紙基微流控器件法檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的研究

孫來玉, 錢 坤, 趙明星, 肖 莉

(湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000)

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)不僅是肝臟疾病敏感可靠的指標(biāo)，還對全身性疾病，特別是肥胖、代謝綜合征和心血管疾病有較高的預(yù)測價(jià)值[1-2].常規(guī)體檢、乙肝病毒攜帶者的ALT醫(yī)學(xué)跟蹤、獻(xiàn)血者ALT的篩檢、藥物性肝損傷診斷都離不開對ALT的快速準(zhǔn)確檢測，尤其在基層醫(yī)院和欠發(fā)達(dá)地區(qū)更需要準(zhǔn)確便捷的ALT檢測方法.國內(nèi)外報(bào)道檢測ALT的方法頗多，主要有干式法、賴氏法、微孔板速率法和全自動(dòng)生化速率法[3-6].干式法的試紙條不僅可以測定血清，還可以對血漿和全血標(biāo)本進(jìn)行測定，排除溶血和脂肪血對結(jié)果的干擾性能較高，但干氏法的臨界值較高，一般為40 U/L，只能作定性或半定量檢測.賴氏法成本低，操作簡便，不需要特殊試劑和儀器，在臨床上應(yīng)用廣泛，但缺點(diǎn)是耗時(shí)長、準(zhǔn)確性差、有化學(xué)試劑污染等.微孔板速率法具有試劑用量小、能用酶標(biāo)儀比色、操作簡單、檢測速度快的優(yōu)點(diǎn)，其缺點(diǎn)是操作誤差較大、酶的底物濃度消耗較快、線性范圍窄.全自動(dòng)生化速率法準(zhǔn)確、快速，能成批檢測，是目前臨床生化檢測常用的方法，其缺點(diǎn)是單個(gè)樣本檢測速度不快、操作較復(fù)雜、儀器體積較大、價(jià)格昂貴和有化學(xué)試劑污染等.近年來，以微陣列和微流控等為代表的高通量、微型化分析技術(shù)發(fā)展迅猛，是檢測生物大分子和化學(xué)小分子的有力工具[8-11].紙基微流控器件(paper-based microfluidic analytical devices，μPADs)是一種最簡單的芯片實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，具有成本低、加工簡易、使用和攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)，在臨床診斷、食品營養(yǎng)與安全和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用前景.

本文利用丙氨酸在ALT作用下轉(zhuǎn)化為丙酮酸，經(jīng)丙酮酸氧化酶催化產(chǎn)生過氧化氫，借助辣根過氧化酶催化Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，建立紙基微流控器件，通過發(fā)光強(qiáng)度檢測待測品中ALT的活性含量.該器件自動(dòng)化程度高、檢測快速、靈敏度高、攜帶方便、樣品用量少，適用于大規(guī)模樣品的檢測.

1 材料與方法

1.1 材料

硝酸纖維素膜(NC,Whatman)、層析紙(Whatman)、辣根過氧化酶(HRP,CanAg Co.,Ltd)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT,Sigma)、化學(xué)發(fā)光AB檢測液(Luminol-H2O2,Pierce)、丙氨酸(Sigma)、丙酮酸氧化酶(上海源葉生物公司)、血紅蛋白(Sigma Aldrich)、丙酮酸(國藥集團(tuán))、抗壞血酸(國藥集團(tuán))、葡萄糖(國藥集團(tuán))、尿素(國藥集團(tuán))、肌酐(國藥集團(tuán))、芯片閱讀儀(HK-2001A,上海數(shù)康生物科技有限公司)、打印機(jī)(Xerox 8560DN).

1.2 方法

1.2.1紙基微流控器件的制作

紙基微流控器件的制作如圖1所示.1號膜和5號膜為透明壓膜，1號膜有一直徑3 mm的加樣孔；2號膜為NC膜(孔徑為0.22 μm，用于過濾樣品)；3號膜為Whatman層析紙，上面印有4個(gè)小圓圈，圈外涂蠟，圈內(nèi)加3 μL 0.5 mol/L丙氨酸溶液,陰干,再依次滴加3 μL 10 mmol/L魯米諾、50 U/mL丙酮酸氧化酶溶液；4號膜印有與3號膜一樣的小圓圈，圈內(nèi)滴加3 μL 0.1 mg/mL辣根過氧化酶，陰干.將1、2、3、4和5號膜按圖1裝配并壓膜，備用.

1.2.2 檢出限與定量限

用人工血漿緩沖液將ALT溶液逐級稀釋，加入30 μL稀釋液至器件加樣孔中使反應(yīng)的S/N(信噪比)為3和10，以考查器件ALT的檢出限和定量限.

1.2.3 線性范圍

分別將含0、5、10、20、40、80、160、320 U/L ALT的樣品30 μL加入到器件加樣孔中反應(yīng),考查ALT濃度-光信號之間關(guān)系.

1.2.4 回收試驗(yàn)

用人工血漿緩沖液稀釋制備20、40、60 U/L ALT 3個(gè)不同濃度的試樣，各測定6次，統(tǒng)計(jì)回收率.

1.2.5 精密度測試

抽取3批紙基器件讀取8個(gè)微陣列信號，以40 U/L ALT為質(zhì)控品，考查器件批內(nèi)和批間的信號精密度.

1.2.6 干擾性試驗(yàn)

用人工血漿緩沖液系列稀釋配制血紅蛋白、丙酮酸、抗壞血酸、葡萄糖、尿素和肌酐溶液作為待測品，考查這6種物質(zhì)對檢測結(jié)果的影響.使ALT的終濃度為40 U/L，血紅蛋白的濃度梯度為0、5、10、20、50、100、250、500 mg/dL；丙酮酸的濃度梯度為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L；抗壞血酸的濃度梯度為0、0.5、1、2、4、6、8、10 mg/dL；葡萄糖的濃度梯度為0、50、100、200、400、600、800、1 000 mg/dL；尿素濃度梯度為0、5、10、20、40、60、80、100 mg/dL；肌酐的濃度梯度為0、0.5、1、2、5、10、15、20 mg/dL.取30 μL待測品加入到紙基器件上檢測，比較光子信號的變化趨勢.

1.2.7 器件穩(wěn)定性試驗(yàn)

將相同批次的30塊器件分成兩組，以40 U/L ALT為質(zhì)控品考查器件的貯存穩(wěn)定性.第一組15塊器件貯存于37 ℃藥品穩(wěn)定試驗(yàn)箱中，每天檢測1次器件的信號值；第二組15塊器件貯存于2～8 ℃冰箱中，每30天檢測1次器件的信號值.

2 結(jié)果與分析

2.1 檢出限與定量限

S/N分別為3和10時(shí)，ALT檢測的檢出限和定量限分別為2 U/L、6 U/L.

2.2 線性范圍

ALT濃度-光子信號關(guān)系如圖2所示，ALT的活性濃度與光子信號的關(guān)系呈正相關(guān)，在5～ 80 U/L濃度范圍內(nèi)呈線性,其擬合方程為：

Y=-0.002 5X3+0.234 5X2+22.448X+17.463，R2=0.999 3.

2.3 回收試驗(yàn)

回收試驗(yàn)結(jié)果見表1，回收率在94.0%～102.4%范圍內(nèi).

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 The results of recovery test

表1(續(xù))

2.4 精密度

精密度檢測結(jié)果見表2.表2中3批器件批內(nèi)和批間的CV值均小于5.0%，批間CV值大于批內(nèi)CV值.

表2 紙基器件信號的精密度Tab.2 Signal precision of paper-based devices

2.5 干擾性試驗(yàn)

干擾性試驗(yàn)結(jié)果見圖3至圖8.由圖3和圖4可知，血紅蛋白、丙酮酸使檢測結(jié)果偏大；由圖5可知，抗壞血酸使檢測結(jié)果偏?。挥蓤D6至圖8可知，葡萄糖、尿素和肌酐對檢測結(jié)果無明顯影響.

2.6 器件穩(wěn)定性試驗(yàn)

器件的存儲(chǔ)條件、時(shí)間與器件的信號關(guān)系見圖9.在37 ℃藥品穩(wěn)定試驗(yàn)箱中，器件上的分子容易失去分子識(shí)別活性；貯存于2～8 ℃冰箱中，器件上的分子在12個(gè)月內(nèi)基本保持分子識(shí)別活性.

3 討 論

3.1 質(zhì)控品濃度的選取

ALT主要存在于各種細(xì)胞中，尤以肝細(xì)胞內(nèi)最多.正常時(shí)，只將少量ALT釋放入血中，血清中其酶的活性即可明顯升高.在各種病毒性肝炎的急性期、藥物中毒性肝細(xì)胞壞死時(shí)，ALT大量釋放入血中，因此它是診斷病毒性肝炎、中毒性肝炎的重要指標(biāo).臨床上ALT的正常參考值為0～40 U/L，因此將待測品檢測信號與40 U/L質(zhì)控品進(jìn)行比對有直接參考意義.此外，由ALT的濃度-光子信號關(guān)系可知，樣品中ALT的濃度為40 U/L時(shí)，光子信號大小適中，并處于線性范圍的中段，這有利于考查器件的性能，因此本文選擇40 U/L ALT作為質(zhì)控品.

3.2 檢測條件

在檢測過程中加入30 μL樣品于器件加樣孔中，該加樣體積是預(yù)實(shí)驗(yàn)得出的條件，如加樣體積少于20 μL，則不能充分潤濕反應(yīng)區(qū)域，且會(huì)使檢測結(jié)果產(chǎn)生較大偏差甚至錯(cuò)誤；如加樣體積多于60 μL，則會(huì)產(chǎn)生液體溢出加樣孔的情況.因此選用30 μL的加樣體積較合適.預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，溫度為37～40 ℃時(shí)，反應(yīng)較迅速，當(dāng)加樣陣列較多時(shí)，則加樣時(shí)間較長，這使器件上的試劑損耗較多，不利于芯片閱讀；反應(yīng)溫度低于15 ℃，則酶促反應(yīng)速度較慢，也不利于芯片閱讀.因此選擇室溫反應(yīng)60 s.在芯片閱讀儀中閱讀積分60 s等時(shí)間參數(shù)是與反應(yīng)溫度相關(guān)聯(lián)的.

3.3 干擾試驗(yàn)

血液中代謝物質(zhì)有很多種，這些物質(zhì)的異常升高或積累有可能對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，如丙酮酸是器件中丙酮酸氧化酶的底物，如血清中含有較多的丙酮酸，則會(huì)產(chǎn)生結(jié)果偏大的情況.因?yàn)槿巳旱膹?fù)雜性，血液中化學(xué)成分差異較大，本研究只考察了血紅蛋白、丙酮酸、抗壞血酸、葡萄糖、尿素和肌酐6種物質(zhì)對實(shí)驗(yàn)的影響，其他諸如膽紅素、膽固醇等潛在干擾物質(zhì)的干擾情況需要進(jìn)一步研究.

4 結(jié) 論

利用丙氨酸在ALT作用下轉(zhuǎn)化為丙酮酸，經(jīng)丙酮酸氧化酶催化產(chǎn)生過氧化氫，借助HRP催化Luminol-H2O2化學(xué)發(fā)光反應(yīng) ，建立紙基微流控器件，通過發(fā)光強(qiáng)度檢測待測品中ALT的活性含量,并通過一系列實(shí)驗(yàn)考查了器件的檢測限、線性范圍、回收率、信號精密度、潛在干擾物質(zhì)和儲(chǔ)存穩(wěn)定性.結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以40 U/L ALT為質(zhì)控品、加樣體積為30 mL、室溫反應(yīng)60 s、在芯片閱讀儀中閱讀積分60 s，器件信號檢測較穩(wěn)定；器件貯存于2～8 ℃冰箱中，光子信號在12個(gè)月內(nèi)基本穩(wěn)定.因此，采用該方法檢測血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶快速、簡單、準(zhǔn)確.本文的不足之處是只研究了血紅蛋白、丙酮酸、抗壞血酸、葡萄糖、尿素和肌酐等6種物質(zhì)對該器件檢測結(jié)果的影響，由于人群個(gè)體的復(fù)雜性，血液中化學(xué)成分差異較大，諸如膽紅素、膽固醇等潛在干擾物質(zhì)對器件檢測的影響需要進(jìn)一步研究.