添加褪黑素對(duì)湖羊精液冷凍保存效果的影響

郭良勇，周俊波，曹 訪，吳建良，趙永祥，彭彩娥，潘異哲

(1.湖州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 湖州 313000； 2.湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 湖羊研究所，浙江 湖州 313000；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)所，浙江 杭州 310021； 4.湖州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江 湖州 313000)

褪黑素(melatonin，MLT)是一種由松果腺合成和分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素.有關(guān)研究證明，褪黑素和代謝衍生物可調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性，減少對(duì)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA抗氧化的損傷[1].褪黑素可以提高精子頂體、質(zhì)膜和DNA完整性，降低膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用，調(diào)節(jié)精子獲能過(guò)程[2].目前，褪黑素在關(guān)于動(dòng)物精液冷凍保存領(lǐng)域已開展相關(guān)研究.霍敏等[3]證實(shí)在絨山羊精液冷凍稀釋液中添加0.5 mg/mL褪黑素能顯著提高絨山羊精子的抗氧化能力和冷凍保存效果.楊寶衛(wèi)等[4]發(fā)現(xiàn)10 mmol/L褪黑素可以有效改善冷凍后豬精子的畸形率和頂體完整率.李曉霞等[1]在牛精液稀釋液中添加10-3mmol/L褪黑素可明顯改善牛精液品質(zhì)，提高牛精液的保存時(shí)間和保存質(zhì)量.這些研究都證實(shí)褪黑素對(duì)動(dòng)物精液保存質(zhì)量具有一定的促進(jìn)作用.

湖羊是我國(guó)國(guó)家級(jí)畜禽資源保護(hù)的綿羊品種，主要養(yǎng)殖于太湖流域，具有獨(dú)特的波浪形羔皮、一胎多羔、生長(zhǎng)速度快等優(yōu)良性[5].目前關(guān)于褪黑素在湖羊精液低溫保存中的應(yīng)用少見報(bào)道.本研究通過(guò)比較不同濃度褪黑素對(duì)湖羊精液冷凍解凍后的精子活力、頂體完整率，以及精漿中谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量的影響，篩選出褪黑素最適合的添加濃度，為湖羊精液冷凍保存技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)精液

選擇湖州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院湖羊試驗(yàn)場(chǎng)5只健康、繁殖性能良好的湖羊種公羊，年齡為2～3周歲，采用假陰道法采集鮮精.將收集到的精液置于37 ℃水浴中保存，1 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行活力檢測(cè)，選擇精子活力0.8以上的精液用于冷凍保存.

1.2 藥品與試劑

褪黑素、果糖、三羥甲基氨基甲烷、檸檬酸、甘油購(gòu)自Sigma公司；丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；新鮮雞蛋購(gòu)自超市，用于取得卵黃.

1.3 試驗(yàn)儀器

冰箱(型號(hào)為BCD-320WTPMA)，美的公司生產(chǎn)；水浴鍋(型號(hào)為DK-S28)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；電子天平(型號(hào)為JD2000-3)，沈陽(yáng)天平儀器廠生產(chǎn)；熒光顯微鏡(型號(hào)為BA210 Digital)，麥克奧迪集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；紫外分光光度計(jì)(型號(hào)為BioSpectrometer)，艾本德中國(guó)有限公司生產(chǎn).

1.4 基礎(chǔ)冷凍稀釋液配置

基礎(chǔ)冷凍稀釋液的配制參照配方[6]：果糖5 g/L、三羥甲基氨基甲烷30.63 g/L、檸檬酸19.9 g/L，添加20%蛋黃、5%甘油.

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分組

將新鮮精液在室溫中靜置30 min，然后以基礎(chǔ)冷凍稀釋液分2步等比例稀釋至4倍，加入褪黑素，按褪黑素的不同終濃度(10、20、30 mg/mL)設(shè)為試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組，以不添加褪黑素為對(duì)照組.

1.6 精液冷凍與解凍

將稀釋好的精液置于4 ℃冰箱中緩慢降溫，1.5 h后在4 ℃條件下分裝至0.25 mL細(xì)管中平衡2 h，然后在距液氮面4 cm處熏蒸10 min，熏蒸結(jié)束后迅速將細(xì)管投入液氮中冷凍保存.2周后取出冷凍細(xì)管，39 ℃水浴解凍20 s，然后進(jìn)行相關(guān)檢測(cè).

1.7 精液品質(zhì)檢測(cè)

(1) 精子常規(guī)指標(biāo)：細(xì)管凍精解凍后，利用計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)檢測(cè)精子活力；使用姬姆薩染料對(duì)精子進(jìn)行染色后鏡檢，檢測(cè)精子頂體完整率.檢測(cè)全程須避光操作.

(2) 精子生化指標(biāo)：使用相應(yīng)的試劑盒對(duì)凍精解凍后精漿中的GSH、MDA進(jìn)行檢測(cè)，其中GSH檢測(cè)依據(jù)二硫代二硝基甲酸比色法，比色波長(zhǎng)為420 nm；MDA檢測(cè)依據(jù)硫代巴比妥酸比色法原理，比色波長(zhǎng)為532 nm.以上檢測(cè)的相關(guān)操作嚴(yán)格按照南京建成生物工作有限公司試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行.

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)經(jīng)Excel軟件整理，然后用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對(duì)湖羊精液冷凍解凍后精子活力的影響

由圖1可知，在冷凍稀釋液中添加20 mg/mL褪黑素，試驗(yàn)2組得出的結(jié)果是：湖羊凍精解凍后的精子活力最高，為0.432，顯著高于對(duì)照組的0.395(P<0.05)；試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組得出的結(jié)果是：湖羊凍精解凍后精子活力與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05).

2.2 褪黑素對(duì)湖羊精液冷凍解凍后精子頂體完整率的影響

由圖2可知，冷凍稀釋液中添加20 mg/mL的褪黑素后，試驗(yàn)2組得出的結(jié)果是：湖羊精液冷凍解凍后精子頂體完整率最高，為0.512，極顯著高于對(duì)照組、試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組(P<0.01)；對(duì)照組、試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組得出的結(jié)果是：湖羊精液冷凍解凍后各組精子的頂體完整率差異不顯著(P>0.05).

2.3 褪黑素對(duì)湖羊精液冷凍解凍后精漿中MDA含量的影響

由圖3可知，湖羊精液冷凍解凍后各組精漿中的MDA含量存在極顯著差異(P<0.01)，添加褪黑素各試驗(yàn)組精漿中的MDA含量極顯著低于對(duì)照組，為1 082 nmol/L(P<0.01)，且試驗(yàn)2組精漿中的MDA含量最低，極顯著低于試驗(yàn)1組和3組(P<0.01).

2.4 褪黑素對(duì)湖羊精液冷凍解凍后精漿中GSH含量的影響

由圖4可知，湖羊精液凍精解凍后，各組精漿中GSH含量存在極顯著差異(P<0.01)，試驗(yàn)2組精漿中GSH含量最高，為167.5 μmol/L，極顯著高于對(duì)照組、試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組(P<0.01)，且試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組精漿中的GSH含量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01).

3 討 論

3.1 褪黑素對(duì)精子活力的影響

在動(dòng)物精液的冷凍保存過(guò)程中，精液的稀釋、冷凍、解凍等處理不可避免地產(chǎn)生包括活性氧(ROS)在內(nèi)的各種自由基[7]，對(duì)精子結(jié)構(gòu)和遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性造成不可逆的損傷.研究表明，活性氧(ROS)是造成精子過(guò)氧化損傷最常見的因素[8]，其過(guò)氧化作用可引起精子膜結(jié)構(gòu)與功能的改變，還可引起精子線粒體和DNA損傷[9]，導(dǎo)致精子保存質(zhì)量急劇下降.線粒體是ROS形成的主要場(chǎng)所，ROS會(huì)導(dǎo)致電子傳遞鏈的中斷，從而降低精子活力，發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng).本研究中添加20 mg/mL褪黑素可顯著提高湖羊精液冷凍解凍后的精子活力，這可能與褪黑素是一種能清除ROS的外源性非酶抗氧化劑，對(duì)不同類型細(xì)胞都有抗氧化和抗凋亡作用[10-11]有關(guān).杜少銀等[12]、李博玲等[13]證實(shí)將褪黑素作為外源性抗氧化劑的補(bǔ)充物，可顯著減少豬精液稀釋保存過(guò)程中產(chǎn)生的ROS水平.梁嵐[14]發(fā)現(xiàn)低濃度褪黑素可以促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，從而使精子得以長(zhǎng)時(shí)間存活.在動(dòng)物精液保存的研究中Rodriguez-Osorio等[15]將10-3mol/L濃度的褪黑素添加到公羊精液冷凍擴(kuò)增劑中，發(fā)現(xiàn)可以提高精子的活力、運(yùn)動(dòng)參數(shù)、細(xì)胞內(nèi)ATP濃度和DNA完整性，明顯減輕低溫保存期間的精子損傷.王淑娟等[16]發(fā)現(xiàn)添加10-7mol/L褪黑素可提高公豬精子的運(yùn)動(dòng)性、活力、存活率、膜完整性和線粒體活性.李博玲等[13]發(fā)現(xiàn)0.25 mg/mL褪黑素可以顯著提高精子的活率、活力、線粒體活性和頂體完整性.本研究證實(shí)，合理濃度的褪黑素可顯著提高湖羊精液冷凍解凍后的精子活力.本研究中褪黑素的最適合濃度為20 mg/mL，這與宋博宇[17]的研究結(jié)果一致，但與絨山羊[3]、豬[4，13]、牛[1，18]中的最適合濃度不一致，這可能與品種和精液自身褪黑素基礎(chǔ)量不同有關(guān).

3.2 褪黑素對(duì)精子頂體完整性的影響

在精子的保存過(guò)程中，精子頂體形態(tài)的完整性對(duì)精子能否成功授精起關(guān)鍵作用.研究表明，精子冷凍解凍后頂體完整性會(huì)顯著下降.解凍后精子質(zhì)膜的完整性對(duì)維持精子自身頂體反應(yīng)、獲能和新陳代謝等起著至關(guān)重要的作用，但質(zhì)膜在精子冷凍解凍過(guò)程中卻容易受到氧化損傷，精子質(zhì)膜脂質(zhì)過(guò)氧化會(huì)導(dǎo)致膜通透性增加，進(jìn)而影響精子抗凍能力[19].有關(guān)研究表明，稀釋液中添加褪黑素可以保護(hù)精子質(zhì)膜對(duì)抗環(huán)境的影響.López等[20]研究證實(shí)褪黑素能減少精子中堿性磷酸酶的流失，防止精子質(zhì)膜脂質(zhì)過(guò)氧化.Mayo等[21]發(fā)現(xiàn)在冷凍稀釋液中添加褪黑素會(huì)引起內(nèi)源性抗氧化酶活性的上調(diào)，減少冷凍解凍過(guò)程中產(chǎn)生的ROS，可有效保護(hù)頂體形態(tài)的完整性.張建瑞等[22]的研究證明，褪黑素可抑制ROS的活性以及NO的過(guò)度產(chǎn)生，對(duì)質(zhì)膜和頂體具有保護(hù)功能.Martm-Hidalgo等[23]的研究證實(shí)，褪黑素可保護(hù)線粒體并抑制質(zhì)膜的過(guò)氧化反應(yīng).本研究也證實(shí)，添加20 mg/mL褪黑素可極顯著提高湖羊精子解凍后的頂體完整率，這與在絨山羊[3]、豬[4，12-13]、牛[1，18]身上取得的試驗(yàn)結(jié)果基本一致.

3.3 褪黑素對(duì)精漿中GSH和MDA含量的影響

精漿、精子內(nèi)具有一定的抗精子脂質(zhì)過(guò)氧化物質(zhì)，此種物質(zhì)又被稱為精液抗氧化系統(tǒng).精子抗氧化系統(tǒng)中的成分主要有：超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、維生素E和輔酶Q10等.這些物質(zhì)可以清除ROS等.相關(guān)研究表明，褪黑素不僅具有抗精子膜多聚不飽和脂肪酸過(guò)氧化損傷的保護(hù)性功能，也可激活或增強(qiáng)過(guò)氧化歧化酶和GSH過(guò)氧化物酶的抗氧化酶活性，間接發(fā)揮抗氧化作用[24-25].李博玲等[13]的研究證實(shí)，在豬冷凍稀釋液中添加0.25 mg/mL褪黑素可以顯著降低冷凍后精子的ROS含量，顯著提升GSH的抗氧化效能.霍敏等[3]的研究證實(shí)，在絨山羊冷凍稀釋液中添加褪黑素可降低ROS水平，減少冷凍保存后精子受到的氧化損傷.本研究證實(shí)，在湖羊精液冷凍稀釋液中添加20 mg/mL褪黑素，精漿中的GSH含量顯著增加，說(shuō)明GSH過(guò)氧化物酶活性顯著增強(qiáng)，系統(tǒng)的整體抗氧化性顯著提高.

由于ROS攻擊精細(xì)胞質(zhì)膜引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，從而產(chǎn)生MDA等脂質(zhì)過(guò)氧化物，而ROS等會(huì)對(duì)精子造成過(guò)度的氧化損傷，導(dǎo)致精子的運(yùn)動(dòng)能力和受精能力下降.任俊玲等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度可根據(jù)MDA的濃度判斷，濃度越高，精子中氧自由基代謝程度越強(qiáng)烈，表明精子質(zhì)量越差.本研究發(fā)現(xiàn)，添加20 mg/mL褪黑素，試驗(yàn)2組在凍精解凍后精漿中的MDA含量極顯著降低，間接地證實(shí)了精漿中的ROS水平降低，且對(duì)精子的抗氧化損傷減輕.

4 結(jié) 論

在冷凍稀釋液中添加20 mg/mL褪黑素能顯著提高湖羊精液冷凍保存的效果.褪黑素可通過(guò)提高GSH抗氧化活性和減輕冷凍解凍過(guò)程中精子受氧化損傷來(lái)提高精子的活力和頂體完整性.