jié)果（Chen et al.，2020）。另有研究利用100個番茄基因組捕獲到238 490個SVs，構(gòu)建得到泛結(jié)構(gòu)變異（panSV）圖譜，研究表明SVs是許多轉(zhuǎn)座子的基礎(chǔ)，而且SVs集中區(qū)域的基因漸滲現(xiàn)象嚴(yán)重，且群體中90%的SVs變異可在泛基因組圖譜中獲得驗證（Alonge et al.，2020）。

3 泛基因組學(xué)研究中功能基因的

變異與多態(tài)性

遺傳結(jié)構(gòu)變異通常會導(dǎo)致基因功能的改變，泛基因組研究能夠通過全面整合相關(guān)基因的遺傳信息，揭示基因重組、融合等事件導(dǎo)致基因功能的獲得、丟失，以及發(fā)掘新基因。例如，大豆缺鐵萎黃病有關(guān)的候選基因被定位于14號染色體上，通過泛基因組研究發(fā)現(xiàn)該候選基因有兩種單倍型：品種“中黃13”所屬的單倍型主要分布在低緯度地區(qū);品種“威廉82”所屬的單倍型主要分布在高緯度地區(qū)，能夠在高pH值、鐵為不易吸收的難溶氧化物等環(huán)境中生存，這種單倍型啟動子區(qū)有1.4 kb 的Indel和外顯子區(qū)有5個變異位點（Liu et al.，2020）。在油菜中通過全PAV-GWAS （genome wide association study）分析發(fā)現(xiàn)3個開花抑制因子BnaA10.FLC、BnaA02.FLC和BnaC02.FLC的PAVs與油菜的開花時間和生態(tài)型分化密切相關(guān)，其中：冬油菜品種的BnaA10.FLC啟動子區(qū)都含有MITE （miniature inverted repeat transposable element）插入;85%春油菜品種的BnaA10.FLC第一個外顯子中含有LINE （long interspersed nuclear elements）插入;81%半冬性油菜品種的BnaA10.FLC啟動子區(qū)含有hAT插入。表明BnaA10.FLC決定了油菜生態(tài)類型，是控制油菜開花的關(guān)鍵基因（Song et al.，2020）。

生物的表型往往是來自多個基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，其中很多基因可能又同時對多個不同的表型性狀具有影響，因此對某個表型的有利基因亦有可能對另一個表型具有不利影響。例如，現(xiàn)代番茄中的產(chǎn)量相關(guān)性狀調(diào)控機制復(fù)雜，對100個番茄基因組的泛結(jié)構(gòu)變異（pan-SV）的研究發(fā)現(xiàn)，由四個結(jié)構(gòu)變異導(dǎo)致形成了三個MADS-Box基因，共同影響番茄的經(jīng)濟性狀。其中j2TE基因型具有便于收獲的無關(guān)節(jié)花梗表型，而ej2w基因型具有防止撞傷的大花萼表型，但兩個基因型同時存在（j2TE ej2w）則會出現(xiàn)花序分枝過多而導(dǎo)致低育性的現(xiàn)象;sb1（suppressor of branching 1）基因型能有效克服雙隱性基因型的負(fù)面作用，實現(xiàn)增產(chǎn);另外，sb1基因型的表達可能受1號染色體上STM3基因的串聯(lián)重復(fù)序列影響，且串聯(lián)重復(fù)的拷貝數(shù)具有劑量效應(yīng) （Alonge et al.，2020）。因此，通過在更廣泛的群體中研究基因功能變異對表型的影響，將有助于更加準(zhǔn)確地對功能基因-表型的關(guān)聯(lián)做出全面詳細(xì)地評估，從而更好地指導(dǎo)分子育種工作來培育出抗病性更強、產(chǎn)量更高、保質(zhì)期更長、風(fēng)味更好的作物品種，同時又不犧牲其他所期望的表型性狀。作物泛基因組學(xué)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量農(nóng)藝表型與特定基因的存在、缺失和變異之間的多樣化的相關(guān)性（Tao et al.，2019），通過在泛基因組完整遺傳圖譜的基礎(chǔ)上進行研究，將有利于徹底澄清其內(nèi)在關(guān)聯(lián)和相應(yīng)的機理。

4 泛基因組學(xué)研究在種群遺傳多樣性和系統(tǒng)進化研究中的應(yīng)用

對泛基因組學(xué)的研究，不僅可以全面地從基因組水平分析物種內(nèi)遺傳多樣性，探究個體間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和表型差異的遺傳基礎(chǔ)，而且可以從物種、亞種水平分析基因組的序列變異和系統(tǒng)進化特征，為研究物種的起源及演化等重要生物學(xué)問題提供依據(jù)。例如，通過水稻泛基因組對6個水稻群體中與馴化有關(guān)的7個基因位點開展進化分析，發(fā)現(xiàn)Aus群體（Indica的一個亞類群）并未全部聚在栽培稻進化分支上，從而提出Aus水稻群體處于不完全馴化選擇狀態(tài)（Zhao et al.，2018）。利用小麥泛基因組對19個小麥個體基因的PAVs進行了發(fā)掘并構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹，發(fā)現(xiàn)小麥品種‘中國春’位于進化樹的基部，為小麥不同類型種質(zhì)的系統(tǒng)進化關(guān)系和研究利用提供了理論依據(jù)（Montenegro et al.，2017）。對32只烏鴉群體的泛基因組研究，將鴉屬（Corvus）分為Jackdaw和Crow兩大支系，并在此基礎(chǔ)上探討了不同進化分支上烏鴉的基因組結(jié)構(gòu)變異和功能性狀，尤其是發(fā)現(xiàn)烏鴉羽毛圖案差異大，但遺傳差異不大，主要受NDP 基因上游20 kb處一個大小為2.25 kb的LTR （long terminal repeats）逆轉(zhuǎn)座子插入調(diào)控 （Weissensteiner et al.，2020）。

泛基因組研究還可運用于對不同生態(tài)地理類型中差異較大的種質(zhì)資源進行基因組測序，挖掘物種中新的基因，為候選基因的補充、物種多樣性及適應(yīng)性進化、起源經(jīng)歷和外來物種入侵性等問題的研究提供重要信息。例如，大豆群體的生物地理分析發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代栽培大豆起源于中國的華北地區(qū)（Liu et al.，2020），而水稻群體的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)現(xiàn)代栽培稻起源地應(yīng)該包括中國華南地區(qū)（Huang et al.，2012）。此外，由于一些作物的基因庫中包括多個物種，特別是具有不同遺傳結(jié)構(gòu)的野生近緣物種，需要構(gòu)建含該作物所有品種及其近緣種的遺傳圖譜以進行更廣泛的研究，因此也有學(xué)者提出了超-泛基因組（super-pan-genome）的概念，以探討更大范圍種質(zhì)群體的遺傳基礎(chǔ)及其多樣性（Khan et al.，2020）。

5 泛基因組學(xué)研究的發(fā)展前景

真核生物的全部基因組信息包括核基因組、線粒體基因組和質(zhì)體基因組。目前的泛基因組學(xué)研究大多關(guān)注的是核基因組，而線粒體和質(zhì)體這兩種細(xì)胞器的泛基因組研究也逐漸開始被重視。例如，研究者利用PCAWG （The Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes） 數(shù)據(jù)庫中2 658個癌癥樣本及其匹配的正常組織樣本的全基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建了人類線粒體基因組最全面的突變藍圖，并確定了多個高度突變類型，其中截斷突變（truncated mutations）在腎臟癌癥、結(jié)直腸癌和甲狀腺癌中明顯富集，提示了激活特殊的信號通路或會帶來致癌影響（Yuan et al.，2020）。此外，有研究者利用321個辣椒的葉綠體基因組，構(gòu)建了辣椒5個栽培種及2個變種的葉綠體泛基因組，其不但用系統(tǒng)發(fā)育信號分析揭示了辣椒屬不同種間親緣關(guān)系的遠近，也對7個葉綠體泛基因組的CDS （coding sequence）、內(nèi)含子和基因間隔區(qū)的遺傳多樣性進行了詳盡分析，確定了rpl23和trnI的基因間隔區(qū)包含44 bp串聯(lián)重復(fù)以及其他插入缺失和單核苷酸等豐富的變異（Elmosallamy et al.，2019）。

在某些物種中，由于其基因組較大和可移動元件的比例較高等原因，使得泛基因組研究難以有效開展，因此，關(guān)注全部RNA信息的泛轉(zhuǎn)錄組（pan-transcriptome）研究開始逐漸興起。許多重要作物，如玉米（Hansey et al.，2012; Hirsch et al.，2014; 簡銀巧等，2017）和大麥（Ma et al.，2019），以及模式生物擬南芥（Gan et al.，2011）等的泛轉(zhuǎn)錄組研究均已有報道。

隨著多種測序技術(shù)的結(jié)合和分析策略的發(fā)展，泛基因組學(xué)相關(guān)研究呈現(xiàn)爆發(fā)式增長，但是大多數(shù)研究的深入程度不一，許多數(shù)據(jù)結(jié)果仍有進一步深入挖掘的空間。尤其是構(gòu)建完整的基因圖譜后，很多研究止步于對某幾個基因的結(jié)構(gòu)變異進行鑒定，未進一步開展系統(tǒng)的功能研究，更不用說應(yīng)用于生產(chǎn)實踐。此外，隨著大量生物信息學(xué)數(shù)據(jù)的積累，單個團隊面對浩大的數(shù)據(jù)庫也只能選擇部分?jǐn)?shù)據(jù)結(jié)果進行深入研究，難以充分利用現(xiàn)有的數(shù)據(jù)。例如，人類基因組計劃從開始啟動到現(xiàn)在已經(jīng)過去30年，仍需大量的人力投入和研究分析去解決更多的問題。因而，完善的數(shù)據(jù)共享機制和良好平臺是泛基因組學(xué)研究良性發(fā)展和應(yīng)用的一個重要條件。目前，我國已建立了國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心（NGDC，National Genomics Data Center），某些重要農(nóng)作物或農(nóng)業(yè)動物物種的泛基因組數(shù)據(jù)也建立了數(shù)據(jù)分享平臺，如豬的泛基因組數(shù)據(jù)庫PIGPAN （http：//animal.nwsuaf.edu.cn/code/index.php/pan-Pig）、大白菜基因組數(shù)據(jù)庫BRAD （the Brassica database，http：//brassicadb.cn）和油菜泛基因組資源數(shù)據(jù)庫（http：//cbi.hzau.edu.cn/bnapus/）等。

一方面，進一步整合更廣泛的多層次群體基因組數(shù)據(jù)，如不同世代之間的泛基因組研究、整合多個物種的超-泛基因組研究等，可能是值得進一步探索的新方向（圖2）。另一方面，隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，尤其是單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展和測序成本的進一步降低，單細(xì)胞分辨率的轉(zhuǎn)錄組圖譜已經(jīng)逐步開始在水稻和玉米的根發(fā)育研究中獲得應(yīng)用（Satterlee et al.，2020; Liu et al.，2021）。因此，同一個體不同組織器官的泛基因組或泛轉(zhuǎn)錄基因組研究，乃至不同細(xì)胞之間的泛基因組或泛轉(zhuǎn)錄基因組研究也可能成為新的發(fā)展方向（圖2）。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）