飼用抗菌肽的生物學(xué)功能及在斷奶仔豬和肉雞上的應(yīng)用研究進展

■劉作華 蘇國旗黃金秀 楊飛云

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 406420）

抗生素耐藥性（AMR）是指微生物對原本敏感的抗生素產(chǎn)生高度耐受的特性，通常通過基因改變自然發(fā)生，人、動物、植物和環(huán)境中都存在抗生素耐藥生物[1]。畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中過度使用抗生素會加劇AMR產(chǎn)生，為了控制AMR惡化與蔓延，歐美各國先后出臺相關(guān)政策禁止在飼料中使用抗生素，我國也從2020年7月1日起全面實施飼料禁抗。雖然飼料禁抗能直接減少飼用抗生素的用量，但隨之會帶來畜禽生長速度變慢，發(fā)病率和死亡率增加，同時導(dǎo)致治療用抗生素的用量增加。因此，尋找新型安全、高效的促生長飼料添加劑，是當前世界各國研究的熱點。抗菌肽（AMP）是生物體固有免疫的重要組成部分，廣泛存在于自然界各種生物體中，具有抗細菌、真菌、病毒和寄生蟲等活性，主要機制是破壞病原微生物的細胞膜，因此不易產(chǎn)生AMR，已經(jīng)成為農(nóng)學(xué)、微生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點之一，應(yīng)用前景十分廣泛。大量研究表明，畜禽飼糧中添加AMP具有促進生長、增加腸道健康和提高免疫力等功能[2-4]。文章綜述了AMP的特性、生物學(xué)功能及在斷奶仔豬和肉雞上的應(yīng)用效果，為飼用抗菌肽的合理研發(fā)與科學(xué)應(yīng)用提供參考。

1 抗菌肽的特性

自20世紀80年代發(fā)現(xiàn)天蠶素（cecropins A和B）以來，目前已有數(shù)千種AMP被發(fā)現(xiàn)和鑒定，廣泛存在于古生菌、原生生物、細菌、病毒、植物和動物等生物體中，是機體免疫系統(tǒng)的第一道防線[5]。AMP雖種類繁多，但存在一些共同特點。AMP通常是由核糖體合成的無活性前肽，再加工成10～50個氨基酸殘基組成的具有活性的成熟肽。成熟的AMP通常含有大量的陽離子殘基，在中性條件下帶正電荷。此外，AMP還具有高比例的疏水氨基酸，有助于AMP折疊成為具有兩親性的二級結(jié)構(gòu)，疏水殘基位于AMP分子一側(cè)，陽離子和極性殘基位于分子的另一側(cè)。AMP具有α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲、環(huán)化等多種結(jié)構(gòu)形式[6]。一些分子量較大的AMP主要通過分子內(nèi)二硫鍵或肽主鏈的環(huán)化來形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。不同AMP的活性不盡相同，主要是通過抑制細胞膜形成或破壞細胞膜的完整性來抑殺病原微生物，所以AMP不易產(chǎn)生耐藥性。

2 抗菌肽的生物學(xué)功能

2.1 抗細菌

抗菌活性是AMP最基本的功能之一。許多AMP對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有抑殺活性，如蜂毒素[7]、蛙皮素[8]、天蠶素[9]和抗菌肽 LL-37[10]。AMP 能夠抑殺細菌，是因為它們帶有陽離子，對革蘭氏陽性細菌的磷壁酸、脂壁酸及革蘭氏陰性細菌的脂多糖（LPS）具有靜電吸引，使微生物外膜不穩(wěn)定，引起細胞膜遷移，破壞細胞膜的完整性，最終導(dǎo)致細菌裂解死亡。大多數(shù)AMP可與細菌細胞膜相互作用，其作用機制主要有9種模式：①電穿孔；②地毯模型；③膜變薄或增厚；④非溶解膜去極化；⑤環(huán)形孔；⑥氧化脂質(zhì)靶向；⑦桶形壁；⑧無序環(huán)形孔；⑨非雙層中間體[11]。除膜滲透作用外，AMP還可以通過靶向細胞內(nèi)容物來抑制轉(zhuǎn)錄、翻譯或其他過程，也可以通過抑制肽聚糖、脂多糖或其他生物合成途徑中的前體或中間體的生成，以干擾細胞壁的合成及細菌增殖，從而起到抑殺細菌的作用[12]。

2.2 抗真菌

人們迄今已發(fā)現(xiàn)399種真菌威脅人類健康，有些藥物雖對真菌有抑殺功能，但僅對少數(shù)特定的分子靶點起作用，且容易產(chǎn)生AMR[13]。近年的研究表明，一些AMP具有抗真菌活性，多肽PAF26及其衍生物主要通過能量依賴的內(nèi)吞作用發(fā)揮抗真菌活性[14]。Astacidin 1是一種從小龍蝦血色素中分離得到的AMP，對白色念珠菌、毛孢子菌、秕糠馬拉癬菌和紅色毛癬菌具有較強的抑殺活性[15]。另外，14-螺旋疏水β多肽也能阻止白色念珠菌、光滑念珠菌、附毛念珠菌和熱帶念珠菌生物膜的形成[16]。膜滲透是大多數(shù)抗真菌多肽的主要作用機制，AMP可直接與真菌細胞膜上的受體結(jié)合，干擾細胞壁合成；也可進入細胞質(zhì)，引起線粒體耗損，最終殺死真菌[16]。此外，一些抗真菌多肽還可與白念珠菌基因組DNA相互作用，誘導(dǎo)細胞周期在S期停滯[17]，也可以通過活性氧（ROS）的產(chǎn)生誘導(dǎo)酵母細胞凋亡[18]。

2.3 抗病毒

許多AMP都具有抑制多種病毒感染的能力，包括由包膜RNA和DNA病毒、貓杯狀病毒和?？刹《疽鸬母腥綶19]。α-螺旋多肽如蜂毒素、蛙皮素和皮抑菌肽，具有高效的抗單純皰疹病毒活性[20]。其中，蜂毒素能抑制病毒的種類很多，包括柯薩奇病毒、腸道病毒、甲型流感病毒、人類免疫缺陷病毒、單純皰疹病毒、胡寧（Junín）病毒、呼吸道合胞病毒、水皰性口炎病毒和煙草花葉病毒等[21]。此外，一些β-折疊多肽如防御素、鱟素、蛋白整合素（protegrins）和β轉(zhuǎn)角多肽乳鐵蛋白，也表現(xiàn)出對單純皰疹病毒的高活性[12,22]。防御素是一種天然免疫系統(tǒng)的效應(yīng)成分，具有廣泛的抗病毒活性，其抗病毒機制除抑制病毒融合和進入后中和外，還能直接作用于病毒包膜、糖蛋白和核衣殼，結(jié)合宿主細胞表面受體和調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)等間接抑制病毒復(fù)制。此外，防御素還可作為趨化因子改變適應(yīng)性免疫反應(yīng)，間接抗病毒[23]。

2.4 抗寄生蟲

寄生性原生蟲病每年在全世界造成數(shù)百萬人死亡，特別在熱帶地區(qū)超過30億人受到瘧疾感染的威脅。蜂毒素、天蠶素、馬痘苗素、牛骨髓抗菌肽18、牛抗菌肽BMAP-27和蛋白整合素（PG 1）等都具有良好的抗寄生蟲活性[24]，AMP抗寄生蟲活性與寄生蟲的發(fā)育階段無關(guān)[25]。ParaPep是一個收錄抗寄生蟲多肽的數(shù)據(jù)庫，收錄的大多數(shù)AMP對不同種類的瘧原蟲、利什曼原蟲和錐蟲都具有抑制生長的活性[26]。AMP具有多種抗寄生蟲的機制，但主要是破壞細胞膜[25]。

2.5 免疫調(diào)節(jié)

許多AMP在體外適宜條件下具有良好的抗菌活性，而在動物體內(nèi)，受生理濃度的單價和二價陽離子、陰離子、血清或大分子物質(zhì)的影響，其抗菌活性往往被抑制[27]。然而，AMP可以選擇性地調(diào)節(jié)宿主免疫功能，促進機體抗微生物感染的能力[27]。研究表明AMP免疫調(diào)節(jié)功能主要表現(xiàn)為：①抗內(nèi)毒素活性；②作為疫苗佐劑；③促進肥大細胞脫顆粒；④促進傷口修復(fù)；⑤誘導(dǎo)免疫細胞分化；⑥抑制促炎因子如TNF-α；⑦激活和招募巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞、T細胞；⑧促進血管生成；⑨中和巨噬細胞和單核細胞釋放的促炎細胞因子[27]。AMP通過結(jié)合蛋白分子發(fā)揮免疫活性。胞壁二肽MDP和GMDP是從入侵細菌的細胞壁釋放出的有效的佐劑和免疫刺激器，可以通過特異性結(jié)合YB1（Y-box protein 1）發(fā)揮免疫活性，而YB1是胞漿蛋白在細胞核、細胞質(zhì)、細胞膜和胞外環(huán)境之間循環(huán)的一類特殊蛋白質(zhì)[28]。此外，乳鐵蛋白20（LFP 20）可以通過MyD88/NF-κB和MyD88/MAPK信號通路來降低LPS誘導(dǎo)的促炎因子釋放[29]。

3 抗菌肽在斷奶仔豬和肉雞上的應(yīng)用

抗生素在畜牧產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用已有50多年的歷史，促進了畜禽養(yǎng)殖的生產(chǎn)效率提升，但長期或超量使用也造成耐藥菌株和動物性食品殘留等問題[30]。歐美國家和我國先后禁止在畜禽飼料中使用促生長類藥物飼料添加劑。為了應(yīng)對飼料禁抗帶來的負面影響，迫切需要探求新的促生長策略。AMP具有在畜禽養(yǎng)殖中應(yīng)用的巨大潛力，因為它們可以提高生產(chǎn)性能、促進腸道健康和增強免疫功能。下面將著重闡述AMP在斷奶仔豬和肉雞上的應(yīng)用效果。

3.1 斷奶仔豬

仔豬斷奶是生豬養(yǎng)殖過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，斷奶應(yīng)激通常會導(dǎo)致飼料利用率下降、生長受阻、腹瀉率增加，甚至出現(xiàn)死亡。AMP因具有抗微生物活性和免疫調(diào)節(jié)功能而被廣泛研究用于斷奶仔豬飼糧中，以期達到促進生長和提高免疫的效果。研究表明，大腸桿菌素、小菌素J25（Microcin J25）、天蠶素A（cecropin AD）、防御素和人工合成AMP在斷奶仔豬飼糧中添加0.5～400 mg/kg，獲得良好的促生長效果，提高體增重4%～40%、平均日增重7%～53%、飼料轉(zhuǎn)化效率3%～18%，降低腹瀉率2%～46%[31-36]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌素、Microcin J25和cecropin AD等AMP能降低腸道大腸桿菌數(shù)量，增加乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量[32-33，36-37]，提示AMP能通過改善腸道微生態(tài)平衡，促進斷奶仔豬腸道健康。腸道結(jié)構(gòu)的完整性是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和腸道健康的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，cecropin AD和防御素能增加斷奶仔豬小腸絨毛高度，降低隱窩深度，維護腸道屏障完整性[34-35]。同時，Microcin J25和人工合成AMP還能夠降低血清、腸道中炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6等含量，增加免疫球蛋白SIgA和IgG表達[33，36]。以上表明，AMP對斷奶仔豬不僅具有促生長作用，還能通過調(diào)節(jié)腸道微生物平衡、維持腸道屏障完整性和調(diào)節(jié)機體炎癥反應(yīng)等多方面提高機體免疫力。

3.2 肉雞

現(xiàn)代規(guī)?；B(yǎng)殖的肉雞品種因生長速度快而抗病力差。研究發(fā)現(xiàn)蛙皮素尼生素（nisin）、駱駝乳鐵蛋白“36”、駱駝乳鐵蛋白（chimera）、兔防御素NP-1、Sublancin、天蠶素、抗菌肽A3和P5、菌絲霉素、MccJ25、Piscidins和神經(jīng)毒素Ctx（Ile21）-Ha等AMP能提高肉雞生長性能和免疫力[38-42]。Zhang等[39]在肉雞飼糧中添加菌絲霉素，使均平日增重和飼料轉(zhuǎn)化效率分別提高17%和20%。肉雞在幼雛階段免疫抵抗力差，死亡率高，而飼糧添加20 mg/kg或40 mg/kg神經(jīng)毒素Ctx（Ile21）-Ha能抑制腸炎鏈球菌和鼠傷寒鏈球菌的感染，降低雛雞死亡率[38]。肉雞生長周期短，營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和腸道健康水平直接影響著肉雞生長性能和經(jīng)濟效益。Ma等[43]研究表明，飼糧中添加100 mg/kg或200 mg/kg的菌絲霉素能提高十二指腸脂肪酶和胰蛋白酶的活性，促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，改善腸道形態(tài)，促進腸道健康。菌絲霉素和MccJ25還能降低腸道內(nèi)病原菌大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量，維持腸道微生物平衡[39-40]。研究還發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加菌絲霉素可提高21日齡和35日齡黃羽肉雞H9N2禽流感病毒和新城疫病毒抗體水平，降低回腸大腸桿菌數(shù)量，抑制回腸中促炎細胞因子表達[39]。MccJ25能降低肉雞血液中促炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度[40]，Piscidins能增加血液中抗炎因子IL-10和IFN-γ的含量[41]。因此，AMP在促進肉雞生長的同時還能提高機體免疫力。

最近，Sholikin等[44]系統(tǒng)分析了29項AMP在肉雞上的應(yīng)用試驗，發(fā)現(xiàn)AMP添加水平對肉雞體重、平均日增重和飼料轉(zhuǎn)化系數(shù)的影響呈二次曲線關(guān)系，死亡率呈線性降低，代謝能呈線性增加，十二指腸絨毛高度、絨隱比呈線性增加，隱窩深度呈線性降低，空腸黏膜厚度呈二次曲線變化，隱窩深度呈線性下降。添加AMP可降低回腸中大腸菌群和總需氧菌的數(shù)量、盲腸中梭菌和大腸桿菌數(shù)量以及糞便中梭狀芽孢桿菌數(shù)量。而且，飼喂AMP使肉雞IgM、T細胞分化抗原4（CD4）、新城疫抗體滴度、法氏囊指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均顯著升高，超氧化物歧化酶活性有升高的趨勢[45]。類比分析表明，AMP對肉雞生產(chǎn)性能的影響與抗生素相當，較空白對照組有明顯的改善?？梢?，AMP作為促生長劑可有效替代抗生素，提高肉雞生長性能、養(yǎng)分消化率、腸道健康和免疫功能。

4 展望

AMP不僅具有良好的抗微生物活性，還具有調(diào)節(jié)免疫、增強腸道健康和促進生長等功能，作為理想的飼用抗生素替代品在畜牧生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，AMP的應(yīng)用與推廣仍存在很多限制因素，主要包括：①損傷真核生物細胞膜，引起溶血副作用；②生產(chǎn)成本高；③容易被蛋白酶降解；④在動物胃腸道內(nèi)的穩(wěn)定性較差；⑤在某些血清和鐵存在的情況下，活性降低。因此，理想的AMP應(yīng)滿足以下特性：抗菌活性高、對哺乳動物膜毒性低、穩(wěn)定性好、低血清結(jié)合能力，且易于獲取和低成本生產(chǎn)。未來應(yīng)著重從鏈長、二級結(jié)構(gòu)、凈電荷、疏水性、兩親性五個方面進行AMP設(shè)計和改造，可以采用定點突變、從頭設(shè)計、基于模板設(shè)計、基于現(xiàn)有AMP組裝、化學(xué)修飾、計算機設(shè)計等方法，從源頭上解決AMP穩(wěn)定性、安全性和經(jīng)濟性的問題，也需進一步深入揭示AMP作用的基礎(chǔ)理論，為AMP合理開發(fā)與科學(xué)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。