線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜在腸缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展

丁可，孫濤，潘銳，景祎馨，張貽幗，孟慶濤

武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，武漢430060

腸缺血再灌注損傷是由疾病、外科手術(shù)等多種原因?qū)е履c組織血供不足，并在恢復(fù)血供后損傷反而進(jìn)一步加重的病理生理過程。腸缺血后再灌注不僅可導(dǎo)致腸道結(jié)構(gòu)和功能改變，還會引起肝、肺、腎等遠(yuǎn)隔臟器損傷。腸缺血再灌注后腸上皮細(xì)胞經(jīng)歷缺氧—復(fù)氧過程，細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平增加，線粒體功能紊亂，三磷酸腺苷（ATP）產(chǎn)生不足，致使活性氧（ROS）在細(xì)胞內(nèi)積聚。此外，腸缺血再灌注后腸黏膜通透性增加，致使腸道內(nèi)的細(xì)菌或毒素進(jìn)入血液循環(huán)，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，甚至多器官功能障礙綜合征［1］。線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（MAM）是線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的動態(tài)結(jié)構(gòu)，可調(diào)節(jié)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。越來越多證據(jù)表明，MAM在能量產(chǎn)生、細(xì)胞收縮和運(yùn)動、細(xì)胞內(nèi)外信號傳遞中具有重要作用，能夠參與線粒體ROS產(chǎn)生和積聚、下游炎癥因子釋放、自噬調(diào)控、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及細(xì)胞程序性死亡等生物學(xué)過程［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，MAM參與的細(xì)胞事件和腸缺血再灌注后發(fā)生的細(xì)胞事件高度重合。因此，了解MAM在細(xì)胞內(nèi)的功能將為腸缺血再灌注損傷治療提供新的方向。本文結(jié)合文獻(xiàn)就MAM在腸缺血再灌注損傷中的研究進(jìn)展作一綜述。

1 MAM概述

SHORE等［3］通過電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共沉淀以及線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡之間的聯(lián)系緊密，提出了線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間存在密切的生物學(xué)調(diào)控機(jī)制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)信息交流的中轉(zhuǎn)站，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管是脂質(zhì)合成和信號傳導(dǎo)的主要區(qū)域。線粒體是細(xì)胞代謝和細(xì)胞程序性死亡等過程中必不可少的細(xì)胞器，線粒體變化可影響許多細(xì)胞事件的發(fā)生和發(fā)展。有研究證實(shí)，MAM是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體外膜的膜碎片構(gòu)成［4］。電子計算機(jī)斷層掃描顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體由在光滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大約10 nm處或粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大約25 nm處的系鏈相連［5］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)—線粒體系鏈結(jié)構(gòu)由多種蛋白質(zhì)構(gòu)成，如線粒體融合蛋白（Mfn）、1，4，5-三磷酸肌醇受體（IP3R）、電壓依賴性陰離子通道（VDAC）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75（GRP75）、酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51（PTPIP51）、囊泡膜相關(guān)蛋白B（VAPB）、PTEN誘導(dǎo)的假定激酶1（PINK1）等［6］。MAM是線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間形成的物理連接，其形態(tài)學(xué)和蛋白表達(dá)變化會影響線粒體的生物學(xué)功能，從而導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病或代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展［7］。

2 MAM中參與腸缺血再灌注損傷相關(guān)的蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)是機(jī)體內(nèi)各種生物學(xué)功能的直接執(zhí)行者。在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的MAM上存在或通過招募各種蛋白質(zhì)定位到MAM上，從而介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)或物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)［8］。MAM上的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體之間的物理連接中起直接作用，或調(diào)節(jié)MAM上的系鏈復(fù)合物間接調(diào)控生物學(xué)功能［6］。在MAM上參與腸缺血再灌注損傷的重要蛋白質(zhì)或蛋白 質(zhì) 結(jié) 構(gòu) 有IP3R-GRP75-VDAC、VAPB-PTPIP51、Mfn、FUNDC1、PINK1、BECN1。

2.1 IP3R-GRP75-VDAC 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)Ca2+的存儲場所，能夠通過釋放或回收Ca2+來響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)電刺激或化學(xué)刺激。Ca2+介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)有利于細(xì)胞對外界刺激做出快速反應(yīng)，從而維持自身的穩(wěn)態(tài)。線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的細(xì)胞器，Ca2+則是線粒體氧化呼吸鏈中多種酶的激動劑，能夠決定ATP的生成速度。IP3R是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ca2+通道，可介導(dǎo)Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上釋放至細(xì)胞質(zhì)和線粒體。VDAC是細(xì)胞內(nèi)最豐富的線粒體外膜通道，能夠調(diào)控代謝物進(jìn)入和流出線粒體，從而廣泛參與調(diào)節(jié)代謝物和ROS水平以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體之間的信號傳導(dǎo)。IP3R和VDAC一起介導(dǎo)Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放并轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體。VDAC和IP3R通過與GRP75相互作用，調(diào)節(jié)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的鈣平衡，這是維持線粒體生物能量所必需的［9］。細(xì)胞色素C在Bcl-2下游凋亡通路激活后從線粒體內(nèi)釋放，可與MAM上的IP3R結(jié)合，進(jìn)一步激活Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)，從而增強(qiáng)凋亡信號［10］。IP3R-GRP75-VDAC通過促進(jìn)線粒體Ca2+超載來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而抑制Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向線粒體轉(zhuǎn)移的拮抗劑能夠保護(hù)小鼠足細(xì)胞免于凋亡［11］。VDAC還能與Bcl-2家族的許多促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白相互作用，從而在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用［12］。VDAC開放還可引起Ca2+大量流入線粒體，使線粒體膜電位增加，從而引起線粒體ROS生成和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。在缺血和再灌注過程中，Ca2+超載和細(xì)胞凋亡是組織損傷的重要原因。腸缺血再灌注后，通過調(diào)控IP3R-GRP75-VDAC，能夠使Ca2+內(nèi)流減少，避免線粒體Ca2+超載、減少細(xì)胞內(nèi)ROS積聚，在一定程度上減輕腸缺血再灌注損傷。

2.2 VAPB-PTPIP51 VAPB是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，富集于MAM上。PTPIP51是一種氨基末端錨定的線粒體外膜蛋白。VAPB與PTPIP51相互作用可促進(jìn)IP3R/VDAC介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)—線粒體接觸傳遞Ca2+，對于維持線粒體內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)具有重要作用。MAM被證實(shí)是自噬小體生物發(fā)生的位點(diǎn)［13］。VAPB或PTPIP51缺失可導(dǎo)致IP3R/VDAC相互作用減少，從而影響線粒體Ca2+攝取，進(jìn)而刺激自噬發(fā)生［14］。敲除VAPB或PTPIP51可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)—線粒體系鏈結(jié)構(gòu)松弛，抑制線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的Ca2+交換，從而誘導(dǎo)自噬體形成；而VAPB或PTPIP51過表達(dá)則可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)—線粒體系鏈結(jié)構(gòu)更加緊密，MAM的空間距離減小，線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的Ca2+交換增加，從而抑制自噬體形成［14］。線粒體自噬是保護(hù)線粒體功能、維持細(xì)胞內(nèi)正常能量供應(yīng)的重要方式。腸缺血再灌注后細(xì)胞內(nèi)自噬水平紊亂，VAPB-PTPIP51通過調(diào)節(jié)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的距離，增加或減少自噬發(fā)生。此外，在siRNA沉默VAPB或PTPIP51的細(xì)胞中，使用人工系鏈可以抵消VAPB或PTPIP51沉默對細(xì)胞自噬的影響［14］。因此，通過影響VAPB-PTPIP51結(jié)構(gòu)來控制線粒體自噬水平，能夠保護(hù)或減輕腸缺血再灌注帶來的組織損傷。

2.3 Mfn 線粒體通過融合和分裂來維持細(xì)胞內(nèi)數(shù)量及能量平衡，這種線粒體動態(tài)平衡可影響細(xì)胞內(nèi)能量供應(yīng)和細(xì)胞分裂、凋亡以及自噬［15］。線粒體融合使線粒體之間交換一些組分，使有缺陷的線粒體重新獲得呼吸鏈和線粒體DNA的必需成分，從而使細(xì)胞免于凋亡并保護(hù)線粒體免于自噬。線粒體分裂可影響線粒體網(wǎng)絡(luò)的重塑和重排以及線粒體運(yùn)輸，促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及清除功能異常的線粒體。在哺乳動物中，線粒體外膜的融合依靠Mfn，線粒體內(nèi)膜的融合則由OPA1介導(dǎo)。Mfn包括Mfn1和Mfn2，二者均為線粒體外膜上的跨膜GTPases，它們在相鄰線粒體之間形成復(fù)合物并介導(dǎo)外膜融合［16］。Mfn1是線粒體融合的系鏈蛋白，可與OPA1相互作用，從而在線粒體融合中發(fā)揮重要作用［17］。GTP能夠觸發(fā)Mfn從折疊狀態(tài)至展開狀態(tài)，兩個線粒體上被GTP激活的Mfn相互靠近可形成反式二聚體結(jié)構(gòu)，從而使相對的線粒體外膜相互靠近，繼而完成線粒體融合［18］。Mfn可以穩(wěn)定相鄰線粒體之間的相互作用，調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)，穩(wěn)定線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間的相互聯(lián)系。在腸缺血再灌注后，線粒體功能紊亂，Mfn1促進(jìn)線粒體融合，以修復(fù)損傷的線粒體，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。Mfn2的活性受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Smad2和鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEF）、Ras Interactor 1（RIN1）的調(diào)控。Smad2是RIN1與Mfn2結(jié)合形成復(fù)合物的關(guān)鍵蛋白，Smad2-RIN1-Mfn2復(fù)合物使RIN1充當(dāng)Mfn2-GTPase活化的GEF，從而促進(jìn)線粒體融合［19］。Mfn2對線粒體至關(guān)重要，在細(xì)胞缺少能量，如缺血、缺氧時，能夠維持細(xì)胞存活［20］，是腸缺血再灌注后的保護(hù)性蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，Mfn2缺失可降低心肌細(xì)胞對缺血再灌注的反應(yīng)性死亡，從而降低了鈣依賴性線粒體通透性轉(zhuǎn)變（MPT）的可能性［21］。MPT是由線粒體通透性過渡孔（mPTP）介導(dǎo)的嚴(yán)格調(diào)控過程，而mPTP是一種高電導(dǎo)的鈣敏感性通道，在開放時會引起線粒體去極化和功能障礙。在缺血和再灌注期間，mPTP開放導(dǎo)致線粒體膜電位變化，從而影響線粒體ATP生成效率，而嚴(yán)重的組織損傷還可導(dǎo)致線粒體DNA（mtDNA）通過mPTP滲漏至細(xì)胞質(zhì)甚至血液，引起局部或全身炎癥反應(yīng)。因此，調(diào)控Mfn表達(dá)，穩(wěn)定線粒體網(wǎng)絡(luò)，減少mtDNA滲漏，能夠減輕腸缺血再灌注損傷。

2.4 FUNDC1 MAM不僅是線粒體自噬小體形成的位點(diǎn)，還是線粒體分裂的位點(diǎn)。FUNDC1是一種位于哺乳動物細(xì)胞線粒體外膜上的三跨膜蛋白。FUNDC1具有一個與LC3相互作用的區(qū)域（LIR），能夠通過與線粒體相互作用并招募LC3，從而介導(dǎo)局部缺血誘導(dǎo)的線粒體自噬。有研究發(fā)現(xiàn)，在缺血缺氧過程中FUNDC1會作為線粒體自噬受體在線粒體外膜上表達(dá)［22］。線粒體自噬是一種特殊的自噬形式，能夠選擇性地清除受損的線粒體，以應(yīng)對包括缺氧、ROS積聚和呼吸鏈抑制劑在內(nèi)的多種刺激［23］，在腸缺血再灌注后清除功能紊亂的線粒體，保證細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的合理利用和能量的正常供應(yīng)。FUNDC1能夠調(diào)節(jié)線粒體裂變和線粒體自噬，并介導(dǎo)跨雙膜的偶聯(lián)，以此進(jìn)行線粒體動力學(xué)和質(zhì)量控制［24］。線粒體在被吞噬體吞噬之前需要被碎片化，而線粒體碎片化是線粒體融合和分裂不平衡的結(jié)果。在缺血性腦卒中后添加外源性tPA會導(dǎo)致AMPK磷酸化和FUNDC1表達(dá)增加，隨后FUNDC1通過LIR與LC3結(jié)合，導(dǎo)致自噬雙層膜包裹線粒體，誘導(dǎo)線粒體自噬，從而起到神經(jīng)元保護(hù)作用［25］。腸缺血再灌注后，線粒體外膜上表達(dá)FUNDC1的數(shù)量決定了線粒體自噬程度，適度線粒體自噬能夠增加細(xì)胞對應(yīng)激的抗性，從而起到臟器保護(hù)作用。

2.5 PINK1 在線粒體自噬過程中，自噬體形成需要PINK1。PINK1編碼線粒體蛋白激酶，可調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)、運(yùn)輸功能以及線粒體內(nèi)Ca2+含量，影響復(fù)合體Ⅰ活性和ATP生成。PINK1和E3泛素連接酶Parkin在線粒體質(zhì)量控制中具有核心作用。當(dāng)氧化應(yīng)激、ROS積聚或藥物攝入等原因?qū)е戮€粒體膜電位受損時，PINK1會在線粒體外膜上穩(wěn)定表達(dá)，招募Parkin、泛素化蛋白和自噬配體蛋白p62向受損線粒體聚集，促使線粒體自噬發(fā)生［26］。同樣，在使用線粒體解偶聯(lián)劑后亦能觀察到PINK1選擇性地積聚在去極化的線粒體上，促進(jìn)PARK2移位至線粒體，從而促進(jìn)線粒體自噬進(jìn)程。此外，線粒體自噬還能通過PINK1-PRKN依賴性和非依賴性途徑啟動［27］。膜電位受損是腸缺血再灌注后常見的細(xì)胞損傷，及時清除膜電位異常的線粒體，增加正常線粒體比例，保持線粒體網(wǎng)絡(luò)平衡，能夠有效減輕腸缺血再灌注損傷。

2.6 BECN1 BECN1是Ⅲ類磷脂酰肌醇3激酶（Ptdlns3K）復(fù)合物的關(guān)鍵成分，是自噬體成核和歐米伽體形成所必需的。在饑餓誘導(dǎo)的自噬中，能夠觀察到Ptdlns3K復(fù)合體定位于MAM。PARK2能夠被BECN1招募，重新定位于線粒體上，從而誘導(dǎo)線粒體外膜泛素化和蛋白酶體降解，抑制功能障礙的線粒體融合和運(yùn)輸。同時，PARK2在被BECN1重新定位后可以使線粒體通過特異性泛素結(jié)合受體蛋白與自噬體膜相關(guān)聯(lián)，隨后與自噬體膜融合，從而完成線粒體自噬過程［27］。BECN1是線粒體自噬過程中必不可少的蛋白質(zhì)，在BECN1不存在的情況下，PARK2的招募和蛋白酶體介導(dǎo)的線粒體外膜蛋白降解無法有效進(jìn)行［28］。BECN1是線粒體自噬的關(guān)鍵蛋白，可選擇性清除功能障礙的線粒體，在腸缺血再灌注后細(xì)胞自我修復(fù)中起到關(guān)鍵作用。

3 MAM作為腸缺血再灌注損傷潛在的治療靶點(diǎn)

目前，應(yīng)對腸缺血再灌注損傷最有效的手段是及時恢復(fù)缺血部位腸道血供。再灌注雖然可以使腸道恢復(fù)血供，但血流再通后誘發(fā)的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、自噬以及線粒體動力學(xué)改變，會進(jìn)一步加重包括腸道在內(nèi)的多個器官功能損傷。線粒體Ca2+超載、氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡、蛋白質(zhì)錯誤折疊會使線粒體膜通透性改變，線粒體功能障礙、mtDNA漏出，使缺血再灌注后腸道細(xì)胞ATP生成減少；mtDNA漏出可激活cGAS-STING通路，從而增強(qiáng)白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步加重細(xì)胞損傷，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征。抑制MAM上的IP3R或VDAC可通過依賴AMPK的機(jī)制誘導(dǎo)自噬，清除受損的線粒體。IP3R-GRP75-VDAC和VAPB-PTPIP51能夠直接影響線粒體內(nèi)Ca2+含量，在腸缺血再灌注損傷前抑制VAPB-PTPIP51可降低腸缺血再灌注損傷后線粒體Ca2+超載的概率，減少Ca2+導(dǎo)致的線粒體自噬。調(diào)控Mfn的功能可以影響線粒體分裂和融合，控制細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量和質(zhì)量，從而滿足細(xì)胞的能量需求，清除功能障礙的線粒體，減少mtDNA滲漏，減輕腸缺血再灌注損傷后的炎癥反應(yīng)，降低全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征的發(fā)生率。FUNDC1、PINK1和BECN1是負(fù)責(zé)線粒體自噬的關(guān)鍵蛋白，自噬不足和過度自噬均為組織損傷發(fā)生的重要因素，適當(dāng)增加或抑制這些MAM上的關(guān)鍵蛋白可以調(diào)控線粒體自噬在一個適當(dāng)?shù)乃?，起到腸缺血再灌注損傷后的臟器保護(hù)作用。

綜上所述，MAM上的關(guān)鍵蛋白IP3R-GRP75-VDAC、VAPB-PTPIP51、Mfn、FUNDC1、PINK1、BECN1等，能夠參與Ca2+信號傳導(dǎo)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移、線粒體網(wǎng)絡(luò)動態(tài)變化、線粒體自噬、線粒體膜孔道開放和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)等。腸缺血再灌注后，腸道細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破，Ca2+失衡、脂質(zhì)氧化、線粒體網(wǎng)絡(luò)失衡，自噬紊亂、線粒體膜孔道開放以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生等。MAM調(diào)控的線粒體事件與腸缺血再灌注后的病理生理變化高度重合。因此，通過調(diào)控MAM上蛋白表達(dá)變化，能夠減輕細(xì)胞缺血、缺氧引起的氧化應(yīng)激，增加細(xì)胞對線粒體功能的保護(hù)，從而減輕腸缺血再灌注損傷，降低患者死亡率。